一种编码γ-环糊精糖基转移酶突变体的基因及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种编码γ-环糊精糖基转移酶突变体的基因及应用。

背景技术

环糊精(Cyclodextrin)在自然界中主要是由淀粉或淀粉衍生物经过环糊精糖基转移酶的环化反应催化而成的环状低聚糖。常见的环糊精包括α环糊精、β环糊精和γ-环糊精，分别通过α-1,4糖苷键连接6、7和8个葡萄糖单元组成。环糊精分子是一种上宽下窄、两端开口、中空的筒状物。因其具有疏水内部和亲水外部，可以包埋疏水性的化合物，同时能够提升化合物的溶解度和稳定性等，故环糊精被广泛应用在医药、食品和环保等领域。常见的γ-环糊精具有最大的空腔和最高的溶解度，可以包埋许多α环糊精和β环糊精不能包埋的物质。但是由于酶法生产γ-环糊精仍然面临着产率低、γ-环糊精产物专一性差和纯化工艺复杂等问题，导致γ-环糊精的广泛应用受到限制。因此，获得一种高产率、γ-环糊精产物专一性高的γ-环糊精糖基转移酶对于γ-环糊精的生产具有重要的实用价值。

环糊精糖基转移酶(CGTase)属于糖苷水解酶13家族或α-淀粉酶家族。环糊精糖基转移酶有四种酶促反应，即环化、偶合、歧化和水解反应，环糊精糖基转移酶的环化反应是一种分子内转糖基化反应，偶合和歧化反应是分子间转糖基化反应。由于野生菌种遗传背景复杂，已报道的γ-环糊精糖基转移酶存在活力差、γ-环糊精产物专一性差、产率低和稳定性差等问题，不利于γ-环糊精糖基转移酶的工业化应用。通常，酶的高稳定性可以降低酶的消耗和补偿速率。且更稳定的酶可能对反应速率、工艺温度有积极的影响。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种编码γ-环糊精糖基转移酶突变体的基因及应用，所述含有该基因的基因工程菌能够制备γ-环糊精糖基转移酶突变体，获得的γ-环糊精糖基转移酶突变体在制备γ-环糊精时具有更好的专一性、稳定性和产率。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种编码γ-环糊精糖基转移酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种表达所述编码γ-环糊精糖基转移酶突变体的基因的重组表达载体，在初始载体上插入所述编码γ-环糊精糖基转移酶突变体的基因；所述初始载体为pET28a(+)载体。

本发明还提供了所述的重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：

将SEQ ID No.2所示的核苷酸序列连接至pET28a(+)载体上，构建成重组表达载体pET28a(+)/γ-CGTase，采用定点突变试剂盒，以如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，获得重组表达载体。

本发明还提供了一种所述基因编码的γ-环糊精糖基转移酶突变体，将γ-环糊精糖基转移酶第172位的丝氨酸突变为半胱氨酸，将第183位的精氨酸突变为半胱氨酸；所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

本发明还提供了一种表达所述γ-环糊精糖基转移酶突变体的基因工程菌，在大肠杆菌中转入所述重组表达载体。

本发明还提供了所述基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：

将所述的重组表达载体与感受态细胞混合，热激，加入培养基培养，获得菌液，取菌液涂布至培养基中培养，再选取阳性克隆进行培养，获得基因工程菌。

本发明还提供了一种制备γ-环糊精的方法，包括如下步骤：

(1)将所述的基因工程菌接种至培养基中培养，获得菌液；

(2)吸取菌液加入至培养基中培养，加入诱导剂，培养，离心获得菌体；

(3)用洗涤液清洗菌体，低温超声破碎，离心，取上清液，获得粗酶液；

(4)将洗涤液与粗酶液混合，搅拌均匀，依次加入粗酶液和络合剂，过滤，取沉淀，蒸馏，获得γ-环糊精。

优选的，所述诱导剂为IPTG诱导剂，所述洗涤液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，所述络合剂为环十二酮，所述蒸馏的方法为水蒸气蒸馏法。

本发明还提供了所述的基因工程菌在合成γ-环糊精中的应用。

本发明还提供了所述的基因工程菌在制备γ-环糊精糖基转移酶突变体中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过同时将编码γ-环糊精糖基转移酶的基因的第172位的碱基“A”和第183位的碱基“C”均突变为碱基“T”，获得了可编码γ-环糊精糖基转移酶突变体的基因。含有该基因的基因工程菌能够制备获得γ-环糊精产率高、稳定性好、专一性强的γ-环糊精糖基转移酶突变体。本发明通过上述基因编码获得了一种γ-环糊精糖基转移酶突变体，所述突变体的氨基酸序列是同时将γ-环糊精糖基转移酶第172位的丝氨酸突变为半胱氨酸，将第183位的精氨酸突变为半胱氨酸获得的。

附图说明

图1是本发明测得的不同温度下γ-环糊精糖基转移酶及其突变体的相对酶活力；

图2是本发明测得的不同孵育时间下γ-环糊精糖基转移酶及其突变体的相对酶活力；

图3是本发明测得的γ-环糊精糖基转移酶及其突变体在制备γ-环糊精时的产率；

图4是基于高效液相色谱法测得的液相色谱图；

图5是重组表达载体pET28a(+)/γ-CGTase的质粒图谱；

图6是本发明制备的γ-环糊精糖基转移酶合成γ-环糊精催化原理示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种编码γ-环糊精糖基转移酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种表达所述编码γ-环糊精糖基转移酶突变体的基因的重组表达载体，在初始载体上插入所述编码γ-环糊精糖基转移酶突变体的基因；所述初始载体为pET28a(+)载体。

本发明还提供了所述的重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：

将SEQ ID No.2所示的核苷酸序列连接至pET28a(+)载体上，构建成重组表达载体pET28a(+)/γ-CGTase，采用定点突变试剂盒，以如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，获得重组表达载体。

在本发明中，所述SEQ ID No.2所示的核苷酸序列是从γ-环糊精糖基转移酶中提取获得的原始基因序列；所述重组表达载体pET28a(+)/γ-CGTase的质粒图谱如图5所示；所述定点突变试剂盒优选为Fast定点突变试剂盒；所述PCR扩增的条件为：95℃预变性2min，95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸2.5min，共32个循环，最后72℃延伸10min；再将PCR产物在37℃下使用DMT酶消化模板1h，完全消耗模板后获得重组表达载体。所述核苷酸序列如表1所示。

表1核苷酸序列

注：标红字体为突变位点，“-”代表突变碱基。

本发明还提供了一种所述基因编码的γ-环糊精糖基转移酶突变体，将γ-环糊精糖基转移酶第172位的丝氨酸突变为半胱氨酸，将第183位的精氨酸突变为半胱氨酸；所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。在本发明中，所述γ-环糊精糖基转移酶突变体的氨基酸序列如表2所示。

表2氨基酸序列

本发明还提供了一种表达所述γ-环糊精糖基转移酶突变体的基因工程菌，在大肠杆菌中转入所述重组表达载体。

在本发明中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供了所述基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：

将所述的重组表达载体与感受态细胞混合，热激，加入培养基培养，获得菌液，取菌液涂布至培养基中培养，再选取阳性克隆进行培养，获得基因工程菌。

在本发明中，所述感受态细胞为BL21(DE3)感受态细胞(购自北京全式金生物技术股份有限公司)，所述加入感受态细胞悬液后优选的置于冰上静置30～40min，进一步优选为32～38min，更进一步优选为34～36min；所述热激的温度优选为40～45℃，进一步优选为42～44℃，更进一步优选为43℃；所述热激的时间为40～50s，进一步优选为42～48s，更进一步优选为44～46s；所述热激后优选的置于冰上冷却2～3min，进一步优选为2.5min；所述冷却后加入的培养基优选为LB液体培养基，所述LB液体培养基的添加量优选为480～520μL，进一步优选为490～510μL，更进一步优选为500μL；所述在LB液体培养基上培养的温度优选为35～40℃，进一步优选为36～38℃，更进一步优选为37℃；所述在LB液体培养基上培养的时间优选为1～1.5h；所述吸取的菌液的体积优选为90～110μL，进一步优选为95～105μL，更进一步优选为100μL；所述涂布的培养基优选为含有卡那霉素的LB固体培养基，所述卡那霉素的浓度优选为45～55μg/mL，进一步优选为48～52μg/mL，更进一步优选为50μg/mL；所述LB固体培养基的配方为在上述LB液体培养基中每100μL加入2g琼脂粉；所述涂布后的培养方式优选为倒置培养，所述倒置培养的温度优选为35～40℃，进一步优选为36～38℃，更进一步优选为37℃；所述倒置培养的时间优选为10～14h，进一步优选为11～13h，更进一步优选为12h；所述试管为含有卡那霉素的LB试管，所述卡那霉素的浓度优选为45～55μg/mL，进一步优选为48～52μg/mL，更进一步优选为50μg/mL；所述在试管中培养的温度优选为35～40℃，进一步优选为36～38℃，更进一步优选为37℃；所述在试管中培养的转速优选为180～220r/min，进一步优选为190～210r/min，更进一步优选为200r/min；所述在试管中培养的时间优选为10～14h，进一步优选为11～13h，更进一步优选为12h。

本发明还提供了一种制备γ-环糊精的方法，包括如下步骤：

(1)将所述的基因工程菌接种至培养基中培养，获得菌液；

(2)吸取菌液加入至培养基中培养，加入诱导剂，培养，离心获得菌体；

(3)用洗涤液清洗菌体，低温超声破碎，离心，取上清液，获得粗酶液；

(4)将洗涤液与粗酶液混合，搅拌均匀，依次加入粗酶液和络合剂，过滤，取沉淀，蒸馏，获得γ-环糊精。

在本发明中，将所述的基因工程菌接种至培养基中培养，获得菌液。在本发明中，所述培养基为含有卡那霉素的LB培养基，所述卡那霉素的浓度优选为45～55μg/mL，进一步优选为48～52μg/mL，更进一步优选为50μg/mL；所述培养的温度优选为35～40℃，进一步优选为36～38℃，更进一步优选为37℃；所述培养的转速优选为240～260r/min，进一步优选为245～255r/min，更进一步优选为250r/min；所述培养的时间优选为16～18h，进一步优选为16.5～17.5h，更进一步优选为17h；所述LB培养基优选为每升中含有8～10g胰蛋白胨、3～5g酵母浸粉和8～10g氯化钠；进一步优选为每升中含有9g胰蛋白胨、4g酵母浸粉和9g氯化钠。

在本发明中，吸取上述菌液加入至培养基中培养，加入诱导剂，培养，离心获得菌体。在本发明中，所述吸取菌液的体积优选为1.5～2.5ml，进一步优选为2ml；所述培养基优选为TB培养基；所述TB培养基的体积优选为180～220ml，进一步优选为190～210ml，更进一步优选为200ml；所述培养的温度优选为35～40℃，进一步优选为36～38℃，更进一步优选为37℃；所述培养的转速优选为240～260r/min，进一步优选为245～255r/min，更进一步优选为250r/min；所述培养的时间优选为4～5h，进一步优选为4.5h；所述诱导剂优选为IPTG诱导剂，所述IPTG诱导剂的浓度优选为0.0620～0.0630mg/ml，进一步优选为0.0625mg/ml；所述诱导剂诱导培养的温度优选为18～22℃，进一步优选为19～21℃，更进一步优选为20℃；所述诱导剂诱导培养的时间优选为10～14h，进一步优选为11～13h，更进一步优选为12h。所述TB培养基优选为含有10～12g/L胰蛋白胨、22～24g/L酵母粉、3～4g/L甘油、15～17mmol/L磷酸二氢钾、70～72mmol/L磷酸氢二钾；进一步优选为含有11g/L胰蛋白胨、23g/L酵母粉、3.5g/L甘油、16mmol/L磷酸二氢钾、71mmol/L磷酸氢二钾。

在本发明中，获得菌体后，用洗涤液清洗菌体，低温超声破碎，离心，取上清液，获得粗酶液。在本发明中，所述洗涤液优选为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，所述缓冲液的pH值优选为10.0，所述缓冲液的浓度优选为45～55mM，进一步优选为48～52mM，更进一步优选为50mM；所述超声破碎的时间优选为15～20min，进一步优选为16～18min；所述离心的温度优选为3～5℃，进一步优选为4℃；所述离心的转速优选为7500～8500r/min，进一步优选为7800～8200r/min，更进一步优选为8000r/min；所述离心的时间优选为15～20min，进一步优选为16～18min；所述粗酶液中含有的酶活性优选为1～3U/ml，进一步优选为2U/ml。

在本发明中，获得粗酶液后，使用洗涤液配置9～12％(w/v)的淀粉溶液，再以每g淀粉加入1U粗酶液的方式处理淀粉；加入粗酶液后将溶液的温度升至75～85℃再降温至55～65℃，每g淀粉再补加4U酶活以及5％(v/v)乙醇和5％(w/v)络合剂，反应35～40h后，过滤，取沉淀，清洗滤饼后，水蒸气蒸馏至溶液变澄清后继续持续20～25min，浓缩至4.5～5.5ml，4～5℃静置8～10h，冷却结晶得到γ-环糊精粗品。在本发明中，所述淀粉溶液的质量体积浓度优选为10～11％；所述粗酶液的温度优选的升至80℃再降温至60℃；所述络合剂优选为环十二酮；所述反应的时间优选为37～38h；所述水蒸气蒸馏持续的时间优选为22～24h；所述浓缩的体积优选为5ml；所述静置的时间优选为9h。

本发明还提供了所述的基因工程菌在合成γ-环糊精中的应用。

本发明还提供了所述的基因工程菌在制备γ-环糊精糖基转移酶突变体中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1突变引物设计

使用Disulfide by Design 2.0在线软件预测γ-环糊精糖基转移酶潜在的二硫键，根据预测结果得出，将第172位的丝氨酸突变为半胱氨酸，将第183位的精氨酸突变为半胱氨酸可以形成二硫键。因此，采用SnapGene进行定点突变设计，引物设计如表1所示。

实施例2重组表达载体的制备

将如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列连接至pET28a(+)载体(购自北京全式金生物技术股份有限公司)上，构建成重组表达载体pET28a(+)/γ-CGTase，采用Fast定点突变试剂盒(购自北京全式金生物技术股份有限公司)，以如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，将PCR产物在37℃下使用DMT酶(购自北京全式金生物技术股份有限公司)消化模板1h，完全消耗模板后获得重组表达载体。

其中，PCR扩增的条件为：95℃预变性2min，95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸2.5min，共32个循环，最后72℃延伸10min。

实施例3基因工程菌的制备

将实施例2制得的重组表达载体加入50μL冰浴的DMT感受态细胞(购自北京全式金生物技术股份有限公司)悬液中，冰上静置30min，将转化产物置于42℃进行热激45s，迅速置于冰上冷却2min，向管中加入500μL的LB液体培养基，37℃、200r/min培养1h，获得菌液，取100μL菌液涂布至含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基中，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h，挑取单菌落验证为阳性克隆后，使用质粒小提试剂盒(购自北京全式金生物技术股份有限公司)，提取质粒，由南京擎科生物科技有限公司进行测序验证。

测序成功后取5μL的质粒，加入50μL冰浴的BL21(DE3)感受态细胞悬液中，冰上静置30min，将转化产物于42℃热激45s，迅速置于冰上冷却2min，向管中加入500μL的LB液体培养基，37℃、200r/min培养1h，获得菌液，取100μL菌液涂布至含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h，选取阳性克隆接种至含有50μg/ml卡那霉素的LB试管中，37℃、200r/min培养12h，获得基因工程菌。

实施例4γ-环糊精的制备

(1)将实施例3制得的基因工程菌菌液接种至含有浓度为50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，于37℃、250r/min培养16h，获得菌液；

(2)吸取2ml菌液加入至200ml TB培养基中，37℃、250r/min培养4h(即能够获得菌浓度OD

(3)用pH值为10.0的50mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗涤菌体，将重悬菌液于冰浴超声破碎15min，在4℃、8000r/min离心15min，取上清液，获得粗酶液；

(4)使用pH＝10、50mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配置10％(w/v)的豌豆淀粉溶液，再以每g淀粉加入1U粗酶液的方式处理淀粉，加入粗酶液后将溶液的温度升至80℃再降温至60℃，每g淀粉再补加4U酶活以及5％(v/v)乙醇和5％(w/v)环十二酮，反应36h后，过滤，取沉淀，清洗滤饼后，水蒸气蒸馏至溶液变澄清后继续持续20min，浓缩至5.0ml，4℃静置10h，冷却结晶得到γ-环糊精粗品。

试验例1溴甲酚绿法(BCG)测定酶活

可溶性淀粉(1％，w/v)溶解至浓度为50mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中(pH＝10.0)，100℃煮沸加热糊化3min，冷却至50℃；向900μL淀粉溶液中加入由50μL稀释至100μL的酶液，置于50℃反应10min，反应结束后沸水浴10min灭活，冷却至室温后加入50μL盐酸(1M)、100μL溴甲酚绿溶液(5mM)以及2mL 200mM柠檬酸缓冲溶液(pH4.2)，室温下显色20min后，在630nm处检测吸光值(尽量使得吸光值在0-0.5之间，否则对酶液进行稀释重新测量)。以不加酶液的淀粉溶液为对照。按上述条件下，一个单位的酶活性(U)被定义为每分钟生产1mgγ-环糊精的酶的量。

分别在45-70℃下对原始酶及γ-环糊精糖基转移酶突变体进行酶活测定，将最大酶活力定为100％，分别计算相对酶活力。

根据上述结果，将原始酶与突变体置于最适温度下进行孵育，分别在30min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h取样并立即置于冰浴中，然后进行酶活力检测，将未孵育时的酶活力定为100％，分别计不同孵育时间下的残余活性。该酶的热失活半衰期(t

图1的结果显示，γ-环糊精糖基转移酶与突变体的最适反应温度都是60℃；图4结果显示，γ-环糊精糖基转移酶在60℃下孵育5h后已经失活，而突变体5h后仍有28.1％活力，经过计算，突变体的t

试验例2高效液相色谱法检测γ-环糊精的产率

通过高效液相色谱法检测、外标法绘制γ-环糊精标准曲线，计算γ-环糊精的产率。其中，液相检测条件为：酰胺柱，示差检测器，流动相乙腈：水＝65:35(体积比)，流速1mL/min。结果如图3和图4所示。

结果显示，以γ-环糊精糖基转移酶为原料制备γ-环糊精的产率为38.2％，制得的γ-环糊精产物的专一性为92.8％；本发明制得的突变体制备γ-环糊精时的产率为46.5％，制得的γ-环糊精产物的专一性为96.4％。可知，本发明制得的突变体在制备γ-环糊精时，其产率更高、专一性更强。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。