病毒过滤器及病毒过滤方法

背景

随着护理点(POC)测试的出现，开发简单、快速和方便用户执行的诊断产品变得越来越重要。这种需求的出现是因为健康护理工作者需要在传统的健康护理环境之外的现场执行测试，并且快速要求结果，同时以最少的时间执行诊断测试。在几分钟内提供诊断结果允许健康护理工作能够识别疾病，例如病毒性疾病，并尽快治疗患者。

护理点诊断测试经常对生物样品(例如，全血或尿液)执行。生物样品中的细胞和颗粒物质会干扰测试装置中的流体流动，从而影响生物流体中分析物的测量。

例如，在血液中，红细胞会干扰光谱测量，并且随着血细胞比容变化，给定体积的血液中的血浆体积发生变化。为了克服这些问题，将红细胞与血浆分离，以允许有更明确和均匀的样品。唾液或尿液的各种组分也是如此。

因此，从生物样品中过滤掉细胞、颗粒物质或碎片的装置可以提高对样品执行的分析程序的质量。

例如，病毒的过滤、分离和隔离是控制血源性病毒感染和病毒研究的关键问题。基于膜的技术因其效率、易于实施和成本效益而被鉴定为分离生物材料(包括病毒)的有用方法。

发明概述

本发明提供了对生物样品的简单和快速过滤，由此可以在相同装置或不同装置中分析样品。在一个优选的实例中，使用膜过滤器，其特别可用于过滤包含病毒以及需要与病毒分离的其它生物材料的样品。

附图简述

图1显示了根据本发明的各个实施方案的侧向流装置；和

图2显示了可用于如图1所示的侧向流装置的各种组件配置/材料。

详细描述

定义

如本文所用，“微孔”是指膜/层中的开口、孔口、缺口、导管、通道、腔室或凹槽，其中微孔或微通道的尺寸足以允许通过或分析至少单个靶物质(例如，细胞、细菌、病毒、生物颗粒、微生物等)。微孔可以允许通过或接纳多于一个靶物质。如本文所用，“微”通常是指微米级尺寸。

如本文所用，“纳米孔”是指膜/层中的开口、孔口、缺口、导管、通道、腔室或凹槽，其中纳米孔或纳米通道的尺寸或构造阻止单个靶物质通过。如本文所用，“纳米”通常是指纳米级尺寸。

如本文所用，“孔径”通常是指微孔或纳米孔的宽度，除非上下文另有说明。如本文所用，“微”是指微米级尺寸。如本文所用，“亚微米”是指大于约100nm至小于约1微米(μm)。

本发明提供了对生物样品的简单和快速过滤，由此可以在相同装置或不同装置中分析样品。在一个优选的实例中，使用膜过滤器，其特别可用于过滤包含病毒以及需要与病毒分离的其它生物材料的样品。

膜过滤器

基于膜的技术因其效率、易于实施和成本效益而被鉴定为分离生物材料(包括病毒)的有用方法。几种类型的膜已被用于病毒过滤。例如，由于在适当条件下存在静电相互作用，微滤(MF)膜显示出相对高的通量和在膜上良好的病毒保留。孔径较小的超滤膜也被用于分离病毒。

在一个实施方案中，根据本发明使用的病毒过滤器是不对称的，并且包含亚微米、微米或纳米多孔聚合物膜结构中的任意一种或多种，所述结构具有梯度孔隙率，即从膜的一个主要表面发展到其另一个主要表面的梯度孔径，其中孔径范围从例如约10nm至约100微米。优选地，孔径范围从约20nm至约100微米，优选从约20nm至约50微米，优选从约20nm至约10微米，优选从约20nm至约1微米，优选从约20nm至约0.5微米，优选从约40nm至约100微米，优选从约40nm至约50微米，优选从约40nm至约10微米，优选从约40nm至约1微米，优选从约40nm至约0.5微米，优选从约80nm至约100微米，优选从约80nm至约50微米，优选从约80nm至约10微米，优选从约80nm至约1微米，优选从约80nm至约0.5微米，优选从约100nm至约100微米，优选从约100nm至约50微米，优选从约100nm至约10微米，优选从约100nm至约1微米，优选从约100nm至约0.5微米，优选从约200nm至约50微米，优选从约200nm至约10微米，优选从约200nm至约1微米，优选从约200nm至小于约1微米，例如从约200nm至约999nm。最优选地，优选的孔径分布在亚微米范围内。

根据膜的生产方法，膜过滤器可以是等孔的、分层的、不对称的梯度膜。等孔梯度膜具有表面层和不对称的子结构。表面层可以具有一系列厚度。例如，表面层的厚度可以是约20nm至约500nm，优选约50nm至约300nm，优选约50nm至100nm，包括所有值至所述nm及其之间的范围。表面层具有多个延伸到表面层的整个深度的孔。孔可以具有形态，例如圆柱形和立方体形态。孔的尺寸(例如，直径)可以是例如从20nm至小于约1微米，例如100nm，包括所有值至所述nm及其之间的范围。至少一个表面层可包含有序阵列状多孔层以形成简单的筛网。

至少一个表面层可以具有一系列孔密度。优选地，所述表面层是等孔的。“等孔”是指孔具有窄的孔径分布。例如，窄的孔径分布小于0.3(例如，0.1至0.3，包括所有值至0.01及其之间的范围)，其中孔径分布定义为通过对数正态分布拟合获得的方差系数σ/μ。在各个实例中，孔径分布为0.1、0.15、0.2、0.25或0.3。

不对称的子结构也可以具有一系列厚度。例如，不对称的子结构层的厚度可以是从约20nm至约500nm，优选约50nm至约300nm，优选约50nm至100nm，包括所有值至所述nm及其之间的范围。表面层具有多个延伸到表面层的整个深度的孔。孔可以具有形态，例如圆柱形和立方体形态。孔的尺寸(例如，直径)可以是从40nm到小于约1微米，例如在100nm和999nm之间，包括所有值至所述nm及其之间的范围。

在范围从纳米到微米的多个长度级别上具有连续(即，可进入)的分层孔隙率的聚合物材料为物质通过孔和机械坚固的结构的有效传输提供了潜力，同时保持易于加工性和相对高的表面积。

制造等孔膜的方法在本领域是已知的，包括由嵌段共聚物自组装和非溶剂诱导相分离的组合(SA+NIPS＝SNIPS)制成的那些。SNIPS来源的薄膜由化学上不同的嵌段共聚物制成，使得例如，孔表面化学可以通过“混合和匹配”方法进行定制，即将相应的各个嵌段共聚物简单共混到从其浇注所述膜的原始聚合物溶液中。

据信，表面层的形态部分地是多嵌段共聚物自组装的结果。该层的形态取决于浇注条件(例如，薄膜周围环境的流速、薄膜周围环境中的水(湿度)/溶剂浓度、蒸发时间、浇注速度、浇口高度)以及浇注溶液的组成(例如，聚合物摩尔质量、化学组成、浓度、浇注溶剂或溶剂混合物)。

制造等孔膜的方法可以在例如WO2019/023135、WO2019/178045、WO2017/189697、WO2019/060390、美国专利公布2017/0327649和WO2015/048244中找到。在另一种称为旋节分解诱导的宏观相和中间相分离加上冲洗提取或SIM

在另一个实施方案中，膜过滤器可以包含两个不同的膜，从而形成双层膜，其中一层具有能够充当深度过滤器的微米大小孔的三维网状物，并且另一层膜具有纳米简单筛网，其可以提供在一起，使得它们共同充当单个过滤器。这些膜中的每一个都可以通过本领域已知的任何方法创建。例如，可以按照美国专利号9333481中所述，产生深度过滤器层。

简单筛网层的实例包括但不限于：Ulbricht,M.,"Advanced functional polymermembranes,"Polymer 47(2006),pp.2217–2262。

优选的双层膜通常包括第一多孔层和与第一多孔层相邻的第二多孔层。第一多孔层具有捕获较大生物组分(例如，整个细胞和碎片)而不会堵塞的大小和特征。第一多孔层的孔通常具有随机取向和大于100nm的尺寸。随机取向减少了过滤器在使用过程中堵塞的趋势。第二多孔层与第一多孔层相邻，并具有较小的孔径，通常在20-100nm范围内。见Yanget al.,2006Adv.Mater.,18,709-712doi:10.1002/adma.200501500。可以选择第二多孔层的孔径以允许特定病毒通过孔。在该实施方案中，膜材料可以包括第一层，其包括血液分离器，例如VF2、GF/DVA、MF1或Fusion 5，以及第二层，其与第一层粘合并使用光刻技术制成精确尺寸，例如，如2020年10月9日提交的标题为“Tangential Flow Cassette-HFEmulation”的美国专利申请号17/067,528中所述，所述专利申请通过引用并入本文。'528申请中描述了使用从半导体制造技术修改的技术制造多孔聚合物膜的技术。这些技术允许将孔径控制到精确的尺寸，并且可用于创建根据本发明的实施方案的膜过滤器的第二层，按需要包括在20-100nm、50-100nm或80-100nm之间的孔径。

优选地，孔径范围从约20nm至约100微米，优选从约20nm至约50微米，优选从约20nm至约10微米，优选从约20nm至约1微米，优选从约20nm至约0.5微米，优选从约40nm至约100微米，优选从约40nm至约50微米，优选从约40nm至约10微米，优选从约40nm至约1微米，优选从约40nm至约0.5微米，优选从约80nm至约100微米，优选从约80nm至约50微米，优选从约80nm至约10微米，优选从约80nm至约1微米，优选从约80nm至约0.5微米，优选从约100nm至约100微米，优选从约100nm至约50微米，优选从约100nm至约10微米，优选从约100nm至约1微米，优选从约100nm至约0.5微米，优选从约200nm至约50微米，优选从约200nm至约10微米，优选从约200nm至约1微米，优选从约200nm至小于约1微米，例如从约200nm至约999nm。最优选地，优选的孔径分布在亚微米范围内。

根据本发明的膜过滤器可以片状形式，作为侧向流装置(例如，免疫测定)的组件，或在注射器过滤器内提供。

侧向流装置应用

在一个方面，膜过滤器12用于侧向流装置10，例如侧向流免疫测定中。优选地，所述免疫测定被设计成检测能够通过膜过滤器的特定病毒。所述侧向流装置包含滤膜12；包含测试线和对照线的载体膜16，所述载体膜16与滤膜12流体连通；以及与载体膜16流体连通的吸收垫(例如吸芯18)，其中侧向流装置使用被动毛细管作用进行操作。侧向流装置10还可以包含样品垫20和/或结合垫14。膜过滤器优选与样品垫接触放置，或代替具有图1的结构的侧向流装置内的样品垫。

膜层12优选以较小孔朝下方向与样品垫接触，并且较大随机孔在与样品垫接触的部分上方朝向来定位。侧向流装置旨在检测液体样品中是否存在靶标分析物。传统上，在载体上形成一系列液体导管，例如毛细管垫，例如多孔纸片或烧结聚合物。已知的布置采用各种液体导管元件，包括充当海绵并容纳过量样品液体的第一样品液体接收元件。一旦浸泡，流体就会传送到称为结合释放垫的第二元件，制造商在其中已存储了所谓的结合物，通常是在可溶解的基质中的干燥形式的生物活性颗粒，所述基质包括试剂以在靶标分子与已被固定在颗粒表面的其化学配偶体之间产生化学反应。当样品溶解颗粒时，发生反应以将分析物结合到颗粒。通常，第二试剂，例如沿结合垫位于特定距离处的变色试剂，或在第三元件上，并用于捕获其上结合了分析物的颗粒以提供测试结果。第三试剂，例如沿液体路径比第二试剂更远的变色试剂，通常用于捕获所有颗粒，并因此用作对照以确保液体样品已经传送通过第二试剂。根据本发明有用的侧向流测定的实例包括美国专利号10,551,381；YenC.W.et al..Lab Chip.2015；15:1638–1641.doi:10.1039/C5LC00055F以及Koczula andGallota,(2016)Essays Biochem；60(1):111-120doi:10.1042/EBC20150012；2015年3月17日提交的标题为“Improvements in and Related to Lateral Flow Testing”的美国专利申请号2017/0115287A1中描述的那些。

在通过第二和第三试剂的反应区之后，液体样品进入最终的多孔吸芯材料元件18，其充当废物容器。

诊断性病毒疫苗测定和应用提供了许多优势，包括但不限于：

–确定治疗策略；

–预测病程和预期的结果；

–预测病毒传播的可能性；

–允许易感个体的鉴定和接种疫苗；

–追踪病毒在世界各地的移动。

在受感染的患者中鉴定病毒的方法：

-理想情况下应敏感、特异且快速；

-用于诊断(Dx)测试的常见靶标：病毒蛋白(抗原)、病毒基因组和/或抗病毒抗体；

-一些设计为直接从患者样品(血液、咽拭子)中检测，例如侧向Dx流测定；

-流行病学研究可包括需要使用低成本、高通量模式的大样品队列。

根据本发明的病毒滤膜和诊断测试可用于检测病毒，包括但不限于SARS-CoV-2、SARS(2003)、腺病毒、诺如病毒、轮状病毒A、流感(例如甲型流感)、寨卡病毒、登革热、基孔肯雅热、西尼罗河病毒、日本脑炎、HIV、H1N1、EB病毒(EBV)、单纯疱疹1病毒(HSV-1)、黄热病病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒和上述病毒的所有变种。本发明的病毒滤膜的孔径经选择以允许病毒靶标与生物样品的其它组分分离。选择特定过滤器的孔径和范围时应考虑的病毒粒径的实例为从约30nm(例如脊髓灰质炎病毒的粒径)到约88-110nm(腺病毒和甲型流感病毒的粒径范围)。HIV-1病毒的粒径在120至150nm范围内，而HSV-1粒径为约125nm，以及EBV病毒颗粒为约140nm。

在优选的实施方案中，根据本发明的病毒过滤器和诊断测试适合在诊断测试中用于在SARS-CoV-2生物样品中的检测，其病毒粒径在约70nm至约110nm的范围内。

根据本发明，所述生物样品选自任何体液或组织，包括但不限于外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰液、唾液、固体组织样品、皮肤拭子样品、咽拭子样品和生殖器拭子样品。

其它病毒过滤应用

本发明的膜过滤器可用于其它病毒过滤设置，包括但不限于：

·生物制药和临床应用，即：

治疗性蛋白质生产中的病毒清除

mAb生产的下游处理中的最终纯化步骤

用于生产预防性疫苗和基因疗法的病毒纯化

·监测微生物水质

·空气净化

膜过滤器的其它用途

本发明的膜过滤器可用于各种颗粒(有生命和无生命的)分离。典型的分离包括真核和原核细胞(小到病毒和真菌孢子以及种子尺寸)以及土壤、废气排放、金属微粒。本发明的膜过滤器也适用于细胞分子分离。

例如，为了评估膜过滤器的性能，使用不同尺寸的聚苯乙烯珠或分子(例如聚葡聚糖)来测试过滤器，作为分离的通用测试。因为在即使被认为均匀尺寸的孔膜中的尺寸范围，大多数分离在轮廓上是S形的。例如，一个关键的性能“成功”将是非常尖锐的尺寸切断轮廓加上明确定义的压力——通过膜的(空气和水)流动关系。

在一个优选的实施方案中，本发明的过滤器的方向便于其在特定环境中使用。例如，当过滤器与侧向流测定结合使用以检测病毒的存在时，过滤器被定向为使得孔梯度的较大孔接收含有可疑病毒的生物样品。然后病毒通过过滤器并在通过侧向流测定的样品垫之前被浓缩。根据打算什么目标生物物类通过过滤器以及到例如侧向流测定条上，利用过滤器的方向。

实施例

实施例1——测试用于病毒诊断测定的各种过滤器。

本文所提及的专利和科学文献确立了本领域技术人员可获得的知识。本文引用的所有引用专利和已发表或未发表的引用专利申请均通过引用全文并入。本文引用的所有其它已发表的参考资料、文件、手稿和科学文献等也在此通过引用完全并入。

虽然本发明已经参考其优选实施方案被特别示出和描述，但本领域技术人员将理解，可以在不脱离所附权利要求包含的发明范围的情况下，在其中进行形式和细节的各种变化。还应当理解，本文描述的实施方案不一定是相互排斥的，并且根据本发明，来自各种实施方案的特征因此可以全部或部分地组合在一起。