一种厌氧降解除草剂丁草胺的菌株SRB-1及其应用

技术领域

本发明属于微生物降解修复有机物污染物技术领域，涉及一种厌氧降解除草剂丁草胺的菌株SRB-1及其应用。

背景技术

丁草胺 [2-氯-

丁草胺化学性质稳定，在水体和土壤中持效期长，在环境中自然降解速度非常慢。其长期的大量使用，易造成水体、土壤等环境的丁草胺残留污染。此外，丁草胺使用不当会对农作物产生严重药害，例如在水稻田使用不当，丁草胺对秧苗易造成药害，使得秧苗黄花而死。同时，丁草胺具有潜在的致畸变和致突变性，被美国环保局定为B-2类致癌物，丁草胺会导致心率紊乱、抽搐、昏迷和呼吸停止。丁草胺对鱼类有很强的毒性，比对哺乳动物的毒性大500-10000倍，会严重危害污染水体中的渔业资源。丁草胺对土壤微生物有明显的抑制作用，显著降低土壤微生物多样性。因此研究丁草胺残留的高效降解修复技术具有重要的意义。

丁草胺在环境中可以通过光解、化学降解和微生物降解等方式消除，其中微生物是环境中消除丁草胺残留污染的主要动力。微生物降解修复技术和传统的物理化学方法相比，具有高效、快速、无残留、无二次污染等优点，适合有毒、有害的有机污染物大面积面源污染的降解修复，修复费用较低（仅为传统化学和物理修复费用的10%左右）。微生物降解根据微生物对氧气的需求不同分为有氧微生物降解和厌氧微生物降解。厌氧生物修复具有耗能低、污泥的负荷高、需要营养少、经济效益高和应用范围广等优点，成为环境污染物修复的主要方法。

目前，国内对丁草胺的有氧微生物降解报道的较为详细，分离出较多的有氧降解菌，极大的丰富了有氧菌种资源。然而丁草胺在使用的过程中，不仅会进入到有氧的环境，也会进入到厌氧或者微氧的环境，如农田土壤底层（特别是淹水条件下）、湿地、地下水、湖泊河流底泥以及处理生活或工业废水的厌氧反应器。但国内外对丁草胺厌氧降解的研究较少，分离纯化的厌氧降解菌仅有2株，菌株

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明提供了一种除草剂丁草胺的厌氧降解菌株SRB-1及其应用，分离和筛选出一株丁草胺高效厌氧降解菌株SRB-1，并对其进行鉴定，该菌株SRB-1具有降解特性和生物修复能力，可丰富除草剂降解菌资源库，为发展新的除草剂残留污染修复提供依据。

本发明的第一目的是提供一种丁草胺厌氧降解菌株SRB-1。

本发明的第二目的是提供所述的菌株

本发明的第三目的是提供所述的菌株

为解决现有技术问题，本发明提供以下技术方案：

一种厌氧降解除草剂丁草胺的菌株SRB-1，所述菌株SRB-1于2022年8月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 40301，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，命名为

本发明菌株SRB-1从安徽马鞍山长期生产丁草胺的农药厂的下水道，采集的厌氧污泥，经过富集驯化，分离纯化后获得一株厌氧降解除草剂丁草胺的菌株SRB-1，经过形态学和分子生物学鉴定，该菌株属于

上述所述厌氧降解的环境为空气中氧气的含量为0%。

上述厌氧降解除草剂丁草胺的菌株SRB-1在降解除草剂上的应用，所述的除草剂为丁草胺，对浓度为50 mg/L丁草胺的降解半衰期为2.33 d。

上述厌氧的菌株SRB-1在修复被丁草胺污染的自然环境中的应用。

优选的是，所述的自然环境为地下水、地表水、淹水土壤或湿地。

一种高效厌氧降解除草剂丁草胺的复合菌剂，含有上述菌株SRB-1。

优选的是，所述的复合菌剂中菌株SRB-1的数量为1.0 × 10

通过验证可知，本发明菌株SRB-1能够在厌氧条件下快速降解丁草胺，对浓度为50mg/L丁草胺的降解半衰期为2.33 d，对丁草胺的降解效率显著高于目前已报道的丁草胺降解菌株

菌株SRB-1对丁草胺的降解机制：还原硫酸盐产生硫化物对丁草胺的亲核取代的共轭脱氯，不同于菌株BAD-20和菌株BAD-10对丁草胺的酶促还原脱氯。

有益效果：与现有技术相比，本发明一种除草剂丁草胺的厌氧降解菌株SRB-1及其应用，具有如下优势：

（1）本发明菌株SRB-1对丁草胺有很好的厌氧降解的效果，丰富除草剂厌氧降解的种子资源库。

（2）本发明在厌氧条件下，菌株SRB-1对浓度为50 mg/L丁草胺的降解半衰期为2.33 d，能够快速高效的降解丁草胺，说明菌株SRB-1在丁草胺污染的厌氧环境的生物修复方面具有很好的修复潜力。

（3）本发明的实施例中提到的农药降解菌株可以降解丁草胺，可以广泛的用于厌氧污水处理站、厌氧反应器、地下水和淹水土壤等丁草胺污染环境的厌氧修复。

附图说明

图1为菌株SRB-1的对丁草胺厌氧降解效果，A为不同培养时间丁草胺液相图；B为不同培养时间丁草胺厌氧降解动态；

图2A为菌株SRB-1的菌落照片；

图2B为菌体的透射电镜照片；

图3为菌株SRB-1的16S rRNA基因系统进化分析；

图4A为不同温度菌株SRB-1降解丁草胺的影响；

图4B为不同pH菌株SRB-1降解丁草胺的影响；

图4C为不同NaCl浓度对菌株SRB-1降解丁草胺的影响；

图5A为菌株SRB-1在MSM中添加和不添加SO

图5B为菌株SRB-1在MSM中添加SO

图6为菌株SRB-1对工业污水中丁草胺的厌氧降解修复，A为10 mg/L；B为50 mg/L。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地说明；但本发明的实施方式并不限于此。除非特别说明，本发明所采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规的试剂、方法和设备。

以下实施例中所述培养基配方如下：

厌氧富集驯化培养基（MSM，g/L）：K

厌氧分离和培养培养基（MPM，g/L）：NH

培养基除氧：将配置好的培养基煮沸，趁热将30 mL培养基分装于50 mL血清瓶中，塞住胶塞并用铝帽固定，充入氮气30 min除氧，115 °C高压蒸汽灭菌30 min。灭菌后的培养基应保持无色，如果颜色变为微红色或红色，则说明氧气没有除尽。

丁草胺的检测条件：超高效液相色谱（U3000，Thermo Fisher Scientific，美国）；Thermo Fisher Syncronis C

实施例1 菌株SRB-1的分离、筛选和鉴定

（1）丁草胺厌氧降解菌的富集驯化和分离筛选

取采自长期生产丁草胺农药厂（安徽马鞍山农药厂）的厌氧活性污泥，接种于含有50 mg/L丁草胺和30mL MSM的血清瓶中，置于30 °C、150 rpm摇床内培养7 d。取上一代富集液按5%的含量转接到新鲜的含有50 mg/L丁草胺的30 mL的MSM中，每次转接测定瓶中丁草胺的浓度，至丁草胺降解90%以上，如此转接至4代。取第5代的富集液，在厌氧操作箱内用稀释涂布法将稀释后的富集液涂布于含有100 mg/L丁草胺的MPM固体培养基上，将平板倒置放入厌氧罐中，30 °C恒温培养7 d。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落多次划线纯化，并验证其对丁草胺的降解效果。

以丁草胺为选择压力，分离纯化出一株丁草胺厌氧降解菌，编号为SRB-1。分类命名为

随着培养时间的增加，HPLC液相色谱图中丁草胺的吸收峰逐渐下降（图1A）；培养7d内，菌株SRB-1对浓度为50 mg/L的丁草胺的厌氧降解率达到95%以上（图1B）。

（2）菌株SRB-1形态学、生理生化和分子生物学鉴定

在厌氧操作箱内，将菌株SRB-1接种于MPM固体平板上，35 °C恒温培养3 d，观察期菌落形态。菌株SRB-1在MPM固体平板中菌落表面湿润且光滑、不规则、淡黄色、直径大小为1-3 mm（图2A）；菌体为杆状，无鞭毛、不运动，大小为0.2-0.6 μm × 1.5-3.0 μm（图2B）。该菌株革兰氏染色为阳性，严格厌氧生长，最适生长温度为35-40 °C，最适生长pH为7.0-7.5，能够还原硫酸盐产生硫化氢。

利用高盐法提取菌株SRB-1的总DNA，然后设计细菌16S rRNA基因的通用引物对27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），以提取的菌株SRB-1的总DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增后的产物委托南京擎科生物科技有限公司进行测序，将测序获得的菌株SRB-1的16S rRNA基因序列在EzBioCloud database（www.ezbiocloud.net）数据库与已报到模式菌株的16S rRNA基因进行同源性分析，选取与其同源性较高的模式菌株相关序列，利用MEGA 6.0 软件，通过邻接法构建抗性菌株的系统进化树。如图3所示，本发明分离获得的菌株SRB-1的16S rRNA基因序列与

依据菌株SRB-1的形态学和分子生物学鉴定，将菌株SRB-1鉴定为

实施例2 菌株SRB-1对丁草胺厌氧降解特性研究

（1）菌株SRB-1液体菌剂的制备

在厌氧操作箱内，将MPM固体平板上长出的菌株SRB-1，接种于装有100 mL除氧的MPM液体培养基的西林瓶（规格250-mL）中，于35 °C、150 rpm培养至对数期（3 d），3380 ×g离心5 min收集菌体，菌体用MSM洗涤2次后重悬于MSM中，调节菌液浓度OD

（2）菌株SRB-1降解特性研究

向除氧的MSM中，加入1.0 mL的菌株SRB-1的液体菌剂（OD

由图4可知，菌株SRB-1在温度为20-45 °C，菌株SRB-1对丁草胺的厌氧降解率大于60%；25-40 °C，菌株SRB-1对丁草胺的厌氧降解率大于80%，对丁草胺厌氧降解的最适温度为30-40 °C；在pH为6.5-9.0，菌株SRB-1对丁草胺的厌氧降解率大于80%，对丁草胺厌氧降解的最适pH为7.0-7.5。在NaCl浓度为0%-3.0%，菌株SRB-1对丁草胺的厌氧降解率大于70%，对丁草胺厌氧降解的最适NaCl浓度为0%-2.0%。

以上结果表明，菌株SRB-1在广泛的温度（20-45 °C）、pH（6.5-9.0）和NaCl浓度（0%-3.0%）条件下具有较好的环境适应能力，能够高效降解丁草胺。

实施例3 菌株SRB-1对丁草胺厌氧降解能力测定

将1.0 mL菌株SRB-1的液体菌剂（OD

表1 菌株SRB-1对不同浓度丁草胺厌氧降解拟合的一级动力学参数

实验结果如表1所示，菌株SRB-1对丁草胺的降解动态符合一级动力学方程的规律，以时间为横轴，丁草胺的残留浓度为纵轴，用一级动力学方程（

实施例4 菌株SRB-1对丁草胺厌氧降解机制研究

在含有30 mL除氧的MSM（含有FeSO

IC检测方法：赛默飞ICS-1100 IC，Dionex IonPac

硫化氢检测方法：利用“碘量法”测定硫化氢的浓度。在厌氧操作箱内，取10 mL降解液于100 mL规格的西林瓶中，加入5 mL浓度为10 mM的醋酸锌溶液，振荡2 min，超声溶解5 min使得沉淀完全；然后转移到50 mL离心管中，12000 × g离心3 min，弃上清，向沉淀中依次加入10 mL的去离子水、4 mL的10 mM的碘液，0.5 mL的40 mM的盐酸，密闭放置5 min，用2 mM的硫代硫酸钠滴定至刚好出现淡黄色，加入0.2 mL可溶性淀粉（1.0 g/L），继续滴加硫代硫酸钠滴定至蓝色刚好消失，记录滴加硫代硫酸钠的体积，换算出硫化物的浓度。

菌株SRB-1能够还原硫酸根产生硫化氢，菌株SRB-1在MSM中添加和不添加SO

实施例5 菌株SRB-1对工业污水中污染的丁草胺的生物修复应用

取南京市某污水处理厂的厌氧处理站的污水，贮藏于密封的塑料瓶中，置于阴凉处。取1.0 L的污水加入0.6 g的FeSO

菌株SRB-1对工业污水中丁草胺的生物修复，结果如图6所示。在丁草胺浓度为10mg/L的空白组，实验阶段（0-7 d），丁草胺厌氧降解率小于5%；添加菌株SRB-1的处理组，7 d内能够完全降解丁草胺，对其的厌氧降解半衰期为1.6 d。在丁草胺浓度为50 mg/L的空白组，实验阶段（0-14 d），丁草胺厌氧降解率小于11%；添加菌株SRB-1的处理组，14 d内能够完全降解丁草胺，对其的厌氧降解半衰期为2.5 d。以上结果表明，菌株SRB-1对污水中丁草胺展现了很好的修复效果，具有巨大的应用潜。