一种分化培养基、利用分化培养基诱导多功能干细胞分化为软骨细胞的方法

技术领域

本申请涉及干细胞技术领域，具体涉及一种分化培养基、利用分化培养基诱导多功能干细胞分化为软骨细胞的方法。

背景技术

软骨(Cartilage)是由软骨细胞和软骨基质组成的骨组织，是指大致形成关节的一部分的组织。软骨细胞(Chondrocyte)具有合成和分泌基质与纤维的功能，起到构成关节软骨并保持其的作用。

软骨一旦受损就很难再生；并且，软骨是无血管组织，不存在用于提供营养的血管，干细胞的迁移受到限制，组织的再生能力降低。因此，为了软骨的再生，正进行多种再生医学研究用于提高软骨的再生能力，如诱导软骨细胞的分化。

目前，曾有文献报道iPSC具有向软骨细胞分化的潜能，但其采用骨形态发生蛋白作为诱导剂，价格昂贵，且操作系统重复性较差，诱导体系过于复杂。因此，需要开发全新的方法，将iPSC细胞分化为全功能的软骨细胞。

发明内容

为了克服现有技术不足，提供一种制作容易，简便易行的方法将iPSC分化为软骨细胞，本申请提供一种分化培养基、利用分化培养基诱导多功能干细胞分化为软骨细胞的方法。

一种分化培养基，以DMEM/F12作为基础培养基，包括以下浓度的组分：0.8-1.6mg/L L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、0.5-1.5mg/L B27、1-3mg/L ITS-X、0.15-0.45mg/L非必须氨基酸、80-100umol/L 2-巯基乙醇、80-120nmol/L TTNPB、7-13umol/L CHIR99021、40-60mg/LL-1-抗坏血酸。

本申请利用特定比例L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、非必须氨基酸、2-巯基乙醇、TTNPB、L-1-抗坏血酸作为分化培养基的原料组分，用于从诱导性多功能干细胞中分化软骨细胞，处理方法操作简单，可以提高分化效率，同时获得高质量、高产率的软骨细胞。

本申请使用的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMAX)与标准L-谷氨酰胺相比，在水溶液中更稳定，不会自发降解。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺可促进细胞逐渐释放氨基肽酶，水解二肽，缓慢释放L-丙氨酸和L-谷氨酰胺到培养基中(图1)。然后，L-谷氨酰胺和L-丙氨酸可以被细胞吸收，并用于蛋白质生产或TCA循环。ITS-X是胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂，胰岛素(Insulin)是由胰岛β细胞分泌的一种双链形式(α,β)的多肽激素，可以促进细胞对葡萄糖和氨基酸的吸收、脂肪的生成、一价阳离子和磷酸盐的转运、蛋白和核酸的合成，并促进细胞增殖。转铁蛋白(Transferrin)是体液中不可缺少的成分，不仅参与铁的运输与代谢，参与呼吸、细胞增殖和免疫系统的调节，还能调节铁离子平衡和能量平衡，更具有抗菌杀菌的保护功能。铁离子是细胞培养中重要的微量元素，但自由的铁离子对细胞有一定的毒性。通过饱和转铁蛋白这种形式，可以减少自由铁离子、氧自由基和过氧化氢的毒性。硒(Selenium)以亚硒酸钠提供是谷胱甘肽过氧化物酶和其他蛋白的一种辅因子，在培养基中用作抗氧化剂。乙醇胺(Ethanolamine)是一种重要的刺激细胞生长的化合物，是磷酯(phosphoglycerides)生物合成的前体，而磷酯在细胞膜和细胞器的结构与功能中发挥重要作用。TTNPB可适用于细胞疗法中的辅助试剂。

发明人在试验过程中发现使用ITS-A(胰岛素-转铁蛋白-硒-丙酮酸添加剂)代替ITS-X，诱导分化效果差。

本申请的发明人发现，将上述原料混合作为分化培养基，从iPSC中分化获得软骨细胞，无需添加细胞因子和生长因子以及生物材料基质如I型胶原蛋白，即可通过施加物理刺激和信号调节，对细胞产生强烈影响；进而可以通过整合素介导的信号通路促进软骨细胞的成骨分化。因此，本申请的技术方案中，利用分化培养基在调节iPSC向软骨细胞的分化中发挥积极作用，简化了操作步骤，能够促进扩大规模或利用生产线进行iPSC向软骨细胞的分化在临床中的应用。

优选地，所述分化培养基包括以下重量份的组分：0.8-1.2mg/L L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、1-1.5mg/L B27、1-2mg/L ITS-X、0.2-0.4mg/L非必须氨基酸、85-95umol/L 2-巯基乙醇、90-110nmol/L TTNPB、9-11umol/L CHIR99021、45-55mg/L L-1-抗坏血酸。

进一步地，所述分化培养基包括以下重量份的组分：1mg/L L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、1mg/L B27、2mg/L ITS-X、0.3mg/L非必须氨基酸、90umol/L 2-巯基乙醇、100nmol/LTTNPB、10umol/L CHIR99021、50mg/L L-1-抗坏血酸。

本申请的发明人发现，分化培养基中的各成分用量对于iPSC中分化获得软骨细胞的效果具有较大的影响，本申请通过多次试验，优化了各原料的用量为上述添加量，提高了分化培养基的使用效果。

优选地，所述分化培养基还包括0.5-1.2mg/L的钠盐。

进一步地，所述钠盐为重量比为5：(1-3)的偏硅酸钠和亚硒酸钠。

在一个具体的实施方案中，所述偏硅酸钠和亚硒酸钠的重量比可以为5：1、5：2、5：3。

在一个具体的实施方案中，所述L-天冬氨酸和L-亮氨酸的重量比还可以为5：(1-2)、5：(2-3)。

经过试验分析可知，本申请选择在分化培养基中添加上述重量比的偏硅酸钠和亚硒酸钠作为钠盐，可以进一步提高诱导多功能干细胞分化为软骨细胞的分化质量和分化效率。

第二方面，本申请提供了上述分化培养基在诱导多功能干细胞分化为软骨细胞中的应用。

第三方面，本申请提供了一种诱导多功能干细胞分化为软骨细胞的方法，利用上述分化培养基诱导多功能干细胞，获得软骨细胞；具体包括以下步骤：

预处理：利用5-15uM的GSK-3抑制剂对iPSC细胞进行预处理；

解离：利用解离液Accutase对iPSC细胞进行消化，解离为分散状态的单个细胞；

接种与分化培养：接种时使用含有10uM Y27632的mTeSR1对细胞在Matrigel包被的孔板上进行定量接种，培养20-28h；吸出原有培养基，加入含有5-15uM GSK-3抑制剂的分化培养基中进行分化培养20-28h；吸出原有培养基，再次加入含有5-15uM GSK-3抑制剂的分化培养基中进行分化培养20-28h；然后吸出原有培养基，加入所述分化培养基中进行分化培养，之后每隔20-28h更换新的分化培养基，至分化培养9d经过消化、解离重悬，获得F0代软骨细胞；

传代培养：将所述F0代软骨细胞进行传代培养，获得成熟的软骨细胞。

单个的、分散状态的iPSC会比集落状态的细胞更容易响应信号刺激，进而分化效率会较高。因此，本申请的技术方案中，使用单个的、分散状态的iPSC细胞来进行分化处理，从而提高分化效率。同时，为了保证单个的、分散状态的细胞的活率，本申请中还使用了GSK-3抑制剂对细胞进行预处理。

优选地，所述GSK-3抑制剂为CHIR99021。

CHIR-99021是氨基嘧啶衍生物，可以激活Wnt/β-catenin信号通路，诱导多功能干细胞的分化；通过抑制糖原合成酶激酶-3活性而促进多功能干细胞的自我更新潜能，并加强β-连环蛋白和c-Myc功能的上调。通过调节转化生长因子β、Notch和丝裂原活化蛋白激酶信号通路而促进诱导多功能干细胞的自我更新，并促进细胞增殖。

优选地所述细胞接种的接种密度为1.5×10

第四方面，本申请提供了利用上述方法制得的软骨细胞。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

本申请的方法中，使用的分化培养基通过以下机理促进分化：一方面，诱导多功能干细胞通过生物物理作用利用分化培养基贴附固定在具有相对高弹性模量高硬度的培养板表面，有利有干细胞向软骨细胞分化。另一方面，分化培养基通过与细胞表面整联蛋白相互作用，促进细胞的黏附、迁移、增殖和分化，尤其是通过激活上皮-间质转化机制来刺激细胞向软骨细胞形态分化。

本申请利用分化培养基，成功优化出一种成本较低、简易高效地将人iPSC分化为软骨细胞的方法；该方法克服了现有技术的不足，不涉及异种胎牛血清，无需胶原包被细胞载体，无需添加小分子化合物及生长因子，无需特殊培养条件，可以简易高效地产生大量适用于临床的iPSC来源的软骨细胞。

利用本申请的方法分化获得的软骨细胞方法简易，获得的软骨细胞纯度高、效率高，9d可获得第一代软骨细胞，无需要复杂操作。成本低。

附图说明

图1为实施例2中细胞分化培养不同时间的形态图。

图2为实施例19中细胞分化培养不同时间的形态图。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本申请的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

制备例

制备例1

制备例1提供了一种分化培养基。

本制备例中分化培养基的制备方法为：根据1L规格的培养基计，分别按照终浓度为1mg/L L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(购自Sigma)、1mg/L B27(购自赛默飞世尔科技)、2mg/LITS-X(购自赛默飞世尔科技)、0.3mg/L非必须氨基酸(购自Sigma)、、90umol/L 2-巯基乙醇(购自Sigma)、100nmol/L TTNPB(购自Sigma)、75nmol/L CHIR99021、50mg/L L-1-抗坏血酸(购自Sigma)、0.8mg/L钠盐(重量比为5：2的偏硅酸钠和亚硒酸钠混合组成)称取各原料，将以上组分充分溶解于950mL基础培养基DMEM/F12中，并调节pH至6.6-7.2，利用无菌去离子水定容至1000mL，然后用孔径为0.22μm的滤膜过滤，即得分化培养基，4℃保存待用。

制备例2-11

制备例2-11分别提供了一种分化培养基。

上述制备例与制备例1的不同之处具体为：分化培养基中各组分的浓度，具体如表1所示。

表1制备例1-11中分化培养基中各组分的用量

上述制备例的分化培养基的制备方法均与制备例1相同。

制备例12-18

制备例12-18分别提供了一种分化培养基。

上述制备例与制备例1的不同之处具体为：

制备例12中：未添加钠盐。

制备例13中：钠盐为丙酮酸钠。

制备例14中：钠盐为亚硒酸钠。

制备例15中：钠盐为偏硅酸钠。

制备例16中：钠盐为重量比为5：2的偏硅酸钠和亚硒酸钠。

制备例17中：钠盐为重量比为5：0.5的偏硅酸钠和亚硒酸钠。

制备例18中：钠盐为重量比为5：3.5的偏硅酸钠和亚硒酸钠。

上述制备例的其余原料及各原料用量和分化培养基的制备方法均与制备例1相同。

制备例19-23

制备例19-23分别提供了一种分化培养基。

上述制备例与制备例1的不同之处具体为：

制备例19中：以等量的L-谷氨酰胺代替L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。

制备例20中：以等量的ITS代替ITS-X。

制备例21中：以等量的ITS-A代替ITS-X。

制备例22中：分化培养基中还包括终浓度为10质量％的胎牛血清(购自Sigma公司)。

制备例23中：分化培养基中还包括终浓度为100nM的地塞米松(购自Sigma，D4902)。

上述制备例的其余原料及各原料用量和分化培养基的制备方法均与制备例1相同。

实施例1

本实施例提供了一种iPSC细胞的培养方法。

本实施例中iPSC细胞为人类诱导多功能干细胞系DYR0100(SCSP-1301，中国科学院细胞库)，mTeSR1(STEM CELL)在Matrigel(corning)包被的孔板上对iPSC细胞进行培养。

诱导步骤之前每天更换mTeSR1培养基以维持iPSC细胞的培养。

实施例2-17

实施例2-17分别提供了一种将iPSC细胞分化为软骨细胞的方法。

上述实施例的不同之处在于：分化培养基的来源不同，具体为：实施例2-17中所使用的分化培养基分别来源于制备例1-9、12-18。

上述实施例中iPSC细胞分化为软骨细胞的方法具体包括以下步骤：

(1)预处理：在分离iPSC细胞之前，在维持培养基(iMedCell，货号为ME-1001000)中添加终浓度为10μM的GSK-3抑制剂CHIR99021，对实施例1提供的iPSC细胞预处理孵育1h；

(2)消化解离：向维持培养基中加入1ml Accutase消化iPSC细胞，在37℃的孵育箱孵育10min，使细胞解离形成分散状态的单个细胞，加入维持培养基(iMedCell，货号为ME-1001000)终止消化；将收集的单个细胞离心(300g，5min)、弃上清、然后用含有10uMCHIR99021的分化培养基重悬细胞；

(3)接种：将解离后的单个细胞以4.0×10

(4)分化培养：吸出原有培养基，更换含有10uM CHIR99021的分化培养基进行正常培养24h，然后吸出原有培养基，加入分化培养基中进行分化培养，之后每隔20-28h更换新的分化培养基，至分化培养9d；经过消化、解离重悬，获得F0代软骨细胞；

(5)F0代软骨细胞的获得：向培养基中加入1ml Accutase消化细胞，解离成单个细胞，加入分化培养基终止消化；将收集的单个细胞离心(300g，5min)、弃上清、然后用分化培养基重悬细胞，收获细胞并标记为P0传代，即分化获得F0代软骨细胞；

(6)传代培养：利用传代培养基(含10％ HPL的DMEM-F12培养基)将F0代软骨细胞进行传代培养进行稳定传代，获得成熟的软骨细胞。

实施例18

实施例18提供了一种将iPSC细胞分化为软骨细胞的方法。

本实施例与实施例2的不同之处在于：接种密度为1.5×10

对比例

对比例1-7

对比例1-7分别提供了一种将iPSC细胞分化为软骨细胞的方法。

上述对比例与实施例2的不同之处在于：分化培养基的来源不同，具体为：对比例1-7中所使用的分化培养基分别来源于制备例10-11、19-23。

对比例8

对比例8提供了一种将iPSC细胞分化为软骨细胞的方法。

本对比例与实施例1的不同之处在于：以ROCK抑制剂Y-27632代替GSK-3抑制剂CHIR99021。

性能检测试验

(1)细胞形貌

检测方法：分别取实施例与对比例中软骨细胞的样品，以1500×g离心15min，去上清；利用＝1：1的Calcein、AM染色工作液(5um)的混合液重悬，37℃培养30min；然后用含490nm激发波长，515nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察软骨细胞。

检测结果：如图1-2所示；图1为实施例2中细胞分化培养不同时间的形态图(a表示分化培养第0d，b表示分化培养第1d，c表示分化培养第3d，d表示分化培养第5d，e表示分化培养第7d，f表示分化培养第9d)；图2为实施例17中分化的软骨细胞的形态图(a表示分化培养第0d，b表示分化培养第1d，c表示分化培养第3d，d表示分化培养第5d，e表示分化培养第7d，f表示分化培养第9d)。

由图1-2可知，利用本申请实施例提供的分化培养基，从诱导性多功能干细胞中进行分化培养第9d时，成功获得软骨细胞，且软骨细胞形态均一。

(2)软骨细胞基因相对表达量检测

诱导培养脂肪干细胞成软骨细胞第3d、7d、14d时，分别取实施例2-18与对比例1-8中的分化第5d、第9d的细胞各3孔，去培养基，PBS清洗2次，按照TRIZOL试剂说明书提取细胞的总RNA，分光光度计测RNA的浓度和纯度。以Oligo Dt为引物，按逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA，以GADPH为内参，实时荧光定量PCR检测软骨标志基因SOX9、ACAN、COL1A1、COL2A1、COL10A1的表达水平。

其中，实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s；重复40个循环。根据计算公式为相对表达量＝2–(Ct检测基因–Ct内参基因)，计算诱导组相对于对照组表达量的倍数＝诱导组相对表达量/对照组相对表达量。

检测结果：如表2所示。

表2软骨细胞基因相对表达量检测结果

结合表2的检测结果，可知，利用本申请提供的分化培养基，对诱导性多功能干细胞进行分化软骨细胞，能够获得高质量、高产率的软骨细胞；分化获得的软骨细胞的相对。

对比例3中利用等量的L-谷氨酰胺代替L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，对比例4-5中利用ITS或者ITS-A代替ITS-X，对比例6-7中在分化培养基中分别添加了胎牛血清和地塞米松，获得的软骨细胞的相关基因表达量均较低，细胞质量较差。

通过对比实施例2-10与对比例1-2的检测结果，可知，分化培养基中各原料的用量对于分化获得的软骨细胞的基因表达量具有较大的影响，本申请合理地控制了各原料的用量，使得分化培养基中各组分协同配合，发挥更优势的作用，获得了高质量的软骨细胞。

通过对比实施例2与实施例11-17的检测结果，当分化培养基中为添加钠盐作为原料时，软骨细胞的基因SOX9、ACAN、COL1A1、COL2A1、COL10A1的表达水平均较低；当选择单独使用丙酮酸钠、亚硒酸钠中的任意一种作为钠盐时，软骨细胞的基因SOX9、ACAN、COL1A1的表达水平较低；当选择单独使用偏硅酸钠，或者联合使用偏硅酸钠和亚硒酸钠作为钠盐时，软骨细胞的基因COL1A1、COL2A1、COL10A1的表达水平较低；当选择联合使用重量比较高或者较低的偏硅酸钠和亚硒酸钠作为钠盐时，软骨细胞的基因COL1A1、COL2A1、COL10A1的表达水平较低；因此，本申请选择了重量比5：(1-3)的偏硅酸钠和亚硒酸钠作为钠盐，可以进一步提高软骨细胞的相关基因的表达水平，进而获得质量较高的软骨细胞。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。