一种波纹鳜遗传性别鉴定特异性DNA片段、引物组及方法

技术领域

本发明涉及生物检测鉴定技术，尤其涉及一种波纹鳜遗传性别鉴定特异性DNA片段、引物组及方法。

背景技术

波纹鳜在淡水中生长，主要分布于珠江水系和长江水系，多栖息于底质为砾石或沙滩的水域中；该物种的模式产地在贵州独山、安徽休宁、广西罗城。

波纹鳜体长圆形，侧扁；头大，眼多为蓝色；吻略尖突，口大，下颌稍长，两颌有尖齿；前、间鳃盖骨后缘有明显锯齿，鳃盖骨门缘有2刺；体、颊、鳃盖均被小鳞；侧线弧；背鳍基长；胸、尾鳍圆形；腹鳍前移；具1硬棘；体侧有数条黄色纵波纹。波纹鳜个体较小，且生长缓慢，故食用价值极低，适合水族箱饲养当原生观赏鱼，常见体长为100~150mm，最大不超过200mm，数量较少。

波纹鳜从外观上很难进行性别鉴定，很难选择对波纹鳜进行打催产针挤卵或挤精子，因此增加了波纹鳜的人工繁殖的难度，亟待一种有效快速鉴定波纹鳜性别的方法。

发明内容

本发明克服现有技术中波纹鳜的性别难以通过外观区分，进而导致很难选择对波纹鳜打催产针或挤精子，增加了波纹鳜人工养殖难度的缺陷，提供一种波纹鳜遗传性别鉴定特异性DNA片段、引物组及方法，利用该特异性DNA片段、引物组和遗传性别鉴定方法能够准确鉴定波纹鳜的雌雄信息，且准确率较高。

实现本发明第一发明目的采用的技术方案为：一种波纹鳜遗传性别鉴定特异性DNA片段，包括：雄性波纹鳜特异性DNA片段和阳性参考DNA片段；

所述的雄性波纹鳜特异性DNA片段为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，条带大小为554bp；

所述的阳性参考DNA片段为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，条带大小为119bp。

实现本发明第二发明目的采用的技术方案为：一种波纹鳜遗传性别鉴定引物组，包括：雄性波纹鳜特异性分子标记引物DYG19和阳性参考引物DYG22；

所述的雄性波纹鳜特异性分子标记引物DYG19用于扩增以上技术方案所述的雄性波纹鳜特异性DNA片段；

所述的阳性参考引物DYG22用于扩增以上技术方案所述的阳性参考DNA片段。

所述的引物组的核苷酸序列信息如下所示：

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实现本发明第三发明目的采用的技术方案为：一种波纹鳜遗传性别鉴定方法，包括以下步骤：

S1、提取待鉴定波纹鳜样品的DNA；

S2、利用以上技术方案所述的引物组对步骤S1得到的待鉴定样品DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

S3、将步骤S2得到的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，得到分离结果；

S4、根据步骤S3得到的分离结果统计PCR扩增产物的条带大小，根据条带大小来判断待鉴定波纹鳜样品的遗传性别；

所述的步骤S4中，当统计的PCR扩增产物的条带大小为554bp和119bp时，待鉴定波纹鳜样品为雄性波纹鳜；当统计的PCR扩增产物的条带大小为119bp时，待鉴定波纹鳜样品为雌性波纹鳜。

本发明的有益效果是：（1）本发明的波纹鳜性别鉴定引物组中，雄性波纹鳜特异性分子标记引物DYG19用于扩增雄性波纹鳜特异性DNA片段；阳性参考引物DYG22用于扩增阳性参考DNA片段；通过统计所扩增出的雄性波纹鳜特异性DNA片段、阳性参考DNA片段的条带大小来分析待测波纹鳜样品的性别。

（2）本发明的波纹鳜的遗传性别鉴定方法中，在雄性波纹鳜特异性DNA片段的基础上，补充阳性参考DNA片段，用于进一步确认：扩增不出雄性波纹鳜特异性DNA片段的波纹鳜样品为雌性或者是科研人员实验操作失误造成，如果待测波纹鳜样品为雌性，则仅可扩增出条带大小为119bp的阳性参考DNA片段；如果实验操作出现失误（比如：提取DNA失败、加错样品或者药剂），则不能同时扩增出554bp和119bp的DNA片段，或者不能仅扩增出119bp的DNA片段，避免了科研人员在实验操作过程出现的失误对实验结果造成误读的现象。

（3）使用本发明的波纹鳜的遗传性别鉴定方法，可快速鉴别波纹鳜的性别，且鉴定结果与实际结果对比一致，准确率较高。

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的描述。

附图说明

附图1为本实施例的24尾波纹鳜的电泳分离结果图（M为DL2000 Plus）。

实施方式

本发明的波纹鳜特异性DNA片段包括：雄性波纹鳜特异性DNA片段和阳性参考DNA片段；雄性波纹鳜特异性DNA片段为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，条带大小为554bp；阳性参考DNA片段为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，条带大小为119bp。以上两种DNA片段相结合，来判断波纹鳜的性别。

本发明的波纹鳜特异性分子标记引物组包括：雄性波纹鳜特异性分子标记引物DYG19和阳性参考引物DYG22，引物组的信息如表1：

表1 波纹鳜特异性分子标记引物信息表

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DYG19的上、下游序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；DYG22的上、下游序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

雄性波纹鳜特异性分子标记引物DYG19能够在雄性波纹鳜上扩增出雄性波纹鳜特异性DNA片段，即为：SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，条带大小为554bp；但在雌性波纹鳜上扩增不出雄性波纹鳜特异性DNA片段。

阳性参考引物DYG22在雄性波纹鳜和雌性波纹鳜上均可扩增出阳性参考DNA片段，即为：SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，条带大小为119bp。

所以，统计分析以上引物组扩增得到的波纹鳜特异性DNA片段的条带大小，来鉴定波纹鳜的遗传性别：（1）如果扩增结果为554bp和119bp（或扩增结果为SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的核苷酸序列），则待鉴定的波纹鳜为雄性波纹鳜；（2）如果扩增结果仅为119bp（或扩增结构仅为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列），则可知：待鉴定的波纹鳜为雌性波纹鳜。

通过以下的实施例来测试本发明的波纹鳜特异性DNA片段、波纹鳜特异性分子标记引物组在鉴定波纹鳜遗传性别方面的效果。

从波纹鳜养殖池中取已知性别的12尾雄性波纹鳜样品和12尾雌性波纹鳜样品，通过以下步骤鉴定这些波纹鳜样品的遗传性别：

S1、根据DNA提取试剂盒的方法提取以上24尾波纹鳜样品的DNA。

S2、利用SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列组成的引物组，对步骤S1得到的24份样品DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

其中，PCR扩增体系是25ul：10×PCR Buffer 3ul，2.5mmol/L dNTP 2ul，MgCl

PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，退火温度复性10s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

S3、将步骤S2得到的PCR扩增产物在3%的琼脂糖凝胶上电泳30min，电压120V，得到分离结果。

S4、根据步骤S3得到的分离结果统计PCR扩增产物的条带大小，根据条带大小来判断待鉴定波纹鳜样品的遗传性别：当条带大小为554bp和119bp时，为雄性波纹鳜样品，当条带大小仅为119bp时，为雌性波纹鳜样品。

图1为本实施例的24尾波纹鳜的电泳分离结果图，由图可知：12尾雄性波纹鳜样品均有两个条带，12尾雌性波纹鳜样品均有一个条带。

将电泳分离结果与采样记录进行对比，可知：应用本发明的鉴定方法得到的波纹鳜的性别结果和采样记录的结果一致，因此，本发明的波纹鳜的遗传性别鉴定方法能够准确地鉴定波纹鳜的遗传性别，在本实施例中鉴定准确率为100%。