针对内源逆转录病毒的逆转录阻断剂在制备溃疡性结肠炎治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及针对内源逆转录病毒的逆转录阻断剂在制备溃疡性结肠炎治疗药物中的应用。

背景技术

溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis)是一种由异常免疫介导的多因素慢性疾病，可导致复发性的肠道炎症，甚至可发展为肠癌。溃疡性结肠炎的病理特征为结肠远端向近端不同程度扩散的连续性黏膜炎症，伴随肠黏膜屏障的破坏、免疫系统的紊乱、复杂的炎症介质产生、广泛的浅表黏膜溃疡形成。溃疡性结肠炎的病程迁延反复，缓解期和发作期交替进行，严重危害患者健康，并给患者带来巨大的经济负担。近年来，溃疡性结肠炎的患病率在全球呈逐年上升趋势。

作为一种自身免疫性疾病，溃疡性结肠炎的病因和发病机制较为复杂，目前尚未明确阐明，但普遍认为溃疡性结肠炎是通过免疫、微生物、环境和遗传易感因素的共同作用而发展起来的。目前，针对溃疡性结肠炎的传统治疗药物主要包括氨基水杨酸盐、皮质类固醇和环孢菌素等。此外，基于单克隆抗体或融合蛋白、迁移抑制剂及新的细胞因子阻滞剂等生物疗法也被认为是具有前景的替代疗法。然而，临床上即使是靶向治疗药物(如抗TNFa生物类制剂)对溃疡性结肠炎的缓解率也仅20％-30％，且仍有15％的患者需通过直肠结肠切除术进行治疗。因此，研究溃疡性结肠炎的发病机制，发掘新的治疗靶点及药物，对于阻断溃疡性结肠炎的病程进展和改善预后具有重要的临床价值。

内源性逆转录病毒(endogenous retrovirus,ERVs)存在于所有脊椎动物的基因组中，其起源于生物进化过程中外源性逆转录病毒对宿主生殖细胞的感染和整合，代表了曾经具有传染性的外源性逆转录病毒的感染事件。ERVs在宿主基因组中存在多个拷贝，占据哺乳动物整个基因组的8％-10％。

齐多夫定(Zidovudine，AZT)是一种用于治疗艾滋病的药物，为一种胸苷类似物，能竞争性地阻止逆转录病毒(如HIV)逆转录为cDNA时的胸腺嘧啶核苷摄取，进而阻碍其逆转录活性。AZT的CAS号为30516-87-1。AZT的结构式见(Ⅰ)。

发明内容

本发明的目的是提供针对内源逆转录病毒(ERVs)的逆转录阻断剂在制备溃疡性结肠炎治疗药物中的应用。

本发明提供了针对内源逆转录病毒的逆转录阻断剂在制备用于结肠炎治疗药物中的应用。具体的，所述结肠炎为溃疡性结肠炎。所述应用中，针对内源逆转录病毒的逆转录阻断剂通过抑制内源逆转录病毒发挥针对结肠炎治疗功效。

本发明还提供了一种结肠炎药物，其活性成分包括针对内源逆转录病毒的逆转录阻断剂。具体的，所述结肠炎为溃疡性结肠炎。所述药物中，针对内源逆转录病毒的逆转录阻断剂通过抑制内源逆转录病毒发挥针对结肠炎治疗功效。

本发明还提供了内源逆转录病毒作为抑制靶点在开发结肠炎药物中的应用。具体的，所述结肠炎为溃疡性结肠炎。

本发明还提供了针对内源逆转录病毒的逆转录阻断剂在制备产品中的应用；所述产品的功能为：下调胞质DNA感受器通路所介导的天然免疫反应。

本发明还提供了针对内源逆转录病毒的逆转录阻断剂在制备产品中的应用；所述产品的功能为：阻断巨噬细胞向M1炎症型极化。

以上任一所述内源逆转录病毒可为MMTV(mouse mammary tumor virus)、MERVK-10C(mouse endogenous retrovirus K-10C)、IAP(intracisternal A-particle)、ETn(early transposon)、Line-1(long interspersed nuclear elements-1)或MERVL(mouseendogenous retrovirus L)。

具体的，以上任一所述针对内源逆转录病毒的逆转录阻断剂为齐多夫定(AZT)。

本发明的发明人发现ERVs可以作为一种新的溃疡性结肠炎治疗靶点。齐多夫定能够通过抑制ERVs的逆转录活性，下调胞质DNA感受器通路所介导的天然免疫反应，进而阻断巨噬细胞向M1炎症型极化，最终有效缓解了结肠炎的发病症状。因此，其可以作为一种治疗溃疡性结肠炎的新型药物。

本发明不仅揭示了治疗溃疡性结肠炎的新型靶点ERVs，也阐明了ERVs逆转录阻断剂AZT在治疗溃疡性结肠炎中的作用效果，具有重要的理论意义及应用价值。

附图说明

图1为实施例1的步骤二的结果。

图2为实施例1的步骤三的结果。

图3为实施例2中AZT对结肠炎小鼠体重的影响的相关结果。

图4为实施例2中AZT对小鼠疾病活动指数和结肠长度的影响的相关结果。

图5为实施例2中AZT对结肠炎小鼠结肠组织病理学的影响的相关结果。

图6为实施例2中qPCR检测小鼠结肠中ERVs的mRNA表达水平的相关结果。

图7为实施例2中Western Blot检测MERVL和Line-1的蛋白表达水平的结果。

图8为实施例2的步骤五的结果。

图9为实施例3中实时荧光定量PCR检测MERVL基因或Line-1基因以及WesternBlot检测MERVL和Line-1的结果。

图10为实施例3中免疫荧光检测细胞中MERVL水平的结果。

图11为实施例3的步骤三的结果。

图12为实施例3的步骤四的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。C57BL/6N小鼠：维通利华公司，品系代码为213。齐多夫定：阿拉丁生化科技公司产品，货号A122924。葡聚糖硫酸钠：翌圣生物产品，货号60316ES25。3％ DSS溶液：将葡聚糖硫酸钠溶于蒸馏水，并使其浓度为3g/100ml。

实施例1、溃疡性结肠炎小鼠结肠中ERVs的表达情况

一、溃疡性结肠炎小鼠模型构建(葡聚糖硫酸钠诱导)

20只8周龄C57BL/6N小鼠(雄性，20-24g)，适应性喂养一周，然后随机分为2组，每组10只。

模型组(DSS)：第1天至第7天，将3％ DSS溶液作为饮用水，自由饮用。

对照组(CON)：第1天至第7天，将蒸馏水作为饮用水，自由饮用。

第8天，颈椎脱臼法处死小鼠，取结肠。

二、实时荧光定量PCR检测ERVs在结肠中的表达情况

取步骤一获取的结肠组织，提取总RNA，反转录得到cDNA。以cDNA为模板，以GAPDH基因为内参基因，通过实时荧光定量PCR检测目标基因的相对表达水平。

目标基因分别为：MMTV(mouse mammary tumor virus)基因、MERVK-10C(mouseendogenous retrovirus K-10C)基因、IAP(intracisternal A-particle)基因、ETn(earlytransposon)基因、Line-1(long interspersed nuclear elements-1)基因或MERVL(mouseendogenous retrovirus L)基因。MMTV、MERVK-10C、IAP、ETn、Line-1和MERVL均属于ERVs家族。

用于PCR扩增目标基因以及内参基因的引物见表1。

表1

各个目标基因在结肠组织中的相对表达水平见图1。与CON组相比，DSS组各个目标基因的相对表达水平均显著增高。

三、免疫组织化学检测结肠中MERVL的蛋白丰度

1、结肠组织脱水和石蜡包埋

①从步骤一获得的结肠组织中取末端肠段，用预冷的PBS缓冲液冲洗，然后用4％多聚甲醛溶液4℃固定24小时。

②完成步骤①后，将肠段放入包埋盒中进行梯度脱水。梯度脱水的程序依次为：25％乙醇溶液、50％乙醇溶液、70％乙醇溶液、80％乙醇溶液、90％乙醇溶液、95％乙醇溶液、100％乙醇、100％乙醇，各1小时。

③完成步骤②后，用二甲苯浸泡肠段1小时，然后浸蜡1小时，然后进行石蜡包埋，得到石蜡组织块。

2、免疫组织化学染色

①取步骤1制备的石蜡组织块，制备4μM石蜡切片，置于60℃烘箱烘烤1小时。

②完成步骤①后，取石蜡切片，用二甲苯脱蜡10分钟，然后进行梯度乙醇处理。梯度乙醇处理的程序依次为：100％乙醇、95％乙醇溶液、90％乙醇溶液、80％乙醇溶液、70％乙醇溶液、50％乙醇溶液，各3分钟。

③完成步骤②后，取石蜡切片，用蒸馏水冲洗，然后置于柠檬酸抗原修复液中，先用微波炉高火档位煮沸3分钟，再低火档加热30分钟，然后自然冷却至室温。

④完成步骤③后，取石蜡切片，用PBS缓冲液冲洗3次。

⑤完成步骤④后，取石蜡切片，甩干水渍，然后滴加3％过氧化氢溶液并24℃避光孵育30分钟(灭活组织内源性过氧化物酶)，然后用PBST溶液清洗三次。

⑥完成步骤⑤后，取石蜡切片，滴加10％山羊血清溶液并24℃避光处理1小时(组织封闭)，然后用PBST溶液清洗三次。

⑦完成步骤⑥后，取石蜡切片，滴加一抗工作液，4℃孵育过夜，然后用PBST溶液清洗三次。一抗工作液：MERVL-Gag抗体稀释至200倍体积。MERVL-Gag抗体，全称为MuERVL-GagRabbit Polyclonal Antibody，碧云天公司产品，货号为AF0240。

⑧完成步骤⑦后，取石蜡切片，滴加二抗工作液，24℃避光孵育1小时，然后用PBST溶液清洗三次。二抗工作液：酶标二抗稀释至100倍体积。酶标二抗，全称为辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，碧云天公司产品，货号为A0208。

⑨完成步骤⑧后，取石蜡切片，滴加DAB染色液，3分钟后用自来水冲洗，然后滴加苏木素染液，5分钟后用自来水冲洗。

⑩完成步骤⑨后，取石蜡切片，进行梯度乙醇处理，然后用二甲苯浸泡10分钟，然后阴凉干燥并用中性树脂封片，然后在显微镜下观察。梯度乙醇处理的程序依次为：75％乙醇溶液、80％乙醇溶液、90％乙醇溶液、96％乙醇溶液、100％乙醇，各5分钟。

结果见图2。与CON组相比，DSS组MERVL蛋白丰度显著增高。

实施例1的结果表明，溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中ERVs的表达发生了显著上调，表明溃疡性结肠炎与ERVs的异常表达有关。

实施例2、AZT对溃疡性结肠炎的治疗作用

一、溃疡性结肠炎小鼠模型构建(葡聚糖硫酸钠诱导)

18只8周龄C57BL/6N小鼠(雄性，20-24g)，适应性喂养一周，然后随机分为3组，每组6只。

模型组(DSS)：第1天至第7天，将3％ DSS溶液作为饮用水，自由饮用。

对照组(CON)：第1天至第7天，将蒸馏水作为饮用水，自由饮用。

AZT挽救组(DSS+AZT)：第1天至第7天，将3％ DSS溶液作为饮用水自由饮用，每天每只小鼠腹腔给与100μl AZT水溶液(AZT的单次给药量为5mg/kg体重)。

第8天，颈椎脱臼法处死小鼠，取结肠。

二、小鼠结肠炎病理表现评估

1、AZT对结肠炎小鼠体重的影响

分组处理前(第0天)以及分组处理后的第1天至第8天，每天测量小鼠体重，结果见图3。DSS组小鼠在给药的第2天体重开始下降，到第8天，DSS组小鼠体重到达最低点。DSS+AZT组小鼠体重下降较DSS组小鼠较缓。与DSS组相比，DSS+AZT组小鼠体重下降幅度在第7、8天显著降低，且在第8天体重开始停止下降。

2、AZT对小鼠疾病活动指数和结肠长度的影响

疾病活动指数(DAI)评分标准见表2。以小鼠分组处理前(第0天)的体重为100％，记录分组处理后每天的体重，并计算体重减轻幅度，获得体重减轻对应分数。将三个指标的分数加和，即为DAI分数。结果见图4的A。DSS组小鼠在第3天开始大便发软，出现便血，至第8天实验结束，DSS组小鼠出现肉眼可见的血便，且精神不振，缩成一团。随着实验天数的增加，DSS组小鼠DAI评分较CON组小鼠明显升高。在实验第7、8天，DSS组DAI评分显著高于DSS+AZT组，且DSS+AZT组的DAI评分上升幅度显著低于DSS组。

表2DAI评分标准

步骤一处死小鼠后，测量结肠长度并拍照记录。结果见图4的B(左图为照片，右图为长度统计结果)。CON组小鼠结肠状态良好，肠道内粪便成颗粒状。与CON组小鼠相比，DSS组小鼠的结肠长度显著缩短，肠道壁变薄并伴有充血现象，肠道内粪便不成形。与DSS组小鼠相比，DSS+AZT组小鼠的结肠充血情况明显改善，且结肠长度增加，结肠形态接近CON组小鼠。

3、AZT对结肠炎小鼠结肠组织病理学的影响

结肠组织脱水和石蜡包埋同实施例1的步骤三的1。

①取石蜡组织块，制备4μM石蜡切片，置于60℃烘箱烘烤1小时。

②完成步骤①后，取石蜡切片，用二甲苯脱蜡10分钟，然后进行梯度乙醇处理。梯度乙醇处理的程序依次为：100％乙醇、95％乙醇溶液、90％乙醇溶液、80％乙醇溶液、70％乙醇溶液、50％乙醇溶液，各3分钟。

③完成步骤②后，将石蜡切片放入双蒸水中静置5分钟；重复一次。

④完成步骤③后，将石蜡切片浸于苏木精染液中静置5分钟，然后用自来水冲洗，洗去未附着染料。

⑤完成步骤④后，将石蜡切片浸于盐酸乙醇溶液中分化2秒，然后浸于氨水中浸润3秒。

⑥完成步骤⑤后，将石蜡切片浸于伊红染液中静置3分钟，然后用自来水冲洗，洗去未附着染料。

⑦完成步骤⑥后，取石蜡切片，进行梯度乙醇处理，然后用二甲苯浸泡10分钟，然后阴凉干燥并用中性树脂封片，然后在显微镜下观察。梯度乙醇处理的程序依次为：75％乙醇溶液、80％乙醇溶液、90％乙醇溶液、96％乙醇溶液、100％乙醇，各5分钟。

HE染色结果见图5。CON组小鼠的结肠黏膜排列整齐，组织腺体结构完整，无炎性细胞浸润。与CON组小鼠相比，DSS组小鼠结肠有大面积溃疡且延伸至粘膜下层，结肠隐窝结构破坏，杯状细胞大面积丢失，大量炎性细胞浸润并伴有水肿。与DSS组小鼠相比，DSS+AZT组小鼠结肠溃疡面降低，炎性细胞浸润减少，杯状细胞数量增加，腺体排列较整齐。结肠病理组织学评分标准见表3。共四个指标(慢性炎性浸润、固有层中性粒细胞浸润、上皮中性粒细胞浸润，糜烂或溃疡)，将四个指标的分数加和，即为DAI分数。DAI分数结果见图5。可见，DSS组小鼠的评分显著高于CON组小鼠，DSS+AZT组小鼠的评分显著低于DSS组小鼠。

表3

三、AZT对结肠炎小鼠结肠组织中ERVs表达的影响

1、qPCR检测小鼠结肠中ERVs的mRNA表达水平

取步骤一获取的结肠组织，提取总RNA，反转录得到cDNA。以cDNA为模板，以GAPDH基因为内参基因，通过实时荧光定量PCR检测目标基因的相对表达水平。

目标基因分别为：MERVL基因或Line-1基因。

用于PCR扩增目标基因以及内参基因的引物见表1。

结果见图6的A。与CON组小鼠相比，DSS组小鼠的MERVL和Line-1的mRNA水平均显著升高。与DSS组小鼠相比，DSS+AZT组小鼠的MERVL和Line-1的mRNA水平均显著降低。

2、Western Blot检测小鼠结肠中MERVL和Line-1的蛋白水平。

取步骤一获取的结肠组织，提取总蛋白，进行Western Blot检测。

Western Blot检测目标物为：MERVL和Line-1。内参蛋白为GAPDH。

检测MERVL时，采用的一抗为MERVL-Gag抗体。MERVL-Gag抗体，全称为MuERVL-GagRabbit Polyclonal Antibody，碧云天公司产品，货号为AF0240。

检测Line-1时，采用的一抗为重组Anti-LINE-1ORF1p抗体(Rabbit monoclonal)。重组Anti-LINE-1ORF1p抗体：Abcam公司，货号为ab216324。

采用的二抗均为：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)：碧云天公司，货号为A0208。

结果见图6的B。与CON组小鼠相比，DSS组小鼠的MERVL和Line-1蛋白丰度均显著升高。与DSS组小鼠相比，DSS+AZT组小鼠的MERVL和Line-1蛋白丰度显著降低。

3、免疫组织化学检测小鼠结肠中MERVL的蛋白表达情况

方法同实施例1的步骤三。

结果见图6的C。与CON组小鼠相比，DSS组小鼠结肠组织中MERVL蛋白显著增多。相比DSS组小鼠，DSS+AZT组小鼠的MERVL蛋白显著降低。CON组小鼠肠道杯状细胞数量充足，形态完整；DSS组小鼠肠道杯状细胞显著减少甚至消失，且形态破坏严重；DSS+AZT组小鼠肠道杯状细胞数量、形态较DSS组都有所改善。

四、AZT对结肠炎小鼠结肠组织中巨噬细胞标志物及促炎因子表达的影响

1、qPCR检测小鼠结肠中巨噬细胞标志物及促炎因子的mRNA表达水平

取步骤一获取的结肠组织，提取总RNA，反转录得到cDNA。以cDNA为模板，以GAPDH基因为内参基因，通过实时荧光定量PCR检测目标基因的相对表达水平。

目标基因分别为：结肠中炎性因子基因(IL-6基因、IL-1β基因及TNF-α基因)和促炎症M1型巨噬细胞标志物基因(iNOS基因)。

用于PCR扩增目标基因以及内参基因的引物见表4。

表4

结果见图7的A。与CON组小鼠相比，DSS组小鼠的IL-6、IL-1β、TNF-α及iNOS的mRNA水平均显著升高。与DSS组小鼠相比，DSS+AZT组小鼠的IL-6、IL-1β、TNF-α及iNOS的mRNA水平均显著降低。

2、酶联免疫吸附测定法检测小鼠血清中炎症因子含量

试验第8天处死小鼠前，尾静脉取血并收集血清。

分别使用小鼠IL-6ELISA Kit(ABclonal公司，货号RK00008)和小鼠IL-1βELISAKit(ABclonal公司，货号RK00006)检测血清中的IL-6含量和IL-1β含量。

结果见图7的B。DSS组小鼠血清中IL-6和IL-1β的含量均显著高于CON组小鼠。相比DSS组小鼠，DSS+AZT组小鼠血清中的IL-6和IL-1β水平均显著降低。

3、Western Blot检测小鼠结肠中的蛋白水平。

取步骤一获取的结肠组织，提取总蛋白，进行Western Blot检测。

Western Blot检测目标物为：巨噬细胞标记蛋白F4/80、炎性因子TNF-α及M1型巨噬细胞标志物蛋白iNOS。内参蛋白为GAPDH。

检测F4/80时，采用的一抗为兔抗F4/80抗体(Cell Signaling Technology，70076)

检测TNF-α时，采用的一抗为兔抗TNF-a抗体(碧云天，AF8208)。

检测iNOS时，采用的一抗为兔抗iNOS抗体(Servicebio，GB11119)。

采用的二抗均为：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)：碧云天公司，货号为A0208。

结果见图7的C。与CON组小鼠相比，DSS组小鼠的F4/80、TNF-α及iNOS的蛋白水平均显著升高。相比DSS组小鼠，DSS+AZT组小鼠的F4/80、TNF-α及iNOS蛋白水平均显著降低。

五、AZT对结肠炎小鼠结肠组织中cGAS/STING及NF-κB先天免疫通路的影响

1、qPCR检测小鼠结肠中cGAS/STING及NF-κB通路关键基因的mRNA表达水平

取步骤一获取的结肠组织，提取总RNA，反转录得到cDNA。以cDNA为模板，以GAPDH基因为内参基因，通过实时荧光定量PCR检测目标基因的相对表达水平。

目标基因分别为：胞质核酸感应通路的cGAS基因与STING基因。

用于PCR扩增目标基因以及内参基因的引物见表5。

表5

结果见图8的A。与CON组小鼠相比，DSS组小鼠的cGAS与STING的mRNA水平均显著升高。相比DSS组小鼠，DSS+AZT组小鼠的cGAS与STING的mRNA水平均显著降低。

2、Western Blot检测小鼠结肠中的蛋白水平。

取步骤一获取的结肠组织，提取总蛋白，进行Western Blot检测。

Western Blot检测目标物为：cGAS/STING及NF-κB通路关键蛋白。

内参蛋白为GAPDH。

检测cGAS时，采用的一抗为兔抗cGAS抗体(Huabio公司，货号为HA500023)。

检测STING时，采用的一抗为兔抗STING抗体(Zenbio公司，货号为300415)。

检测NF-κB时，采用的一抗为兔抗NF-κB p65抗体(Zenbio公司，货号为R25149)。

检测pNF-κB(磷酸化NF-κB)时，采用的一抗为兔抗Phospho-NF-κB p65抗体(Zenbio公司，货号为310013)。

采用的二抗均为：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)：碧云天公司，货号为A0208。

结果见图8的B。与CON组小鼠相比，DSS组小鼠的cGAS与STING蛋白表达水平及NF-κB通路磷酸化水平均显著升高。相比DSS组小鼠，DSS+AZT组小鼠的cGAS与STING蛋白表达水平及NF-κB通路磷酸化水平均显著降低。

本实施例结果表明，AZT通过抑制ERVs活化治疗小鼠溃疡性结肠炎。

实施例3、AZT通过抑制ERVs活化对巨噬细胞极化的影响

用于实施例的小鼠巨噬细胞为RAW264.7细胞。

RAW264.7细胞：Servicebio公司，货号为STCC20020G。

细胞培养基：含1％青霉素链霉素双抗混合液(P/S)、10％澳洲胎牛血清(FBS)，余量为RPMI Medium 1640培养基。

细胞培养条件：37℃、5％ CO

一、分组处理细胞

M0组：用细胞培养基培养小鼠巨噬细胞，培养时间为8小时；

M0+AZT组：用含2μM AZT的细胞培养基培养小鼠巨噬细胞，培养时间为8小时；

M1组：用含100ng/ml LPS的细胞培养基培养小鼠巨噬细胞，培养时间为8小时；

M1+AZT组：用含100ng/ml LPS和2μM AZT的细胞培养基培养小鼠巨噬细胞，培养时间为8小时。

二、AZT对巨噬细胞中ERVs表达的影响

1、完成分组处理后，收集细胞。取细胞，提取总RNA，反转录得到cDNA。以cDNA为模板，以GAPDH基因为内参基因，通过实时荧光定量PCR检测目标基因的相对表达水平。目标基因分别为：MERVL基因或Line-1基因。用于PCR扩增目标基因以及内参基因的引物见表1。

结果见图9的A。与M0组相比，M1组中MERVL和Line-1的mRNA水平均显著升高。相比M1组，M1+AZT组的MERVL和Line-1的mRNA水平均显著降低。

2、完成分组处理后，收集细胞。提取总蛋白，进行Western Blot检测。

Western Blot检测目标物为：MERVL和Line-1。内参蛋白为GAPDH。

检测MERVL时，采用的一抗为MERVL-Gag抗体。MERVL-Gag抗体，全称为MuERVL-GagRabbit Polyclonal Antibody，碧云天公司产品，货号为AF0240。

检测Line-1时，采用的一抗为重组Anti-LINE-1ORF1p抗体(Rabbit monoclonal)。重组Anti-LINE-1ORF1p抗体：Abcam公司产品，货号为ab216324。

采用的二抗均为：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)：碧云天公司，货号为A0208。

结果见图9的B。与M0组相比，M1组中MERVL和Line-1蛋白水平均显著升高。相比M1组，M1+AZT组的MERVL和Line-1蛋白水平均显著降低。

3、完成分组处理后，收集细胞，利用免疫荧光检测细胞中MERVL水平。

采用的一抗为：兔源MERVL-Gag抗体(碧云天公司，货号为AF0240)。

采用的二抗为：羊抗兔IgG(H+L)Alexa Fluor 488抗体(Yeasen，33106ES60)。

结果见图10。与M0组相比，M1组中MERVL荧光强度显著升高。相比M1组，M1+AZT组的MERVL荧光强度显著降低。AZT处理不仅降低了M1巨噬细胞中MERVL绿色荧光强度，而且还使其M1型巨噬细胞的不规则形状特征恢复到M0型巨噬细胞的圆形特征。

三、AZT对巨噬细胞中cGAS/STING/NF-κB通路的影响

1、完成分组处理后，收集细胞。取细胞，提取总RNA，反转录得到cDNA。以cDNA为模板，以GAPDH基因为内参基因，通过实时荧光定量PCR检测目标基因的相对表达水平。目标基因分别为：胞质核酸感应通路的cGAS基因与STING基因。用于PCR扩增目标基因以及内参基因的引物见表5。

结果见图11的A。与M0组相比，M1组中cGAS与STING的mRNA水平均显著升高。相比M1组，M1+AZT组的cGAS与STING的mRNA水平均显著降低。

2、完成分组处理后，收集细胞。提取总蛋白，进行Western Blot检测。

Western Blot检测目标物为：先天免疫通路cGAS/STING/NF-κB关键蛋白。

内参蛋白为GAPDH。

检测TBK1时，采用的一抗为兔抗TBK1抗体(Zenbio公司，货号380780)

检测磷酸化TBK1时，采用的一抗为兔抗Phospho-TBK1抗体(ABclonal公司，货号AP0847)。

检测NF-κB时，采用的一抗为兔抗NF-κB p65抗体(Zenbio公司，货号为R25149)。

检测磷酸化NF-κB时，采用的一抗为兔抗Phospho-NF-κB p65抗体(Zenbio公司，货号310013)。

采用的二抗均为：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)：碧云天公司，货号为A0208。

结果见图11的B。与M0组相比，LPS诱导的M1组中磷酸化TBK1及p65比例均显著升高。相比M1组，M1+AZT组的磷酸化TBK1及p65比例均显著降低。

3、完成分组处理后，收集细胞，利用免疫荧光检测细胞中p65蛋白的表达及入核情况。

一抗为：兔抗NF-κB p65抗体(Zenbio公司，货号R25149)。

荧光二抗为：羊抗IgG(H+L)Alexa Fluor 555抗体(Sangon公司，D110070)。

结果见图11的C。与M0组相比，M1组中NF-κB通路关键蛋白p65的荧光强度显著升高，且有大量p65蛋白进入细胞核。相比M1组，M1+AZT组的p65的荧光强度均显著降低。AZT处理后不仅降低了M1巨噬细胞中p65的红色荧光强度，而且还使p65蛋白入核比例下降。

四、AZT对巨噬细胞极化的影响

1、完成分组处理后，收集细胞。取细胞，提取总RNA，反转录得到cDNA。以cDNA为模板，以GAPDH基因为内参基因，通过实时荧光定量PCR检测目标基因的相对表达水平。目标基因分别为：结肠中炎性因子基因(IL-6基因、IL-1β基因及TNF-α基因)和促炎症M1型巨噬细胞标志物基因(iNOS基因)。

用于PCR扩增目标基因以及内参基因的引物见表4。

结果见图12的A。与M0组相比，M1组中IL-6、IL-1β、TNF-α及iNOS的表达水平均显著升高。相比M1组，M1+AZT组的IL-6、IL-1β、TNF-α及iNOS均显著降低。

2、完成分组处理后，收集细胞。提取总蛋白，进行Western Blot检测。

Western Blot检测目标物为：炎症因子和巨噬细胞标志物蛋白。

内参蛋白为GAPDH。

检测TNF-α时，采用的一抗为兔抗TNF-a抗体(碧云天公司，货号AF8208)。

检测iNOS时，采用的一抗为兔抗iNOS抗体(Servicebio公司，货号GB11119)。

采用的二抗均为：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)：碧云天公司，货号为A0208。

结果见图12的B。与M0组相比，M1组中TNF-α及iNOS蛋白水平均显著升高。和M1组相比，M1+AZT组的TNF-α及iNOS蛋白水平均显著降低。

本实施例结果表明，AZT能够抑制LPS诱导的巨噬细胞的M1型极化作用。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。