培养基灭菌方法及其在L-氨基酸发酵生产中的应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体地说，涉及一种培养基灭菌方法及其在L-氨基酸发酵生产中的应用。

背景技术

L-苏氨酸、L-赖氨酸是人体必需氨基酸之一，也是畜牧、家禽、鱼类生长的必需氨基酸之一，均为四大饲料添加氨基酸，在生物良好发育和健康成长中起到重要作用。L-谷氨酸是生产味精的前体物质。目前L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸主要采用工业微生物发酵的方法进行生产，过程包括：制备培养基，制作种子，待种子生长至一定阶段，一定OD时，接入发酵培养，过程中补加各种所需物料如葡萄糖、液氨、通风、磷酸、有机氮源、维生素等以保持细菌的发酵活性，发酵结束后进行L-苏氨酸提取和精制。

传统的灭菌方式为高温121℃，pH7.0，灭菌20min，L-赖氨酸和L-精氨酸有很大损失，而且在L-氨基酸特别是L-苏氨酸发酵过程中，高浓度游离铵限制了细菌特别是大肠杆菌的生长和L-苏氨酸产量。

发明内容

本发明的目的是提供一种培养基灭菌方法及其在L-氨基酸发酵生产中的应用。

本发明另一的目的是提供L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸的发酵生产方法。

为了实现本发明目的，本发明采用一种高温低pH，高渗透压的灭菌方式，该方式温度115℃-121℃，时间10-20min，可有效解决营养损失大特别是L-精氨酸和L-赖氨酸损失问题、同时保证灭菌效率，可用于L-苏氨酸、L-谷氨酸，L-赖氨酸发酵，提高产量；同时，采用氢氧化钡流加控制游离铵，提高菌体的活性，提高氨基酸产量。

第一方面，本发明提供一种培养基灭菌方法，将配制好的培养基的渗透压调至800-1200osmol/kg(优选用水调节渗透压)，并控制pH为1-4(优选使用稀硫酸调节pH)，然后在115℃-121℃条件下灭菌10-20min。

所述培养基由玉米浆、豆粕水解液、葡萄糖和无机盐，加水配制而成。

本方法尤其适合含有复合氮源的培养基的灭菌工艺。

优选地，将配制好的培养基的渗透压调至1000osmol/kg，并控制pH为2，然后在118℃条件下灭菌15min。

所述培养基包括但不限于L-苏氨酸种子培养基、L-苏氨酸发酵培养基、L-赖氨酸种子培养基、L-赖氨酸发酵培养基、L-谷氨酸种子培养基和L-谷氨酸发酵培养基，各培养基配方如下：

L-苏氨酸种子培养基：玉米浆10-20g/L，豆粕水解液3-7g/L，葡萄糖20g/L，MgSO

L-苏氨酸发酵培养基：玉米浆3-7g/L，豆粕水解液3-7g/L，葡萄糖40g/L4.0％，MgSO

L-赖氨酸种子培养基：葡萄糖60g/L，(NH

L-赖氨酸发酵培养基：葡萄糖40g/L，(NH

L-谷氨酸种子培养基：葡萄糖40g/L，玉米浆25-35g/L，豆粕水解液10-20g/L，K

L-谷氨酸发酵培养基：葡萄糖50g/L，玉米浆50-70g/L，豆粕水解液20-40g/L，K

第二方面，本发明提供按照所述灭菌方法得到的培养基在L-氨基酸发酵生产中的应用。

第三方面，本发明提供一种L-苏氨酸的发酵生产方法，包括以下步骤：

(1)将L-苏氨酸种子培养基按照权利要求1-3任一项所述方法灭菌后加入种子罐中，装液量20L/50L，接入种子液200mL；培养条件：通气量0.8vvm，转速300rpm，控制pH7.0，温度37℃，溶氧20％；种子生长至OD

其中，所述种子液中产L-苏氨酸菌种的浓度为OD

(2)将L-苏氨酸发酵培养基按照权利要求3所述方法灭菌后加入发酵罐中，装液量16.5L/50L，取种子罐中的种子3.5L接入发酵罐中；发酵条件：0.5-0.8vvm，300-700rpm，控制pH7.0，温度37℃，溶氧20％，发酵周期30h；

(3)待发酵液中残糖量为0.05-0.15g/L开始流加碳源，并以25％的氨水作为流加氮源控制pH，同时使用氢氧化钡、氢氧化钠或氢氧化钾溶液作为pH辅助调节剂；具体地，以50％的葡萄糖溶液作为流加碳源；以25％的氨水作为流加氮源，同时结合1-5％氢氧化钡、氢氧化钠或氢氧化钾溶液控制发酵过程的pH7.0；发酵过程中发酵液中葡萄糖的浓度控制在0.05-0.15g/L，游离铵浓度控制在0.06％以下。

进一步地，步骤(3)中氢氧化钡、氢氧化钠或氢氧化钾溶液的添加量为发酵液体积的0.5-5％，优选1％。

第四方面，本发明提供一种L-赖氨酸的发酵生产方法，包括以下步骤：

(1)将L-赖氨酸种子培养基按照权利要求3所述方法灭菌后加入种子罐中，装液量20L/50L，接入种子液200mL；培养条件：通气量0.8vvm，转速300rpm，控制pH7.0，温度37℃，溶氧20％；种子生长至OD

其中，所述种子液中产L-赖氨酸菌种的浓度为OD

(2)将L-赖氨酸发酵培养基按照权利要求1-3任一项所述方法灭菌后加入发酵罐中，装液量16.5L/50L，取种子罐中的种子3.5L接入发酵罐中；发酵条件：通气量0.5-0.8vvm，300-700rpm，控制pH7.0，温度37℃，溶氧30％，发酵周期36h；

(3)待发酵液中残糖量为0.05-0.15g/L开始流加碳源，具体地，以50％的葡萄糖溶液作为流加碳源，以25％的氨水作为流加氮源同时控制发酵过程的pH7.0；发酵过程中发酵液中葡萄糖的浓度控制在0.05-0.15g/L。

大肠埃希氏菌(Escherichia coli)MHZ-0914现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.22648，保藏日期2021年6月1日。

第五方面，本发明提供一种L-谷氨酸的发酵生产方法，包括以下步骤：

(1)将L-谷氨酸种子培养基按照权利要求3所述方法灭菌后加入种子罐中，装液量20L/50L，接入种子液3.5L；培养条件：通气量0.8vvm，转速300rpm，控制pH7.0，温度32℃，溶氧20％；种子生长至OD

其中，所述种子液中产L-谷氨酸菌种的浓度为OD

(2)将L-谷氨酸发酵培养基按照权利要求1-3任一项所述方法灭菌后加入发酵罐中，装液量16.5L/50L，取种子罐中的种子3.5L接入发酵罐中；发酵条件：初始培养温度32℃，待培养至发酵液OD

(3)待发酵液中残糖量为0.05-0.15g/L开始流加碳源，具体地，以50％的葡萄糖溶液作为流加碳源，以25％的氨水作为流加氮源同时控制发酵过程的pH7.0；发酵过程中发酵液中葡萄糖的浓度控制在0.05-0.15g/L。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供一种培养基低pH高渗透压方式灭菌方法，采用该方式可有效灭菌，同时降低培养基中L-赖氨酸和L-精氨酸的损失。采用这种灭菌方式，可用于L-苏氨酸、L-谷氨酸，L-赖氨酸发酵，L-谷氨酸产量提高2.6g/L，转化率提高1.2％，L-赖氨酸产量提高3.8g/L，转化率提高1.5％。L-苏氨酸发酵过程中，培养基采用该方式灭菌，并在发酵控制中使用5％氢氧化钡作为发酵pH辅助调节剂，控制游离铵根离子浓度低于0.06％，该工艺提高了菌体的生长，L-苏氨酸产量提高5.6％，转化率提高3.8％。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中无菌平板划线培养结果；其中，左为新灭菌方式0h、15h、30h、45h无菌LB培养基平板，37℃培养24h以上，无杂菌斑出现；右为新灭菌方式60h、75h、90h、100h无菌LB培养基平板，37℃培养24h以上，无杂菌斑出现。

图2为本发明较佳实施例中L-苏基酸种子培养对比。

图3为本发明较佳实施例中L-苏基酸发酵对比。

图4为本发明较佳实施例中L-赖基酸种子培养对比。

图5为本发明较佳实施例中L-赖基酸发酵对比。

图6为本发明较佳实施例中L-谷基酸种子培养对比。

图7为本发明较佳实施例中L-谷基酸发酵对比。

具体实施方式

本发明提供一种微生物培养基灭菌方式，在一定pH、温度、渗透压下灭菌，有效灭菌并降低L-赖氨酸和L-精氨酸的损失，用于L-氨基酸发酵，可提高L-氨基酸产量和转化率。

本发明提供一种L-氨基酸过程调节pH方式，调节pH依靠流加1-5％氢氧化物进行，该方式可以控制其游离铵浓度0.06％以下。

进一步地，将种子中无机盐、玉米浆、水解液混溶，混合液渗透压达到800-1200osmol/kg，采用稀硫酸调节pH控制在1-4之间，优选pH2.0、渗透压调节至1000osmol/kg。

进一步地，发酵过程辅助控制pH所用氢氧化物，可以为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡，浓度1-5％，优选5％，氢氧化物添加量为发酵液体积的0.5-5％，优选1％。

该控制方法可用在L-氨基酸发酵中，特别是用在L-苏氨酸发酵中。

所述灭菌方式用于L-苏氨酸，L-赖氨酸，L-谷氨酸发酵，可提高L-苏氨酸，L-赖氨酸，L-谷氨酸产量和转化率。

本发明提供一种L-苏氨酸发酵调节pH的方式，该方式结合液氨或氨水，流加氢氧化钡溶液调节pH，该方式可以控制L-苏氨酸发酵液游离铵浓度0.06％以下。可以提高微生物活性，提高产酸和转化率。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1培养基灭菌方法

L-苏氨酸种子培养基：玉米浆15g/L，豆粕水解液5g/L，葡萄糖20g/L，MgSO

L-苏氨酸发酵培养基：玉米浆5g/L，豆粕水解液5g/L，葡萄糖40g/L，MgSO

L-赖氨酸种子培养基：葡萄糖60g/L，(NH

L-赖氨酸发酵培养基：葡萄糖40g/L，(NH

L-谷氨酸种子培养基：葡萄糖40g/L，玉米浆30g/L，豆粕水解液15g/L，K

L-谷氨酸发酵培养基：葡萄糖50g/L，玉米浆60g/L，豆粕水解液30g/L，K

用稀硫酸调节种子培养基和发酵培养基pH 2.0，加水调节渗透压1000osmol/kg，高压灭菌锅灭菌，温度118℃，时间15min。灭菌操作完毕后，加入无菌的种子培养基于发酵罐中，并加无菌水至16.5L。

从表1可以看出，本发明的灭菌方式，可降低培养基中L-赖氨酸和L-精氨酸的损失。

表1灭菌方式比较

注：常规灭菌方法为：121℃，pH7.0，灭菌20min。

采用本发明灭菌方法，将培养基接入发酵罐中空培，每15h取无菌样，100h发酵罐溶氧不下降，平板没有细菌生长(图1)。

苏氨酸种子培养基损失精氨酸降低9％，赖氨酸降低17.2％；

苏氨酸发酵培养基损失精氨酸降低15.4％，赖氨酸降低0％；

谷氨酸种子培养基损失精氨酸降低7.4％，赖氨酸降低11.5％；

谷氨酸发酵培养基损失精氨酸降低10.8％，赖氨酸降低12.3％；

赖氨酸种子培养基损失精氨酸降低11.1％，赖氨酸降低9.2％；

赖氨酸发酵培养基损失精氨酸降低10.3％，赖氨酸降低12.1％。

实施例2L-苏氨酸发酵生产方法

将已经灭菌的L-苏氨酸种子培养基加入无菌的种子罐50L中，加水调节种子培养基初定容至20L，接入种子液200mL。培养条件：通气量0.8vvm，转速300rpm，培养pH7.0，温度37℃，溶氧20％。种子生长至OD

其中，所述种子液中产L-苏氨酸菌种的浓度为OD

将已经灭菌的L-苏氨酸发酵培养基接入无菌的发酵罐50L中，加入无菌水定容16.5L；取种子罐中种子液3.5L接入发酵罐中。发酵过程控制条件：0.5-0.8vvm，300-700rpm，罐压0.07MPa，pH7.0，温度37℃，溶氧20％，发酵周期30h。

待发酵液中残糖量为0.1g/L开始流加碳源，氮源氨水作为pH调节剂控制pH7.0，配置50％的葡萄糖溶液作为流加碳源，利用25％的氨水作为流加氮源，灭菌的5％氢氧化钡/氢氧化钠作为pH辅助调节剂，发酵过程控制pH7.0，该方式可以控制其游离铵浓度0.06％以下。发酵过程中发酵液中葡萄糖的浓度控制在0.1g/L左右。

使用SBA生物传感仪测定葡萄糖含量，凯氏定氮仪测定游离铵含量，HPLC测定L-苏氨酸含量。

表2发酵结果表明，常规灭菌方式L-苏氨酸产量111.1g/L，转化率55.1％，新灭菌方式产量114.6g/L，转化率56.8％，氢氧化钠控制过程pH产量112.7g/L，转化率55.8％，氢氧化钡控制过程pH产量114.5g/L，转化率56.9％，新灭菌方式+氢氧化钡控制发酵过程pH产量116.7g/L，转化率58.9％，新灭菌方式+氢氧化钡控制发酵过程pH比常规方式L-苏氨酸高5.6g/L，转化率高3.8％，游离铵从0.07-0.1g/L降低至0.04-0.05g/L，细菌生长得到了改善(图2和图3)。

表2 L-苏氨酸发酵液游离铵根离子、L-苏氨酸检测和转化率计算

实施例3L-赖氨酸发酵生产方法

将已经灭菌的L-赖氨酸种子培养基加入无菌的种子罐50L中，加水调节种子初定容至16.5L，接入种子液200mL。培养条件：通气量0.8vvm，转速300rpm，培养pH7.0，温度37℃，溶氧20％。种子生长至OD

其中，所述种子液中产L-赖氨酸菌种的浓度为OD

将已经灭菌的L-赖氨酸发酵培养基接入无菌的发酵罐中50L，加入无菌水定容16.5L；取种子罐中种子液3.5L接入发酵罐中。

发酵培养：初始培养温度37℃，调节风量0.5-0.8vvm、转速300-700rpm和罐压0.07MPa，控制过程溶氧20％以上。配置50％的葡萄糖溶液作为碳源，利用25％的氨水作为氮源和pH调节剂，发酵过程控制pH7.0，温度37℃，溶氧30％，发酵周期36h。发酵过程中发酵液中葡萄糖的浓度控制在0.1g/L左右，游离铵浓度控制在0.06％以下。

使用SBA生物传感仪测定葡萄糖含量，凯氏定氮仪测定游离铵含量，HPLC测定L-赖氨酸含量。新灭菌方式放罐发酵液中L-赖氨酸196.3g/L，糖酸转化率70.1％，产酸较对比常规发酵L-赖氨酸产量192.5g/L提高了3.8％，转化率较常规发酵L-赖氨酸68.6％提高了1.5％，细菌生长得到了改善(表3，图4和图5)。

表3发酵液L-赖氨酸检测和转化率计算

实施例4L-谷氨酸发酵生产方法

将已经灭菌的L-谷氨酸种子培养基加入无菌的种子罐50L中，加水调节种子初定容至20L，接入种子液200mL。培养条件：通气量0.8vvm，转速300rpm，培养pH7.0，温度32℃，溶氧20％。种子生长至OD

其中，所述种子液中产L-谷氨酸菌种的浓度为OD

将已经灭菌的L-谷氨酸发酵培养基接入无菌的发酵罐中，加入无菌水定容16.5L；取种子罐中种子液3.5L接入发酵罐中50L，发酵培养：初始培养温度32℃，培养至发酵液OD

使用SBA生物传感仪测定葡萄糖含量，HPLC测定L-谷氨酸含量。新培养基灭菌方式放罐发酵液中L-谷氨酸205.7g/L，糖酸转化率67.5％，产酸常规发酵L-谷氨酸203.1g/L提高了2.6％，转化率较常规发酵L-谷氨酸66.3％提高了1.2％，细菌生长得到了改善(表4，图6和图7)。

表4发酵液L-谷氨酸检测和转化率计算

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。