妊娠期糖尿病的诊断标志物及其应用

技术领域

本申请涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种妊娠期糖尿病的诊断标志物及其应用。

背景技术

妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus，GDM)是指是指孕妇在妊娠期首次发生不同程度的糖耐量受损。GDM是一种常见的妊娠并发征，在发病过程中以糖代谢紊乱、高血糖、高胰岛素血症和胰岛素抵抗为特征。孕期不同严重程度的高血糖严重威胁着母子两代长期的健康效应。妊娠期糖尿病增加了不良妊娠结局风险，不仅是孕妇后期代谢疾病发生的风险因素,也是出生后儿童糖脂代谢异常和神经发育障碍宫内危险因素。根据国际糖尿病联合会最新的数据统计，2019年全球大约有15.8％孕妇(20-49岁)在怀孕期间出现不同形式的高血糖，其中大约83.6％被诊断为妊娠期糖尿病。根据IADPSG发布的GDM诊断标准，前瞻性队列研究观察到中国GDM发病率为12.8％。妊娠期糖尿病已经成为重要的公共卫生问题。因此寻找妊娠期糖尿病的危险因素，前移孕期血糖异常预防关口，对指导优生优育和提高人口生存质量具有重要意义。迄今为止，GDM的发生机制研究还不是不很清楚，也没有见到关于GDM特异性靶点的研究报道，且用于GDM治疗药物也有限。GDM直接给个人带来严重的健康威胁，同时，GDM后代也面临着极大的健康挑战；也给家庭和社会带来了沉重的经济负担。因此，为了提高人口健康素质，深入研究GDM发病机理，寻找预防、诊断和治疗GDM的潜在分子靶点已是刻不容缓。

RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB Ligand，核因子κB受体活化因子配体)是肿瘤坏死因子超家族成员，与其同源受体RANK(receptor activator ofnuclear factor-κB，核因子κB受体活化因子，也称为TNFRSF11a)结合后，是NF-κB的有效刺激因子。RANKL作为TNF超家族成员之一，调节了许多过程，如：血糖代谢、细胞死亡和坏死、免疫监视和宿主防御以及骨吸收等，RANKL/RANK系统在人肝脏组织和胰腺β细胞中表达。目前没有报道证明其与妊娠期糖尿病有关系。

发明内容

本申请提供了一种妊娠期糖尿病的诊断标志物及其应用，以解决现有技术中没有妊娠期糖尿病显著标志物以及治疗药物的技术问题。

第一方面，本申请提供了一种妊娠期糖尿病的诊断标志物，包括低于正常表达水平的RANKL基因或RANKL蛋白。

可选的，当所述RANKL基因转录水平或者RANKL蛋白表达水平降低时，受试者处于妊娠期糖尿病。

第二方面，本发明提供了一种筛查或辅助筛查妊娠期糖尿病的试剂，所述试剂包括检测RANKL基因或RANKL蛋白的药剂。

第三方面，本发明提供了一种评价或辅助评价妊娠期糖尿病的试剂，所述试剂包括检测RANKL基因或RANKL蛋白的药剂。

第四方面，本发明提供了RANKL在制备预防或治疗妊娠期糖尿病的靶向药物或药物组合物中的应用。

可选的，所述靶向药物或药物组合物含有效量的RANKL蛋白或RANKL基因。

可选的，所述RANKL蛋白包括RANKL重组蛋白、修饰的RANKL蛋白、RANKL多肽中的至少一种。

可选的，所述RANKL基因包括带有RANKL基因序列的小分子化合物、RNA、DNA以及RNA和DNA的表达载体。

可选的，所述靶向药物或药物组合物含有RANKL受体蛋白及其激动剂。

可选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料、赋形剂、载体和溶剂中的至少一种。

本发明提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本发明提供了一种妊娠期糖尿病的诊断标志物及其应用以及RANKL在制备预防或治疗妊娠期糖尿病的药物或药物组合物中的应用，通过试验发现RANKL的表达水平与妊娠期糖尿病有极大的关系，当处于妊娠期糖尿病时，RANKL的表达水平明显较低；额外补充RANKL蛋白也能有效调节血糖，改善妊娠期血糖平衡状态，证明RANKL基因或RANKL蛋白对妊娠期糖尿病有一定的治疗效果，故本发明提供了RANKL基因或RANKL蛋白作为妊娠期糖尿病的诊断标志物以及治疗的新思路。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例1提供的GDM小鼠模型中不同妊娠时期小鼠血清中的RANKL分泌水平，其中NP：未怀孕，GD(Gestational days)：妊娠天数，IPGTT:腹腔糖耐量实验；

图2为实施例1中的正常喂养的妊娠小鼠和高脂饮食组的妊娠小鼠在妊娠16天时腹腔葡萄糖耐量试验结果，其中，chow：正常饮食组，HFD：高脂饮食组；

图3为实施例1中正常喂养的妊娠小鼠和高脂饮食组的妊娠小鼠在妊娠18天时RANKL分泌水平，图中：chow：正常饮食组，HFD：高脂饮食组；*p<0.005，**p<0.001，**p<0.0001；

图4为本申请实施例2提供的动物干预试验中，正常喂养、高脂饮食对照组以及高脂饮食干预组的小鼠分别在妊娠16天的糖耐量结果；

图5为图4的量化处理结果，AUC：线下曲线面积；

图6为正常喂养、高脂饮食对照组以及高脂饮食干预组的小鼠分别在妊娠17天的空腹血糖结果，FBG：空腹血糖，*p<0.05。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本申请的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本申请范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。

在本申请中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上”和“下”具体为附图中的图面方向。另外，在本申请说明书的描述中，术语“包括”“包含”等是指“包括但不限于”。在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。在本文中，“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。在本文中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“至少一种”、“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。

除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

第一方面，本申请基于妊娠期糖尿病期间RANKL基因或RANKL蛋白表达水平出现偏差，故提供了一种妊娠期糖尿病的诊断标志物，所述诊断标志物包括低于正常表达水平的RANKL基因或RANKL蛋白，比如RANKL基因或RANKL蛋白的表达水平明显降低时，可以判读其为妊娠期糖尿病。

在一些实施方式中，当所述RANKL基因转录水平或者RANKL蛋白表达水平降低时，受试者处于妊娠期糖尿病。

基于同一个发明构思，第二方面，本发明还提供了一种筛查或辅助筛查妊娠期糖尿病的试剂，所述试剂包括检测RANKL基因或RANKL蛋白的药剂，以此来筛查或者辅助筛查妊娠期糖尿病。

该试剂是基于上述诊断标志物来实现，其具体原理以及组成可参照第一方面中提供的实施例，由于该试剂采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。

基于同一个发明构思，第三方面，本发明提供了一种评价或辅助评价妊娠期糖尿病的试剂，所述试剂包括检测RANKL基因或RANKL蛋白的药剂，以此来评价或辅助评价妊娠期糖尿病。

该试剂是基于上述诊断标志物来实现，其具体原理以及组成可参照第一方面中提供的实施例，由于该试剂采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。

第四方面，由于RANKL基因或RANKL蛋白与妊娠期糖尿病有所关联，基于同一个发明构思，本发明还提供了RANKL在制备预防或治疗妊娠期糖尿病的靶向药物或药物组合物中的应用。

在一些实施方式中，所述靶向药物或药物组合物含有效量的RANKL蛋白或RANKL基因。

在一些实施方式中，所述RANKL蛋白包括RANKL重组蛋白、修饰的RANKL蛋白、RANKL多肽中的至少一种。

在一些实施方式中，所述RANKL基因包括带有RANKL基因序列的小分子化合物、RNA、DNA以及RNA和DNA的表达载体。

在一些实施方式中，所述靶向药物或药物组合物含有RANKL受体蛋白及其激动剂。

在一些实施方式中，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料、赋形剂、载体和溶剂中的至少一种。

下面结合具体的实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1

为了证明RANKL能够作为妊娠期糖尿病的诊断标志物，本实施例提供了一种动物试验用于建立GDM小鼠模型，首先是将7～8周龄的雌性ICR(CD-1)小鼠和10～15周龄的雄性ICR(CD-1)小鼠分别置于温度22.0±1℃、湿度40～60％、光照/暗循环12小时、可自由获取新鲜食物和水的环境中，驯化1周。然后将雌性小鼠与有生育能力的雄性小鼠交配，分别进行妊娠(GD1＝阴道栓塞日)。

怀孕的老鼠被分成两组:正常饲料喂养组和高脂饲料喂养组(45％卡路里脂肪，35％卡路里碳水化合物和20％卡路里蛋白质)。

妊娠过程中，分别在怀孕前(NP)，妊娠第9天(GD9)，妊娠第12天(GD12)，妊娠第15天(GD15)，妊娠第18天(GD18)取孕鼠血清待测，得到不同妊娠时期小鼠血清中的RANKL分泌水平，结果如图1所示。由图1中的结果可以知晓，孕期小鼠血清中的RANKL分泌水平高于未怀孕的小鼠血清水平，且随着孕期的增加，分泌水平上升。

此外，在妊娠16天，分别对两组小鼠进行腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)，结果显示如图2所示，从图中可确认，相较于正常饮食喂养组，高脂饮食喂养组孕鼠出现显著的糖耐损伤，证明GDM小鼠模型构建成功。

在妊娠18天，对两组孕鼠的血清RANKL水平再次进行测试，结果显示，高脂饮食诱导的类GDM小鼠模型中，相对与正常组，高脂饮食组孕鼠血清RANKL水平显著降低，结果如图3所示。由图3中可知，正常饲料喂养组的孕鼠的RANKL平均值为(149.1±8.589pg/mL)，而高脂饲料喂养组RANKL平均值为(131.9±9.397pg/mL)，降低幅度超过10％。

综上所述，随着妊娠期的增加，RANKL分泌水平会逐渐升高，但是一旦出现长期的高脂饮食导致的妊娠糖尿病患者，其RANKL分泌水平会明显低于正常妊娠者，故由此可以将RANKL基因或者RANKL蛋白作为妊娠糖尿病的诊断标志物，用于预防或筛查妊娠期糖尿病。

实施例2

为了证明RANKL蛋白或RANKL基因能够改善孕期血糖平衡，有效治疗妊娠期糖尿病，本实施例提供一种RANKL动物干预实验，试验过程如下：

将7～8周龄的雌性ICR(CD-1)小鼠和10～15周龄的雄性ICR(CD-1)小鼠分别置于温度22.0±1℃、湿度40～60％、光照/暗循环12小时、可自由获取新鲜食物和水的环境中，驯化1周。

将雌性小鼠与有生育能力的雄性小鼠交配，分别进行妊娠(GD1＝阴道栓塞日)。怀孕的老鼠被分成两组:正常饲料喂养组和高脂饲料喂养组(45％卡路里脂肪，35％卡路里碳水化合物和20％卡路里蛋白质)，将高脂饲料喂养的妊娠小鼠再分为两组，得到三组孕鼠：

chow-saline组：正常饮食腹腔注射生理盐水，注射量为1ug/kg(RANKL/体重)；

HFD-saline组：高脂饮食腹腔注射生理盐水，注射量为1ug/kg(RANKL/体重)；

HFD-msRANKL组：高脂饮食腹腔注射小鼠来源的重组蛋白RANKL，注射量为1ug/kg(RANKL/体重)；

从GD4至GD18，每隔1天给HFD-msRANKL组的孕鼠腹腔注射1次RANKL重组蛋白作为干预组，其他两组注射等量生理盐水作为对照，并检测血糖指标。

在妊娠16天时，分别对三组孕鼠进行腹腔糖耐量试验，结果如图4和图5所示。由图4中的曲线以及图5中的柱状图可以知晓，高脂饮食能够导致妊娠糖耐量损伤，但是腹腔注射重组蛋白RANKL后可以明显改善糖耐量。

在妊娠17天时，对各组孕鼠进行空腹血糖检测，结果如图6所示。由图6中的柱状图显示结果可以知晓，高脂饮食能够导致妊娠糖血糖升高，腹腔注射重组蛋白RANKL后可以明显改善空腹血糖。

综上所述，RANKL蛋白可以有效调节孕期的血糖平衡，将其应用于制备治疗妊娠期糖尿病的药物中完全具有可行性。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。