抗肿瘤通关藤醇及其高纯度制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物医药领域的技术，具体是一种抗肿瘤通关藤醇及其高纯度制备方法。

背景技术

通关藤又名通关散、通光藤、乌骨藤、奶浆藤、通天散、龙爪草、下奶藤，为萝藦科植物通关藤Marsdenia tenacissima(Roxb.)Wight et Arn.的干燥藤茎。通关藤为常用中药，始载于《滇南本草》，历史悠久，具有止咳平喘，祛痰，通乳，清热解毒等功效，常用于治疗喘咳痰多，产后乳汁不通，风湿肿痛，疮痈等，应用广泛。现代研究发现通关藤具有显著的抗肿瘤作用，用于治疗原发性肝癌、食管癌和胃癌，亦用于肺癌等肿瘤，效果肯定。

发明内容

本发明针对现有提取技术所得成分均为皂苷类成分、得率较低的不足，提出一种抗肿瘤通关藤醇及其高纯度制备方法。通过将通关藤水煎煮后大孔树脂、硅胶柱层析、HPLC制备分离后，从通关藤中同时制备3种高纯度、具有显著抗肿瘤作用的通关藤醇A(tenacissimol A)、通关藤醇B(tenacissimol B)、通关藤醇C(tenacissimol C)，能够用于通关藤药材的质量评价，以及抗肿瘤药物的制备。该方法具有简便、快速、纯度高、生产成本低等优点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一类通关藤醇类化合物，包括：通关藤醇A(tenacissimol A)、通关藤醇B(tenacissimol B)、通关藤醇C(tenacissimol C)，其化学结构如下所示：

本发明涉及上述通关藤醇类化合物的应用，将其用于制备抗肿瘤药物或用于通关藤药材的鉴定。

本发明涉及上述通关藤醇类化合物的提取方法，通过将萝藦科植物通关藤Marsdenia tenacissima(Roxb.)Wight et Arn.的干燥藤茎水煎煮，水煎液离心、经大孔树脂柱层析后，再经硅胶柱层析、HPLC制备分离后分别收集三个主要色谱峰，即得通关藤醇A精制品、通关藤醇B精制品和通关藤醇C精制品。

所述的大孔树脂柱层析，采用D101型大孔树脂，乙醇溶液作为洗脱剂。

所述的硅胶柱层析，均通过TLC检测并合并主斑点R

所述的提取方法，具体包括：将通关藤粉碎，水煎煮，水煎液经D101大孔树脂柱层析，先用60％乙醇洗脱除杂，然后95％乙醇洗脱，收集95％乙醇洗脱液，减压回收溶剂得通关藤醇浸膏；通关藤醇浸膏进行硅胶柱层析，二氯甲烷洗脱，回收二氯甲烷，弃去提取物；然后二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集洗脱液后进行TLC检测，合并主斑点相同(R

所述的水煎煮，水的用量与药材质量的比例为10:1～20:1，煎煮时间为0.5～1小时，煎煮次数为1～2次。

所述的大孔树脂柱层析，大孔树脂型号为D101，用量为药材质量的1～2倍。除杂质洗脱剂为60％乙醇；然后用95％乙醇洗脱，洗脱剂用量为3～5倍BV(柱体积)。

所述的硅胶柱层析硅胶粒径为200～300目，样量比为1:60～1:100(样品比硅胶，w/w)。所述二氯甲烷洗脱除质方法为先用二氯甲烷洗脱4～6BV，回收二氯甲烷，弃去洗脱物。所述梯度洗脱为二氯甲烷-甲醇比例为39：1、19：1(v/v)，每个梯度洗脱4～6BV，流速1BV/h，0.25BV/流份。收集洗脱液后进行TLC检测，合并主斑点Rf0.2～0.5的流份，减压回收溶剂，得通关藤醇粗品。

所述的HPLC制备分离，所用色谱柱为C

附图说明

图1为通关藤醇A的

图2为通关藤醇B的

图3为通关藤醇C的

具体实施方式

实施例1

本实施例是在以下实施条件和技术要求条件下实施的：

1.通关藤1kg，加入15L水煎煮1h，提取液离心，进行大孔树脂(1kg)柱层析，60％乙醇洗脱3BV，除去杂质；95％乙醇洗脱3BV，回收乙醇得通关藤醇浸膏(4.5g)。

2.取上述通关藤醇浸膏进行硅胶柱层析(270g硅胶)，二氯甲烷洗脱6BV洗脱，回收二氯甲烷，弃去提取物。用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(每个梯度洗脱6个BV)，收集洗脱液。TLC检测，合并主斑点在0.2～0.5的流份，回收溶剂得通关藤醇粗品(331mg)。

3.将通关藤醇粗品进行HPLC分离，分别收集三个主要色谱峰，即得通关藤醇A精制品19mg(纯度95.6％，HPLC法)、通关藤醇B精制品23mg(纯度为97.2％，HPLC法)、通关藤醇C精制品15mg(纯度为96.7％，HPLC法)。

所得成分物理性质及波谱数据如下：

通关藤醇A：白色粉末；

通关藤醇B：白色粉末；

通关藤醇C：白色粉末；

表1通关藤醇

实施例2

本实施例是在以下实施条件和技术要求条件下实施的：

1.通关藤1kg，加入10L水煎煮2次，每次0.5h，合并两次提取液。提取液离心，进行大孔树脂(2kg)柱层析，60％乙醇洗脱5BV，除去杂质；95％乙醇洗脱5BV，回收乙醇得通关藤醇浸膏(6.0g)。

2.取上述通关藤醇浸膏进行硅胶柱层析(600g硅胶)，二氯甲烷洗脱5BV洗脱，回收二氯甲烷，弃去提取物。用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(每个梯度洗脱5个BV)，收集洗脱液。TLC检测，合并主斑点在0.2～0.5的流份，回收溶剂得通关藤醇粗品(410mg)。

3.将通关藤醇粗品进行HPLC分离，分别收集三个主要色谱峰，即得通关藤醇A精制品21mg(纯度96.3％，HPLC法)、通关藤醇B精制品34mg(纯度为95.7％，HPLC法)、通关藤醇C精制品21mg(纯度为97.0％，HPLC法)。

实施例3

本实施例是在以下实施条件和技术要求条件下实施的：

1.通关藤1kg，加入20L水煎煮0.75h，提取液离心，进行大孔树脂(1.5kg)柱层析，60％乙醇洗脱4BV，除去杂质；95％乙醇洗脱4BV，回收乙醇得通关藤醇浸膏(5.2g)。

2.取上述通关藤醇浸膏进行硅胶柱层析400g硅胶)，二氯甲烷洗脱4BV洗脱，回收二氯甲烷，弃去提取物。用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(每个梯度洗脱4个BV)，收集洗脱液。TLC检测，合并主斑点在0.2～0.5的流份，回收溶剂得通关藤醇粗品(376mg)。

3.将通关藤醇粗品进行HPLC分离，分别收集三个主要色谱峰，即得通关藤醇A精制品18mg(纯度96.3％，HPLC法)、通关藤醇B精制品22mg(纯度为95.7％，HPLC法)、通关藤醇C精制品13mg(纯度为97.0％，HPLC法)。

实施例4

本实施例涉及上述一类通关藤醇的抗肿瘤应用，用于抑制A549、Bel 7402细胞的生长，具体检测过程如下：

步骤1)将人肺癌细胞A549、人肝癌细胞Bel-7402接种于含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中培养，间隔24h，换液，传代。取对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化成单个细胞，计数，以培养液稀释为终浓度为1×10

步骤2)当人肺癌细胞A549、人肝癌细胞Bel-7402培养24h之后，小心吸出培养基，分别加入各浓度的药液100μL(每个浓度设5个复孔)，空白对照组加100μL培养液。置37℃、5％CO

所述的各浓度的药液是指：1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0μM。

按下式计算肿瘤细胞生长抑制率：抑制率(％)＝(1-给药组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。在此基础上，采用SPSS计算半数抑制浓度(IC

上述实验平行重复3次，计算平均值

表1通关藤醇抑制肿瘤细胞生长作用

由表1可知，3个通关藤醇类成分均具有显著的细胞毒活性，其显著抑制肿瘤细胞的增殖，其中通关藤醇A的作用与阳性药物(5-氟尿嘧啶)相当。

实施例5

本实施例涉及一种基于上述一类通关藤醇的通关藤快速、定性鉴别方法，具体为：通关藤粉碎，取2g，加入乙酸乙酯50ml超声提取30min，减压回收乙酸乙酯，加入0.5ml甲醇，离心，上清液作为供试品溶液。供试品溶液与三种通关藤醇溶液点于同一硅胶G校上，二氯甲烷-甲醇(19:1)展开，10％硫酸-乙醇加热显色，样品在与通关藤醇相同位置上显相同颜色的斑点。

与现有技术相比，本方法可以同时制备3种新化合物，采用大孔树脂柱层析，去除了大部分水溶性成分的干扰，有效富集了通关藤醇类成分，提高了收率。硅胶柱层析时，先采用二氯甲烷洗脱，进一步去除了脂肪酸、甾醇及脂溶性色素，能简便快速制备通关藤醇。所得通关藤醇经HPLC法检测，纯度超过95％。整个制备过程使用的有机溶剂，以及分离中用到的填料均可反复使用；另一方面，同时制备3种通关藤醇类成分，充分利用了原料及化学试剂，大幅降低了制备成本。

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。