一株斜带石斑鱼仔鱼细胞系及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于海水鱼类细胞培养技术领域，具体涉及一株斜带石斑鱼仔鱼细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

石斑鱼（

鱼类细胞作为鱼体组织的细胞模型，不仅广泛应用于病毒的分离鉴定、病毒感染致病机制及宿主基因功能研究，也为研制病毒灭活疫苗以及环境污染物检测提供了细胞基础。鱼类细胞系作为一种体外培养系统，因其成本低、操作简单、重复性好，条件可控等诸多优点，逐渐应用于鱼类病毒病原学、免疫学、毒理学、代谢组学及疫苗学研究领域。至今，尽管已经建立200多种用于病毒分离鉴定和病毒学研究的鱼类细胞系，但来源于淡水鱼类的细胞系对海水鱼类病毒多不敏感。故迫切需要建立对不同病毒敏感的海水鱼类细胞系用于海水鱼类病毒病研究和防控。目前，尽管已经建立多种石斑鱼的组织细胞系，如石斑鱼脾脏细胞系、肾脏细胞系、脑细胞系等，但仍未见石斑鱼仔鱼细胞系的报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株斜带石斑鱼仔鱼细胞系（

本发明的第二个目的是提供一种上述的斜带石斑鱼仔鱼细胞系的构建方法，其包括以下步骤：

（1）原代培养：将斜带石斑鱼仔鱼无菌下漂洗后切碎，再次漂洗后进行组织贴块，加入原代细胞培养液培养获得原代细胞；

（2）传代培养：用胰酶消化原代细胞至变圆，分散细胞，加入传代细胞培养液和原代细胞培养液或加入传代细胞培养液进行传代培养，收集传代细胞，获得斜带石斑鱼细胞系。

优选地，所述的原代细胞培养液含石斑鱼血清。

优选地，所述的原代细胞培养液为：基础培养基L-15含体积比30%的胎牛血清、体积比0.5%的石斑鱼血清、质量比0.266%的NaCl、5 mM的HEPES、400 IU/mL青霉素、400 μg/mL链霉素和400 μg/mL制霉菌素，pH值为7.4；所述的传代细胞培养液为：基础培养基L-15含体积比10-20%的胎牛血清、质量比0.266%的NaCl、5 mM的HEPES、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，pH值为7.4；所述的漂洗为用漂洗液培养基漂洗，漂洗液培养基为：基础培养基L-15加入400 IU/mL青霉素、400 μg/mL链霉素和400 μg/mL制霉菌素，pH值为7.4。

优选地，所述的斜带石斑鱼仔鱼选自孵化4天的养殖斜带石斑鱼，所述的组织贴块为将斜带石斑鱼仔鱼碎片贴入胎牛血清涂布后的培养瓶底部，所述的原代细胞为原代培养至形成细胞单层占培养瓶底部面积80%以上时的细胞，所述的传代细胞培养液和原代细胞培养液为体积比1:1的传代细胞培养液和原代细胞培养液。

本发明的第三个目的是提供上述斜带石斑鱼仔鱼细胞系在表达外源基因中的应用。

本发明的第四个目的是提供上述斜带石斑鱼仔鱼细胞系在水产动物病毒分离中的应用。

优选地，所述的病毒为SGIV或RGNNV。

本发明的第五个目的是提供上述斜带石斑鱼仔鱼细胞系在环境污染物监测中的应用。

优选地，所述的环境污染物为微塑料。

本发明的优点：

1. 本发明获得了斜带石斑鱼仔鱼细胞系ECFry，其生长状态良好，细胞增殖稳定，现已经稳定传代超90代，细胞形态以成纤维样为主要形态，并可超低温冻存，为斜带石斑鱼基因种质资源保存的相关研究奠定基础。

2. 本发明提供的斜带石斑鱼仔鱼细胞系的构建方法，采用组织贴块的方法进行原代细胞培养，在原代培养过程中添加适量的石斑鱼血清作为外源营养和生长因子。而传代过程中不需要添加其它生长因子，培养条件不严苛。

3. 本发明提供的斜带石斑鱼仔鱼细胞系对石斑鱼的两种重要病毒性病原敏感，为分离、鉴定海水鱼类病毒及病毒疫苗制备提供重要细胞平台。

4. 本发明的斜带石斑鱼仔鱼细胞系可以直接应用于病毒感染致病机理、病毒-宿主细胞相互作用及外源基因功能研究。

5. 本发明的斜带石斑鱼仔鱼细胞系可以应用于环境中微塑料污染物的监测。

斜带石斑鱼仔鱼细胞系（

附图说明

图1为本发明实施例1中ECFry细胞的形态图，图表示为ECFry细胞第43代细胞形态。

图2为本发明实施例2中ECFry细胞在不同培养条件下的生长曲线图；A表示不同温度对细胞生长的影响；B表示不同胎牛血清浓度对细胞生长的影响。

图3为本发明实施例3中ECFry细胞系染色体核型分析图；A表示第17代ECFry细胞中期染色体数目分布；B表示第17代ECFry细胞中期染色体分裂相；C表示第43代ECFry细胞中期染色体数目分布；D表示第43代ECFry细胞中期染色体分裂相。

图4为本发明实施例4中ECFry细胞系转染pEGFP-N3的荧光图片；A表示相差显微镜下细胞形态；B表示荧光显微镜下细胞转染细胞内荧光。

图5为本发明实施例5中ECFry细胞对石斑鱼重要病毒的敏感性检测；A、感染细胞的病变观察；B、感染细胞中病毒基因转录表达情况。

图6为本发明实施例5中石斑鱼重要病毒感染ECFry细胞的电镜观察；A-D表示为RGNNV感染细胞的超微结构观察，E-G表示为SGIV感染细胞的超微结构观察。

图7为本发明实施例6不同浓度纳米微球暴露ECFry细胞的形态及纳米微球的分布情况。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1：斜带石斑鱼仔鱼（ECFry）细胞系的构建

（1）鱼体选择：选择孵化4天的养殖斜带石斑鱼仔鱼。

（2）配制漂洗液培养基和细胞培养液：

L-15基础培养基：Leibovitz’s-15（L-15）培养基为Gibco公司产品。培养基按照公司产品说明配制，另加入质量比0.266% NaCl和5 mM HEPES，调pH值为7.4，经0.22 μm滤膜过滤后分装，4℃保存备用；后期使用时根据需要加入胎牛血清、石斑鱼血清或抗生素（青霉素，链霉素和制霉菌素）。

漂洗液培养基：L-15基础培养基加入抗生素即青霉素、链霉素和制霉菌素，终浓度为400 IU/mL青霉素、400 μg/mL链霉素和400 μg/mL制霉菌素，调pH值为7.4。

原代细胞培养液：L-15基础培养基加入体积比30%胎牛血清、体积比0.5%石斑鱼血清和三抗（400 IU/mL青霉素、400 μg/mL链霉素和400 μg/mL制霉菌素），调pH值为7.4。

传代细胞培养液：1-14代时，L-15基础培养基加入体积比20%胎牛血清和双抗（100IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素），调pH值为7.4；15代及之后，L-15基础培养基加入体积比10%胎牛血清和双抗（100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素），调pH值为7.4。

石斑鱼血清的制备：取体长20 cm的珍珠龙胆石斑鱼，从尾静脉抽血。4℃静止过夜，将析出的上清析出，用漂洗培养基稀释后0.22 μm滤膜过滤，低温保存备用。

（3）原代培养

取孵化4天的斜带石斑鱼仔鱼，在无菌条件下在漂洗培养基中漂洗3 h，转入到无菌的10 cm的培养皿中，用漂洗培养基反复漂洗3次。用无菌的刀片将仔鱼切碎，漂洗培养基反复漂洗3次。预先用胎牛血清涂布细胞培养瓶的底部，然后将切碎的仔鱼组织块贴入到细胞培养瓶的底部，每瓶贴入10-15块。培养瓶倒置放入生化培养箱，28℃ 2 h。缓慢加入1.5mL原代细胞培养液，正置培养瓶，28℃继续培养。原代培养第4天，开始有细胞从组织块边缘迁出，补充加入2 mL的原代细胞培养液。培养第28天，组织块迁出的细胞已经基本铺满瓶底形成单层细胞，开始传代培养。

（4）传代培养

第一次传代培养时，将原代培养细胞瓶中的培养基转移到无菌的培养瓶中。用质量比0.25%胰酶（以下简称0.25%胰酶）浸洗原代细胞单层，然后加少许（1 mL）0.25%胰酶室温下消化单层细胞，显微镜下观察细胞变圆情况。轻轻拍打细胞瓶壁使细胞脱落并分散成单个细胞。加入5 mL新鲜传代细胞培养液和5 mL原代细胞培养液，轻轻吹打细胞悬液，按体积1:1进行分瓶，培养瓶放入28℃生化培养箱进行传代培养。每3-5天传代一次，传至第15代时，将传代细胞培养液中胎牛血清含量降低到10%，培养基中不再添加石斑鱼血清和制霉菌素。抗生素浓度为正常使用浓度（100 IU/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素）。

（5）ECFry细胞的冻存和复苏能力

取步骤4中25代单层贴壁细胞，经0.25%胰酶消化后获得单细胞悬液，1000 rpm离心10 min，弃掉上清液。细胞沉淀用4℃预冷的1mL冻存液（L-15培养基含体积比20%胎牛血清和10% DMSO）重悬，细胞悬液转入冻存管。冻存程序为：4℃，30 min；-20℃，2 h；-80℃过夜，隔天转入液氮中长期保存。

冻存30天后对上述冻存细胞进行复苏。从液氮中取出一管细胞，迅速放入37℃水浴中解冻。解冻的细胞悬液1000 rpm、10 min离心收集细胞沉淀，用传代细胞培养液重悬沉淀。取少量细胞悬液用0.4%的台盼蓝染色5 min，用血球计数板计数死活细胞的数目。剩余的细胞悬液转入含5 mL传代细胞培养液的培养瓶28℃培养，观察细胞的贴壁和生长情况。

ECFry细胞冻存30天后细胞存活率为75%，存活细胞能够贴壁生长分裂，细胞形态和增殖能力与冻存前相比无明显差异。本实施例构建的斜带石斑鱼仔鱼的原代细胞迁出部位不同，细胞形态有差异，部分迁出细胞为上皮样的，部分组织迁出细胞为成纤维样的。随着传代次数增加，细胞多以成纤维样为主（图1）。目前传代超过90代，细胞生长状态良好，能够连续稳定增殖传代，命名为斜带石斑鱼仔鱼细胞系（

斜带石斑鱼仔鱼细胞系（

实施例2：不同培养温度以及FBS浓度对ECFry细胞生长的影响

1、不同培养温度对ECFry细胞生长情况的影响。

利用本实施例1第43代ECFry细胞，检测在不同的培养温度下细胞的生长曲线，具体操作如下：分别将4×10

2、不同胎牛血清浓度对细胞生长情况的影响。

利用本实施例1第43代ECFry细胞，细胞计数后，分别将4×10

总体来看，ECFry细胞适宜生长条件为28℃，含10%-20%血清的L-15培养基，为节约成本，从传代10代开始，血清使用浓度为10%。

实施例3：本发明获得的ECFry细胞的染色体核型分析

取上述实施例1中的17代和43代ECFry的细胞于含10%胎牛血清的L15培养基28℃恒温培养箱中贴壁生长48 h，加入终浓度为1 μg/mL的秋水仙素作用6 h，0.25%胰蛋白酶消化后1000 rpm离心10 min回收细胞。75 mM KCl 37℃水浴低渗处理30 min，1000 rpm离心10 min回收细胞沉淀，加入8 mL固定液（甲醇:冰醋酸=3:1）室温固定30 min，重复固定步骤2次。最后一次固定留约150 μl固定液，轻柔吹匀。吸取固定液-细胞悬液，约0.5米高处滴于-20℃预冷的载玻片上，迅速用力将液滴吹散，并室温晾干。将晾干的玻片浸于1倍的姬姆萨染色液（百克赛斯公司：bioseth，货号RS3080）中染色10 min，纯净水洗净染色液，室温晾干。油镜下观察细胞染色体形态，拍照并计算染色体数目。

对实施例1的17代ECFry细胞分别统计了190个分裂相。结果如图3A所示，细胞分裂相中染色体数目多数分布在26-70之间，特征染色体数目为48，染色体形态多为端粒染色体（图3B）。43代细胞分裂相中染色体数目分布在30-64之间，特征性染色体数目为48条。虽然染色体数目分布不均匀，但二倍体染色体数目出现频率是最高的（图3C和3D）。

实施例4：验证ECFry细胞系的外源基因的转染效果

将实施例1中45代的ECFry细胞接种于24孔细胞培养板中过夜培养，细胞培养基为含10%胎牛血清的L15培养基，细胞初始浓度大约为10

结果如图4所示，在转染的ECFry细胞中观察到很强的绿色荧光信号，表明pEGFP-N3成功地被转染进细胞，且CMV启动子可以在细胞内高效启动外源基因表达（图4），提示ECFry细胞系可以用于体外研究外源基因的功能。

实施例5：对本发明获得的ECFry细胞系的病毒感染实验

1、细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）观察

取实施例1的45代的ECFry细胞接种到24孔培养板培养（细胞培养基为含10%胎牛血清的L15培养基，细胞初始浓度大约为2×10

显微镜观察结果如图5A，SGIV感染细胞典型特征为细胞皱缩变圆，变圆的细胞聚集，在细胞单层出现明显的空洞。感染24 h后70%以上的细胞变圆，整个细胞单层形成一种网状，感染36 h细胞单层部分的网状连接断裂。RGNNV感染细胞典型的特征为细胞胞质内出现大小不一的空泡，有些空泡可以融合成大的空泡。随着感染时间的延长，出现空泡的细胞数目增多，感染晚期，感染细胞坏死脱落，在单层细胞形成空洞。

2、感染细胞中病毒基因的转录表达

取实施例1的第45代的ECFry细胞按照步骤1的方法分别感染SGIV和RGNNV，在病毒感染的12 h、24 h和48 h收取细胞，700×

Actin-RT-F：TACGAGCTGCCTGACGGACA（SEQ ID NO.1），

Actin-RT-R：GGCTGTGATCTCCTTCTGCA（SEQ ID NO.2）；

SGIV MCP-RT-F: GCACGCTTCTCTCACCTTCA（SEQ ID NO.3），

SGIV MCP-RT-R：AACGGCAACGGGAGCACTA（SEQ ID NO.4）；

SGIV VP019-RT-F：TCCAAGGGAGAAACTGTAAG（SEQ ID NO.5）；

SGIV VP019-RT-R：GGGGTAAGCGTGAAGAC（SEQ ID NO.6）；

RGNNV CP-RT-F：CAACTGACAACGATCACACCTTC（SEQ ID NO.7），

RGNNV CP-RT-R：CAATCGAACACTCCAGCGACA（SEQ ID NO.8）；

RGNNV RdRp-RT-F：GTGTCCGGAGAGGTTAAGGATG（SEQ ID NO.9），

RGNNV RdRp-RT-R：CTTGAATTGATCAACGGTGAACA（SEQ ID NO.10）。

qPCR结果如图5B，在SGIV和RGNNV感染的细胞中，病毒基因（SGIV MCP、SGIVVP019、RGNNV CP和RGNNV RdRp）的转录水平均随感染时间的延长而逐渐升高，说明病毒在ECFry细胞中增殖。

3、病毒感染细胞的电镜观察

按照步骤1的方法取实施例1的ECFry细胞分别感染SGIV和RGNNV，分别在病毒感染的48 h刮取细胞，2000 rpm离心10 min，细胞沉淀用2.5%戊二醛4℃固定1 h。弃去固定液，PBS漂洗三次，每次5 min；体积比1%锇酸4℃固定1 h；然后乙醇梯度逐级脱水（体积比50%、70%、80%、90%、100%、100%），每级梯度10 min。环氧树脂Epon812浸透包埋。超薄切片机切片后经2% 醋酸双氧铀和柠檬酸铅各染色1 h，最后置于透射电镜（Talos L120C，ThermoFisher Scientific）120KV下观察和CCD记录拍照。

电镜观察结果如图6所示，在SGIV感染的细胞中，细胞核附近的病毒装配区中观察到大量散在分布或呈晶格排列的病毒粒子，且在装配区周围聚集分布结构破坏的线粒体。而在RGNNV感染细胞中，胞浆内可见许多空泡，30 nm大小的球形病毒颗粒聚集分布在空泡的内膜，表明两种石斑鱼病毒可以在ECFry细胞中大量复制、增殖装配。说明ECFry可以用于体外分离病毒，并应用于研究病毒感染的机制及病毒-宿主细胞相互作用。

实施例6：微塑料荧光纳米微球暴露对ECFry细胞的影响

将微塑料荧光纳米微球（100.54±8.03 nm）用高温灭菌PBS溶液稀释到1 mg/mL，震荡混匀后用0.22 μm的滤膜进行过滤，过滤后的荧光纳米微球溶液置于4℃下保存备用。将第50代的ECFry细胞分别接种到24孔板和96孔板中培养过夜（细胞培养基为含10%胎牛血清的L15培养基，细胞初始浓度大约为2×10

显微镜观察结果如图7A，随着荧光纳米微球浓度增大，细胞会出现一定程度的皱缩。此外，细胞中的黑点也逐渐增加。荧光显微镜观察结果显示，荧光纳米微球处理的细胞中，出现荧光信号。且随着荧光纳米微球浓度的增加，细胞中的荧光信号逐渐增强。表明纳米微球能够被内吞进入细胞。细胞活性实验结果表明，与对照组相比，纳米微球的暴露能够降低细胞的活性，并呈浓度依赖性（图7B）。

上述实施例将检测ECFry细胞对微塑料纳米颗粒暴露后生长和形态的影响，结果证实该细胞系能有效的评估微塑料暴露的毒性效应，可以作为检测环境污染物的实验材料，为石斑鱼用于环境污染物的检测提供了一个理想的体外研究体系。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。