一种核酸分子、载体、毕赤酵母过表达重组HSP47及毕赤酵母高产蛋白表达菌株

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种核酸分子、载体、毕赤酵母过表达重组HSP47及毕赤酵母高产蛋白表达菌株。

背景技术

热休克蛋白47(47kDa,heat shock protein,HSP47)是位于内质网内一种应激蛋白,位于人类染色体的11q13.5，在其他生物中也被命名为J6、gp46、CB48和CBP2等。HSP47与丝氨酸蛋白酶抑制剂家族具有同源性，也可能是一种跨类的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。它能与胶原特异性结合,在哺乳动物细胞内参与原胶原的折叠、装配、修饰、转运等过程。

很多研究表明，分子伴侣(Bip,Hac1,PDI等)共表达能够有效的促进重组蛋白的表达从而获得高产菌株。目前HSP47的研究主要在医疗领域，其在体内的表达与部分疾病相关联，其中包括抗氧化的能力、分子伴侣的作用、对部分信号通路的调控等。但HSP47作为一种胶原特异性分子伴侣在重组蛋白的表达方向，未见进行共表达相关研究。故我们以HSP47为改造点，对GS115菌种进行改造，再利用改造菌种，探究其对多种目标蛋白在毕赤酵母表达体系中的影响。

发明内容

本发明的目的是以人HSP47为改造点，对毕赤酵母菌GS115进行改造，再利用改造菌种，以实现对多种目标蛋白在毕赤酵母表达体系中的高表达。

为了实现上述目标，本发明提供了以下技术方案：

一种核酸分子，包含SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列或该核苷酸序列的互补序列。

同时提供了一种含有上述核酸分子的载体。

还提供了一种基于改造后的人HSP47的毕赤酵母过表达重组人热休克蛋白HSP47，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；该氨基酸序列由前述核酸分子翻译表达。

还提供了一种毕赤酵母表达菌，即将重组质粒pPIC3k-HSP47转化至毕赤酵母菌GS115，获得毕赤酵母重组转化子GS115/pPIC3k-HSP47，该毕赤酵母重组转化子使用氨苄抗性筛选获得毕赤酵母改造表达菌株GS115/pPIC3k-HSP47，将其简约表述为GS115

基于前述毕赤酵母表达菌即以GS115

最后，提供了一种含有前述重组质粒的核酸分子的载体。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明实验结果证明：

改造获得的毕赤酵母表达菌株GS115

经过探索尝试，我们利用HSP47过表达改造的GS115,能够使得目标蛋白的产量增加，极有可能是，HSP47作为机体的应激条件下产生的介质可以增强细胞对外界刺激的抵抗,维持毕赤酵母在培养基中细胞稳态，促进了宿主菌的存活能力，从而促进了目标蛋白的表达，本发明具有极其重要的应用价值。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明：

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：

图1：pPIC3k-HSP47质粒转化子PCR鉴定结果。

图2：GS115/pPIC3k-HSP47重组转化子PCR鉴定结果。

图3：GS115

图4：重组弹性蛋白各菌株表达对比电泳图；其中，M:Maker(26610),泳道1：GS115

图5：GS115

图6：重组酪氨酸酶各菌株表达对比电泳图；其中，M:Maker(26610),泳道1：GS115

图7：GS115

图8：重组人超氧化物歧化酶各菌株表达对比电泳图；其中，M:Maker(26610),泳道1：GS115

图9：GS115

图10：重组III型人源化胶原蛋白各菌株表达对比电泳图；其中，M:Maker(26610),泳道1：GS115

具体实施方式

为了更充分的理解本发明的技术内容，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步介绍和说明；显然，以下所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

对于本领域的技术人员来说，通过阅读本说明书公开的内容，本发明的特征、有益效果和优点将变得显而易见。

除非另外指明，所有百分比、分数和比率都是按本发明组合物的总质量计算的。本文术语“质量含量”可用符号“％”表示。

在本发明中，各组分在组合物和化妆品中的占比相同。

本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由...组成”和“基本上由...组成”。本发明的组合物和方法/工艺可包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组分、步骤或限制项组成。

实施例1.

一、GS115

1.1、pPIC3k-HSP47胞内表达质粒的设计

HSP47作为一种胶原蛋白分子伴侣，可锚定在内质网，促进胶原蛋白的合成及正确折叠。

将SEQ.ID.NO.1所示的人HSP47氨基酸序列C端的内质网滞留信号RDEL需要更换为毕赤酵母的滞留信号HDEL，获取SEQ.ID.NO.2所示的氨基酸序列，完成人HSP47的改造。

按照毕赤酵母的密码子偏爱性，人工选择和优化设计改造后的HSP47的核苷酸序列，在序列的两端直接加入BamH I和EcoR I的酶切位点，全基因化学合成SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列(该核苷酸序列的互补序列如SEQ.ID.NO.4所示。)，得到全基因合成质粒T-HSP47。

利用酶切位点完成pPIC3k-HSP47胞内表达质粒的构建。

引物设计：

HSP47-F:Oligo:5'-GGATCCCGCTCCCTCCTGCTTCTC-3'

HSP47-R:Oligo:5'-GAATTCTAACTCGTCGTGCATCTTG-3'

1.2pPIC3k-HSP47胞内表达质粒的构建

1.2.1物料：

2×Taq PCR Mastermix(天根生化)，T4 DNA Ligase(Thermo)，DH5α感受态细胞(天根生化)，限制性内切酶Fast Digest BamH I、Fast Digest EcoR I，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化)，LB培养基(自配)。

1.2.2设备：

PCR仪(Bio-RAD)，水平电泳装置，离心机，摇床。

1.2.3方法：

1.2.3.1pPIC3k-HSP47目的基因、载体的双酶切

pPIC3k-HSP47的制备，对全基因合成质粒T-HSP47与表达载体pPIC3k进行连接。

目的片段(目的基因片段)和表达载体pPIC3k酶切体系分别如表1-1及表1-2，具体酶切步骤如下：

(1)在干净的PCR管中配制酶切反应体系，分别如表1-1及表1-2：

表1-1：目的片段的限制性酶切体系

表1-2：pPIC3k限制性酶切体系

(2)轻弹管壁,用混悬仪混匀溶液，瞬时离心将溶液集中于管底；

(3)将管放置于37℃水浴中，酶切15min。

(4)酶切步骤后，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并对其按照天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒要求，进行切胶回收。

(5)酶切回收产物(目的片段)与预期片段大小一致，方可直接用于构建表达载体的连接反应。

1.2.3.2酶切产物的连接

为构建重组表达载体(重组质粒)pPIC3k-HSP47，本实验选用Thermo的T4 DNA连接酶，对酶切回收产物以及pPIC3k载体酶切产物进行连接，连接体系如表1-3，具体连接步骤如下：

(1)在干净的PCR管中配制连接反应体系，分别如表1-3：

表1-3：T4连接酶连接体系

(2)轻弹管壁,用混悬仪混匀溶液，瞬时离心将溶液集中于管底；

(3)将T4连接体系的EP管放置22℃恒温连接仪中，连接45min；

(4)完成以上连接步骤后，连接产物可直接用于感受态细菌的转化。

1.2.3.3连接产物的转化

实验使用E.coLi DH5α感受态细胞进行质粒转化，具体的试验步骤如下：

(1)取出1管保存在-80℃冰箱中的DH5α感受态细胞(50μL)，迅速插入冰盒中，待冻住的菌块融化后，于超净工作台中分别加入5μL前述的两种连接产物，用手指轻微拨打管底混匀后，将EP管放置冰盒上静置30min；

(2)将EP管放置于42℃水浴中热激90s，随后迅速放入冰盒中静置3min，此过程应小心操作，尽量避免剧烈晃动，否则影响转化效率；

(3)向EP管中分别加入600μL不含抗生素的无菌LB液体培养基，摇晃混匀后于37℃摇床中以180rpm的转速孵育45分钟；

(4)于超净工作台中分别吸取出约200μL的孵育菌液，均匀涂布于含有50ug/mL氨苄抗生素的LB平板上；

(5)将LB平板倒置放于37℃恒温培养箱中，培养过夜。

1.2.3.4重组阳性转化子的鉴定

挑选长出的菌落，进行菌液PCR鉴定，并对PCR鉴定正确的菌株，送北京擎科生物有限公司测序比对，将比对正确的菌株进行保存，具体的试验步骤如下：

(1)从含有25ug/mL氨苄抗生素的LB平板上挑取长出的阳性转化子，并将菌株编号，接种至5mL含有25ug/mL氨苄抗生素的LB培养基中。

(2)放置摇床上，200rpm，37℃，培养过夜。

(3)第二天，以培养菌液为模板，设计引物HSP47-F，HSP47-R为引物，按表1-4反应体系配制，进行PCR。

表1-4：菌液PCR体系

(4)PCR程序设置：在PCR仪中设置如下程序

1)94℃，5min

2)94℃，30s(解链)

3)60℃，30s(退火)

4)72℃，1min(延伸)

5)步骤2至步骤4重复30个循环

6)72℃，5min

7)4℃，Forever

(5)将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果，初步确定pPIC3k-HSP471#-7#均为阳性转化子，将其对应菌液，按菌液与50％甘油1:1比例，制备甘油管，-20℃保存。

(6)从甘油管种子中，分装100μL菌液，送北京擎科生物有限公司测序。测序结果与设计序列比对，结果如图1所示，表明pPIC3k-HSP47 1#-7#均正确。

1.2GS115

1.2.1物料：

质粒小提中量试剂盒(天根生化)，通用型DNA纯化回收试剂盒(天根生化)，限制性内切酶Fast Digest Sac I(Thermo)。

1.2.2设备：

PCR仪(Bio-RAD)，水平电泳装置，离心机，摇床。

1.2.3方法：

1.2.3.1重组质粒的中量提取

(1)吸取需电转质粒菌液10uL，接种于20mL含50ug/mL氨苄抗生素的LB培养基中。

(2)取15mL菌液，室温，12000rpm，离心1min收集菌体。

(3)按天根质粒小提中量试剂盒要求，提取重组质粒pPIC3k-HSP47。最终用300μL灭菌ddH

1.2.3.2重组质粒线性化

对于中量提取的重组质粒pPIC3k-HSP47进行线性化，用Sal I线性化，线性化反应体系如下表1-5：

表1-5：pPIC3k-HSP47质粒线性化反应体系

(1)取灭菌的2mL离心管，按表1-5配置反应体系，混匀，瞬时离心。

(2)将溶液按400μL/管分装4管，在37℃水浴锅酶切30分钟。

(3)1％琼脂糖凝胶电泳线性化质粒。

(4)用天根通用型DNA纯化回收试剂盒(DP214-02)要求，洗脱时每管用50μLddH

(5)将4管质粒合并，共200μL，45℃烘烤干燥浓缩质粒至10-20μL。-20℃保存。

1.2.3.3GS115毕赤酵母感受态制备

(1)挑取毕赤酵母菌株GS115单菌落，接种于5mL无菌YPD培养基中，29℃，200rpm，8小时。

(2)8小时后，吸取400uL培养液，接种于100mL无菌YPD培养基中，29℃，200rpm，摇床培养过夜。

(3)次日，吸取培养液1mL，稀释至10mL，以ddH

(4)取培养液50mL，4℃，3000rpm，5min离心弃上清。

(5)用30mL已灭菌的冰预冷的ddH

(6)重复步骤5两次。

(7)用30mL已灭菌的冰预冷的1M D-山梨醇，将细胞悬浮，4℃，3000rpm，5min，离心弃上清。

(8)重复步骤7两次。

(9)取400uL已灭菌的冰预冷的1M D-山梨醇重悬细胞，即为感受态细胞。

(10)按90μL/支EP管，分装感受态细胞，备用。

1.2.3.4线性化质粒的电转化及筛选

(1)75％乙醇浸泡2mm规格电击杯30min。

(2)无水乙醇冲洗3遍，超净工作台晾干。

(3)10uL线性化质粒加入到90uL感受态细胞中，混匀，再将100uL混合物转至2mm规格电击杯中，冰上预冷10min。

(4)设置电击参数，酵母参数为：电压2000V，电容25uF，电阻200Ω。

(5)电击杯迅速擦干外部水分，放入电击槽，电击。

(6)电击完毕后，立即加入1.5mL 1M冰预冷D-山梨醇，混匀后，吸出菌液至1.5mL无菌离心管中。

(7)涂含有MD平板筛选，每块平板200uL菌液，无菌涂布器轻轻涂开，29℃，倒置培养3～4天，转接YPD平板继续培养。

1.3毕赤酵母重组转化子的鉴定

1.3.1物料：

酵母菌落PCR试剂盒(南京瑞源生物)。

1.3.2设备

PCR仪(Bio-RAD)，离心机，微波炉，-80℃冰箱。

1.3.3方法：

1.3.3.1转化子基因组DNA提取

(1)根据酵母菌落PCR试剂盒要求，挑取对YPD平板中生长的GS115/pPIC3k-HSP47转化子，取EP管置于离心管架上，加入4uL裂解液。

(2)牙签挑取YPD平板中生长菌落于EP管中，混匀，室温，4000rpm离心1min，弃上清。

(3)98℃热水，加热10min。

(4)冷却，待用。

1.3.3.2转化子基因组PCR鉴定

以提取的基因组DNA为模板，以插入的目标基因片段引物进行PCR鉴定，扩增出目的片段的菌株为阳性克隆。PCR反应体系如下表1-6：

表1-6：GS115/pPIC3k-HSP47基因组DNA PCR反应体系

(1)取灭菌的EP管，按表1-6配置反应体系，混匀，瞬时离心。

(2)PCR程序设置：在PCR仪中设置如下程序

1)94℃，5min

2)94℃，30s(解链)

3)60℃，30s(退火)

4)72℃，1min(延伸)

5)步骤2至步骤4重复30个循环

6)72℃，5min

7)4℃，Forever

(3)根据PCR结果，初步确定阳性转化子，用其对应菌株，进行摇瓶表达。平板放至-4℃保存。

1.3.3.3结果：GS115/pPIC3k-HSP47重组转化子结果1#-12#均成功获得阳性结果，表明pPIC3k-HSP47成功转入，详细结果如图2所示。保存菌种GS115/pPIC3k-HSP47，1#-4#，作为表达菌株，将该菌种命名为GS115

实施例2.重组高产弹性蛋白GS115

2.1重组弹性蛋白毕赤酵母菌株的简介

筛选天然人弹性蛋白中VGVAPG肽段进行重复拼接，以毕赤酵母为宿主菌，对肽段进行串联表达。按照毕赤酵母的密码子偏爱性，人工设计弹性蛋白的核酸序列，全基因合成质粒pPICZaA-TE66，实验室初期，直接将质粒转入GS115菌株，构建完成重组质粒GS115/pPICZaA-TE66，发现其表达量不好，故使用改造的GS115

鉴定引物：

TE66-F:Oligo:5'-GTTGGTGTCGCTCCAGGAGTAGGT-3'

TE66-R:Oligo:5'-ACCTGGAGCTACTCCAACTCCAGGT-3'

重组弹性蛋白氨基酸序列，见SEQ.ID.NO.5。蛋白质分子量为:22.69KDa，等电点:11.82。

2.2GS115

具体过程与1.2项GS115

2.3重组酵母转化子的鉴定

2.3.1物料：

酵母菌落PCR试剂盒(南京瑞源生物)。

2.3.2设备

PCR仪(Bio-RAD)，离心机，微波炉，-80℃冰箱。

2.3.3方法：

2.3.3.1转化子基因组DNA提取

(1)根据酵母菌落PCR试剂盒要求，挑取对YPD平板中生长的GS115

(2)牙签挑取YPD平板中生长菌落于EP管中，混匀，室温，4000rpm离心1min，弃上清。

(3)98℃热水，加热10min。

(4)冷却，待用。

2.3.3.2转化子基因组PCR鉴定

以提取的基因组DNA为模板，以插入的目标基因片段引物进行PCR鉴定，扩增出目的片段的菌株为阳性克隆。PCR反应体系如下表2-1：

表2-1：GS115

(1)取灭菌的EP管，按表2-1配置反应体系，混匀，瞬时离心。

(2)PCR程序设置：在PCR仪中设置如下程序

1)94℃，5min

2)94℃，30s(解链)

3)60℃，30s(退火)

4)72℃，1min(延伸)

5)步骤2至步骤4重复30个循环

6)72℃，5min

7)4℃，Forever

(4)根据PCR结果，初步确定阳性转化子，用其对应菌株，进行摇瓶表达。平板放至-4℃保存。

2.3.3.3结果：GS115

2.4重组弹性蛋白菌种摇瓶表达

2.4.1物料：

GS115

2.4.2设备：摇床

2.4.3方法：

(1)挑取阳性克隆单菌落，接种于含有30mL BMGY培养基的250mL三角瓶中，29℃，225rpm，摇床培养60小时。

(2)50mL离心管编号，将BMGY培养液倒入离心管中，室温，3000rpm离心5min收集摇瓶菌体。

(3)加入30mL灭菌双蒸水，重悬菌体。室温，3000rpm离心5min收菌体。

(4)重复步骤3两次。

(5)室温，3000rpm离心5min收菌体，加入30mL BMMY培养基重悬菌体，将30mL混匀的BMMY培养液倒入250mL三角瓶中，29℃，225rpm摇床培养。

(6)24小时时补充甲醇300μL。

(7)48小时时补充甲醇300μL。

(8)72小时时补充甲醇300μL。

(9)96小时时，收集摇瓶上清，-20℃储存。

(10)SDS-PAGE电泳检测摇瓶结果，初步确认目标蛋白表达结果。

2.5结果：

我们选择了对照菌株GS115

表2-2：重组高产菌株表达量比较

结果表明，泳道1GS115

实施例3.重组高产酪氨酸酶GS115

3.1酪氨酸酶毕赤酵母菌株的简介

选择巨大芽孢杆菌酪氨酸酶序列，以毕赤酵母为宿主菌，对目标蛋白进行发酵表达。按照毕赤酵母的密码子偏爱性，人工设计酪氨酸酶的核酸序列，全基因合成pPICZaA-TYR质粒构建，实验室初期，直接将质粒转入GS115菌株，构建完成GS115/pPICZaA-TYR，发现其表达量不好，故使用改造的GS115

鉴定引物：

TYR-F:Oligo:5'-CATATGTCCAACAAATATCGCGTGC-3'

TYR-R:Oligo:5'-GCTGCTGCGTTTGCTTTTGCG-3'

酪氨酸酶氨基酸序列，见SEQ.ID.NO.6。蛋白质分子量为:34.42KDa，等电点:9.56。

3.2GS115

具体过程与1.2项GS115

3.3重组酵母转化子的鉴定

3.3.1物料：

酵母菌落PCR试剂盒(南京瑞源生物)。

3.3.2设备

PCR仪(Bio-RAD)，离心机，微波炉，-80℃冰箱。

3.3.3方法：

3.3.3.1转化子基因组DNA提取

(1)根据酵母菌落PCR试剂盒要求，挑取对YPD平板中生长的GS115

(2)牙签挑取YPD平板中生长菌落于EP管中，混匀，室温，4000rpm离心1min，弃上清。

(3)98℃热水，加热10min。

(4)冷却，待用。

3.3.3.2转化子基因组PCR鉴定

以提取的基因组DNA为模板，以插入的目标基因片段引物进行PCR鉴定，扩增出目的片段的菌株为阳性克隆。PCR反应体系如下表3-1：

表3-1：GS115

(1)取灭菌的EP管，按表3-1配置反应体系，混匀，瞬时离心。

(2)PCR程序设置：在PCR仪中设置如下程序

1)94℃，5min

2)94℃，30s(解链)

3)60℃，30s(退火)

4)72℃，1min(延伸)

5)步骤2至步骤4重复30个循环

6)72℃，5min

7)4℃，Forever

(5)根据PCR结果，初步确定阳性转化子，用其对应菌株，进行摇瓶表达。平板放至-4℃保存。

3.3.3.3结果：GS115

3.4重组酪氨酸酶摇瓶表达

3.4.1物料：

GS115

3.4.2设备：摇床

3.4.3方法：

(1)挑取阳性克隆单菌落，接种于含有30mL BMGY培养基的250mL三角瓶中，29℃，225rpm，摇床培养60小时。

(2)50mL离心管编号，将BMGY培养液倒入离心管中，室温，3000rpm离心5min收集摇瓶菌体。

(3)加入30mL灭菌双蒸水，重悬菌体。室温，3000rpm离心5min收菌体。

(4)重复步骤3两次。

(5)室温，3000rpm离心5min收菌体，加入30mL BMMY培养基重悬菌体，将30mL混匀的BMMY培养液倒入250mL三角瓶中，29℃，225rpm摇床培养。

(6)24小时时补充甲醇300μL。

(7)48小时时补充甲醇300μL。

(8)72小时时补充甲醇300μL。

(9)96小时时，收集摇瓶上清，-20℃储存。

(11)SDS-PAGE电泳检测摇瓶结果，初步确认目标蛋白表达结果。

3.5结果：

我们选择了对照菌株GS115

表3-2：重组高产菌株表达量比较

结果表明，泳道1GS115

实施例4.重组高产人超氧化物歧化酶GS115

4.1人超氧化物歧化酶毕赤酵母设计

选择人超氧化物歧化酶序列，以毕赤酵母为宿主菌，对目标进行发酵表达。按照毕赤酵母的密码子偏爱性，人工设计人超氧化物歧化酶的核酸序列，完成质粒pPIC9K-SOD的构建，转入毕赤酵母宿主细胞实现目的蛋白的表达，获得GS115/pPIC9K-SOD表达菌株。

鉴定引物：

SOD-F:Oligo:5'-CTCGAGAAAAGAGAGGCTGCGACGA-3'

SOD-R:Oligo:5'-GCGGCCGCTTATTGGGCGATCCCAATT-3'

人超氧化歧化酶序列，见SEQ.ID.NO.7。蛋白质分子量为:15.81KDa，等电点:6.07。

4.2GS115

具体过程与1.2项GS115

4.3重组酵母转化子的鉴定

4.3.1物料：

酵母菌落PCR试剂盒(南京瑞源生物)。

4.3.2设备

PCR仪(Bio-RAD)，离心机，微波炉，-80℃冰箱。

4.3.3方法：

4.3.3.1转化子基因组DNA提取

(1)根据酵母菌落PCR试剂盒要求，挑取对YPD平板中生长的重组转化子GS115

(2)牙签挑取YPD平板中生长菌落于EP管中，混匀，室温，4000rpm离心1min，弃上清。

(3)98℃热水，加热10min。

(4)冷却，待用。

4.3.3.2转化子基因组PCR鉴定

以提取的基因组DNA为模板，以插入的目标基因片段引物进行PCR鉴定，扩增出目的片段的菌株为阳性克隆。PCR反应体系如下表4-1：

表4-1：GS115

(1)取灭菌的EP管，按表4-1配置反应体系，混匀，瞬时离心。

(2)PCR程序设置：在PCR仪中设置如下程序

1)94℃，5min

2)94℃，30s(解链)

3)60℃，30s(退火)

4)72℃，1min(延伸)

5)步骤2至步骤4重复30个循环

6)72℃，5min

7)4℃，Forever

(6)根据PCR结果，初步确定阳性转化子，用其对应菌株，进行摇瓶表达。平板放至-4℃保存。

4.3.3.3结果：GS115

4.4重组人超氧化物歧化酶摇瓶表达

4.4.1物料：

GS115

4.4.2设备：摇床

4.4.3方法：

(1)挑取阳性克隆单菌落，接种于含有30mL BMGY培养基的250mL三角瓶中，29℃，225rpm，摇床培养60小时。

(2)50mL离心管编号，将BMGY培养液倒入离心管中，室温，3000rpm离心5min收集摇瓶菌体。

(3)加入30mL灭菌双蒸水，重悬菌体。室温，3000rpm离心5min收菌体。

(4)重复步骤3两次。

(5)室温，3000rpm离心5min收菌体，加入30mL BMMY培养基重悬菌体，将30mL混匀的BMMY培养液倒入250mL三角瓶中，29℃，225rpm摇床培养。

(6)24小时时补充甲醇300μL。

(7)48小时时补充甲醇300μL。

(8)72小时时补充甲醇300μL。

(9)96小时时，收集摇瓶上清，-20℃储存。

(12)SDS-PAGE电泳检测摇瓶结果，初步确认目标蛋白表达结果。

4.5结果：

我们选择了对照菌株GS115

表4-2：重组高产菌株表达量比较

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结果表明，泳道1GS115

实施例5.重组高产III型人源化胶原蛋白GS115

5.1人源化胶原蛋白毕赤酵母设计

筛选天然人III型胶原蛋白中稳定性好、亲水性高的肽段进行拼接，以毕赤酵母为宿主菌，对肽段进行串联表达。按照毕赤酵母的密码子偏爱性，人工设计III型胶原蛋白的核酸序列，完成质粒pPICZaA-3colb的构建，转入毕赤酵母宿主细胞实现目的蛋白的表达，获得GS115

鉴定引物：

3colb-F:Oligo:5'-GGTTCTCCAGGTGGTCCAGGTT-3'

3colb-R:Oligo:5'-CTTACCTTGTGGACCTGGTGGA-3'

III型胶原蛋白氨基酸序列，见SEQ.ID.NO.8。蛋白质分子量为:58.64KDa，等电点:8.72。

5.2GS115

具体过程与1.2项GS115

5.3重组酵母转化子的鉴定

5.3.1物料：

酵母菌落PCR试剂盒(南京瑞源生物)。

5.3.2设备

PCR仪(Bio-RAD)，离心机，。

5.3.3方法：

5.3.3.1转化子基因组DNA提取

(1)根据酵母菌落PCR试剂盒要求，挑取对YPD平板中生长的GS115

(2)牙签挑取YPD平板中生长菌落于EP管中，混匀，室温，4000rpm离心1min，弃上清。

(3)98℃热水，加热10min。

(4)冷却，待用。

5.3.3.2转化子基因组PCR鉴定

以提取的基因组DNA为模板，以插入的目标基因片段引物进行PCR鉴定，扩增出目的片段的菌株为阳性克隆。PCR反应体系如下表5-1：

表5-1：GS115

(1)取灭菌的EP管，按表5-1配置反应体系，混匀，瞬时离心。

(2)PCR程序设置：在PCR仪中设置如下程序

1)94℃，5min

2)94℃，30s(解链)

3)60℃，30s(退火)

4)72℃，1min(延伸)

5)步骤2至步骤4重复30个循环

6)72℃，5min

7)4℃，Forever

(7)根据PCR结果，初步确定阳性转化子，用其对应菌株，进行摇瓶表达。平板放至-4℃保存。

5.3.3.3结果：GS115

5.4重组人超氧化物歧化酶摇瓶表达

5.4.1物料：

GS115

5.4.2设备：摇床

5.4.3方法：

(1)挑取阳性克隆单菌落，接种于含有30mL BMGY培养基的250mL三角瓶中，29℃，225rpm，摇床培养60小时。

(2)50mL离心管编号，将BMGY培养液倒入离心管中，室温，3000rpm离心5min收集摇瓶菌体。

(3)加入30mL灭菌双蒸水，重悬菌体。室温，3000rpm离心5min收菌体。

(4)重复步骤3两次。

(5)室温，3000rpm离心5min收菌体，加入30mL BMMY培养基重悬菌体，将30mL混匀的BMMY培养液倒入250mL三角瓶中，29℃，225rpm摇床培养。

(6)24小时时补充甲醇300μL。

(7)48小时时补充甲醇300μL。

(8)72小时时补充甲醇300μL。

(9)96小时时，收集摇瓶上清，-20℃储存。

(13)SDS-PAGE电泳检测摇瓶结果，初步确认目标蛋白表达结果。

5.5结果：

我们选择了对照菌株GS115

表5-2：重组高产菌株表达量比较

结果表明，泳道1GS115

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