一种可用于骨缺损修复的脱钙骨、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及植骨修复的医疗器械领域，具体涉及一种可用于骨缺损修复的脱钙骨及其制备方法。

背景技术

骨骼的损伤缺陷可能会因为疾病、创伤等其他因素影响引起。形成骨骼缺陷后要及时防止空腔与软组织的相互渗透并要加速骨骼的形成，此时可以使用一些性质稳定的颗粒形式的固体填充材料。颗粒形式的填充材料可用于小空间损伤，因为在小空间周围骨骼没有或者发生非常有限的移动时，损伤部位才会愈合。同时填充材料是否有孔会影响细胞的内向生长和增殖、血管形成和细胞粘附过程。

中国专利(公开号：CN116212114A)公开了一种脱钙骨基质的制备方法，该方法于传统的脱钙试剂中添加糖类和多元醇类蛋白保护剂，虽然能较好的保留材料中生物活性成分，但相对复杂的工艺及异丙醇、丙酮等溶剂存在一定的毒性或易制毒性，并且制备时间长高达48h，限制其进一步的扩大生产。

因此，本发明中提出了一种可用于骨缺损修复的脱钙骨的制备方法，本方法制得的脱钙骨，生物相容性好、免疫排斥反应小，同时保留的多孔胶原蛋白结构有利于促进血管形成及骨髓间充质干细胞的粘附，另外，该制备方法较现有方法脱脂、脱细胞等操作时间较短，更适合工业化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于骨缺损修复的脱钙骨的制备方法，该方法制得的脱钙骨，生物相容性好、免疫排斥反应小，同时保留的多孔胶原蛋白结构有利于促进血管形成及骨髓间充质干细胞的粘附，另外，该制备方法较现有方法脱脂、脱细胞等操作时间较短，更适合工业化生产。

本发明提供了如下的技术方案：

一种可用于骨缺损修复的脱钙骨的制备方法，具体步骤包括如下：

步骤S1.脱脂：采用牛松质骨为原料，切割成骨块后，室温下用氢氧化钠和碳酸钠的混合溶液浸泡，结束后用纯化水多次冲洗；

步骤S2.消毒：室温下用过氧乙酸和乙醇的混合溶液浸泡，结束后用纯化水多次清洗；

步骤S3.脱细胞：室温下用胰酶溶液浸泡处理，结束后用纯化水多次冲洗；

步骤S4.消毒：室温下用十二烷基硫酸钠、过氧乙酸和乙醇的混合溶液浸泡，结束后用纯化水多次清洗；

步骤S5.脱钙：室温下用脱钙液浸泡，结束后用纯化水多次冲洗；

步骤S6.干燥：在冷冻干燥机下冷冻干燥。

作为一种可用于骨缺损修复的脱钙骨的制备方法的优选技术方案，在步骤S1中，所述氢氧化钠浓度为0.5～2.5vol％，浸泡处理时间为2～10小时。

作为一种可用于骨缺损修复的脱钙骨的制备方法的优选技术方案，在步骤S2中，所述过氧乙酸和乙醇的混合溶液为0.2～0.6vol％过氧乙酸和12～32vol％乙醇的混合溶液，浸泡处理时间为1～8小时。

作为一种可用于骨缺损修复的脱钙骨的制备方法的优选技术方案，在步骤S3中，所述胰酶溶液浓度为0.05～0.3vol％，浸泡处理时间为2～48小时。

作为一种可用于骨缺损修复的脱钙骨的制备方法的优选技术方案，在步骤S4中，所述十二烷基硫酸钠、过氧乙酸和乙醇的混合溶液为0.2～0.6vol％过氧乙酸、12～32vol％乙醇以及0.05～0.5g/L十二烷基硫酸钠的混合溶液，浸泡处理时间为0.1～2小时。

作为一种可用于骨缺损修复的脱钙骨的制备方法的优选技术方案，在步骤S5中，所述脱钙液为浓度为0.5～2.5vol％的盐酸溶液，浸泡处理时间为4～20小时。

作为一种可用于骨缺损修复的脱钙骨的制备方法的优选技术方案，在步骤S6中，所述冷冻干燥为在-20℃条件下，真空冷冻干燥机下冷冻干燥12～48小时。

本发明的另一个发明点是：所述制备方法制备出可用于骨缺损修复的脱钙骨，所述脱钙骨的生物相容性好，免疫排斥反应小、安全性高，不会影响细胞的内向生长和增殖，保留的胶原蛋白和骨材料本身的多孔状结构还可以促进血管形成和细胞粘附过程。

本发明的有益效果是：本发明采用牛松质骨作为原材料，经切割、脱脂、灭活、脱细胞、灭病毒、脱钙、灭菌处理，冻干保存，本方法制得的脱钙骨，生物相容性好、免疫排斥反应小，同时保留的多孔胶原蛋白结构有利于促进血管形成及骨髓间充质干细胞的粘附，另外，该制备方法较现有方法脱脂、脱细胞等操作时间较短，更适合工业化生产。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是按照实施例5制备出的脱钙骨的照片；

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

测试方法：

1.细胞毒检测：参照《GB/T16886.5-2017》中的方法，采用溶剂浸提法检测细胞毒性大小；细胞阳性参照样品为ZDEC-PU和ZDBC-PU，细胞毒性阴性参照样品为高密度聚乙烯；三种参照样品均购买于日本食品药品安全中心(批号依次为：A-091K，B-101K以及C-042)。

2.孔隙率检测：采用Skyscan 1074HR型Micro-CT对脱钙骨样品进行扫描，再利用Micro-CT的CTAN软件对三维重构后脱钙骨的孔隙率进行测量分析。

3.脂肪含量检测：样品的脂肪含量用酸水解法测定。

4.细胞残留检测：样品的细胞残留使用细胞计数器计数。

5.脱钙程度检测：样品的脱钙程度用等离子发射光谱分析法测定。

6.样品的蛋白含量通过相应的试剂盒进行测试。

实施例1

步骤S1.脱脂：取一根牛骨，去除密质骨、软骨等附着组织，剩余松质骨部分使用大量纯化水清洗，将其内部血污及油脂冲洗掉，然后将冲洗干净的松质骨部分切割成1*1*2cm的颗粒；室温下用0.5vol％、1vol％、1.5vol％、2vol％以及2.5vol％氢氧化钠和2vol％碳酸钠的混合溶液浸泡处理2h、4h、6h、8h以及10h，期间确保骨颗粒被溶液浸没，结束后用纯化水多次冲洗；

步骤S2.消毒：在室温下用0.4vol％过氧乙酸和24vol％乙醇的混合溶液浸泡2小时，期间确保骨颗粒被溶液浸没，灭活结束后，用纯化水多次清洗；

步骤S3.脱细胞：在室温下用0.1vol％的胰酶溶液浸泡处理24小时(12小时更换酶液一次)，期间确保骨颗粒被溶液浸没，脱细胞结束后，用纯化水多次冲洗；

步骤S4.消毒：室温下用0.3g/L十二烷基硫酸钠、0.3vol％过氧乙酸和32vol％乙醇的混合溶液浸泡1h，结束后用纯化水多次清洗；

步骤S5.脱钙：室温下用1vol％盐酸浸泡8小时，期间确保骨颗粒被溶液浸没，脱钙结束后，用纯化水多次冲洗；

步骤S6.干燥：在-20℃条件下，真空冷冻干燥机下冷冻干燥24小时。

实验数据：

步骤2中制备样品的脂肪含量测试结果见表1；

表1实施例1制备样品的实验数据

表1为实施例1制备样品的实验数据，实验编号1至5样品通过氢氧化钠和碳酸钠的混合溶液浸泡2至10小时，当浸泡时间达到6小时之后，样品的脂肪含量逐渐趋于平稳；实验编号6至10样品在室温下用0.5vol％、1vol％、1.5vol％、2vol％以及2.5vol％氢氧化钠和2vol％碳酸钠的混合溶液浸泡处理6h，随着氢氧化钠的浓度逐渐升高，样品处理之后的脂肪含量逐渐降低，但是，当氢氧化钠的浓度逐渐升高至2vol％时，样品会出现明显的腐蚀情况；通过实验编号8、11以及12可以看出，当采用单一组份的脱脂剂(氢氧化钠或碳酸钠)的脱脂效果明显不如混合溶剂(氢氧化钠和碳酸钠)，从而可以看出氢氧化钠和碳酸钠对样品的脱脂具有协同增强的作用。

实施例2

步骤S1.脱脂：取一根牛骨，去除密质骨、软骨等附着组织，剩余松质骨部分使用大量纯化水清洗，将其内部血污及油脂冲洗掉，然后将冲洗干净的松质骨部分切割成1*1*2cm的颗粒；室温下用1.5vol％氢氧化钠和2vol％碳酸钠的混合溶液浸泡处理6h，期间确保骨颗粒被溶液浸没，结束后用纯化水多次冲洗

步骤S2.消毒：在室温下用0.4vol％过氧乙酸和24vol％乙醇的混合溶液浸泡2小时，期间确保骨颗粒被溶液浸没，灭活结束后，用纯化水多次清洗；

步骤S3.脱细胞：在室温下用0.05vol％、0.1vol％、0.15vol％、0.20vol％、0.25vol％以及0.30vol％的胰酶溶液浸泡处理4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时、28小时、32小时、36小时、40小时、44小时以及48小时，当浸泡时间超过12小时，更换酶液一次，期间确保骨颗粒被溶液浸没，脱细胞结束后，用纯化水多次冲洗；

步骤S4.消毒：室温下用0.3g/L十二烷基硫酸钠、0.3vol％过氧乙酸和32vol％乙醇的混合溶液浸泡1h，结束后用纯化水多次清洗；

步骤S5.脱钙：室温下用1vol％盐酸浸泡8小时，期间确保骨颗粒被溶液浸没，脱钙结束后，用纯化水多次冲洗；

步骤S6.干燥：在-20℃条件下，真空冷冻干燥机下冷冻干燥24小时。

实验数据：

步骤3中制备样品的脱细胞程度见表2；

表2为步骤3中制备样品的脱细胞程度数据

表2为步骤3中制备样品的脱细胞程度数据，从实验编号13至24可以看出，胰酶溶液浓度为0.15vol％，随着浸泡时间的延长，脱细胞程度逐渐增大，当浸泡时间为24h时，胰酶溶液脱步骤3中制备样品的脱细胞程度达到99.99％，继续延长浸泡时间，胰酶溶液对步骤3中制备样品的脱细胞程度基本维持在99.99％；从实验编号25至30可以看出，浸泡时间为24小时，随着胰酶溶液浓度逐渐增大，胰酶溶液对步骤3中制备样品的脱细胞程度逐渐达到99.99％，然后随着胰酶溶液浓度增大，脱细胞程度维持在99.99％，然而，胰酶溶液浓度增大会带来牛骨颗粒出现明显的腐蚀的现象。

实施例3

步骤S1.脱脂：取一根牛骨，去除密质骨、软骨等附着组织，剩余松质骨部分使用大量纯化水清洗，将其内部血污及油脂冲洗掉，然后将冲洗干净的松质骨部分切割成1*1*2cm的颗粒；室温下用1.5vol％氢氧化钠和2vol％碳酸钠的混合溶液浸泡处理6h，期间确保骨颗粒被溶液浸没，结束后用纯化水多次冲洗

步骤S2.消毒：在室温下用0.4vol％过氧乙酸和24vol％乙醇的混合溶液浸泡2小时，期间确保骨颗粒被溶液浸没，灭活结束后，用纯化水多次清洗；

步骤S3.脱细胞：在室温下用0.15vol％的胰酶溶液浸泡处理24小时，当浸泡时间超过12小时，更换酶液一次，期间确保骨颗粒被溶液浸没，脱细胞结束后，用纯化水多次冲洗；

步骤S4.消毒：室温下用0.2vol％、0.3vol％、0.4vol％、0.5vol％以及0.6vol％过氧乙酸、0.05g/L、0.10g/L、0.15g/L、0.20g/L、0.25g/L、0.30g/L、0.35g/L、0.40g/L、0.45g/L、0.50g/L十二烷基硫酸钠和12vol％、16vol％、20vol％、24vol％、28vol％以及32vol％乙醇的混合溶液浸泡1h，结束后用纯化水多次清洗；

步骤S5.脱钙：室温下用1vol％盐酸浸泡8小时，期间确保骨颗粒被溶液浸没，脱钙结束后，用纯化水多次冲洗；

步骤S6.干燥：在-20℃条件下，真空冷冻干燥机下冷冻干燥24小时。

实验数据：

步骤4中制备样品的消毒之后细胞残留量见表3；

表3为步骤S4制备样品的消毒之后细胞残留量

表3为步骤S4制备样品的消毒之后细胞残留量，从实验编号31至36号可以看出，随着过氧乙酸浓度的增加，步骤S4消毒之后的牛骨颗粒的细胞含量残留逐渐降低，当十二烷基硫酸钠过氧乙酸浓度增加至0.4vol％时，步骤S4消毒之后的牛骨颗粒的细胞含量残留达到0；从实验编号37至45号可以看出，随着十二烷基硫酸钠浓度的增加，步骤S4消毒之后的牛骨颗粒的细胞含量残留逐渐降低，当十二烷基硫酸钠浓度增加至0.25g/L时，步骤S4消毒之后的牛骨颗粒的细胞含量残留达到0；从实验编号46至51号可以看出，随着乙醇浓度的增加，步骤S4消毒之后的牛骨颗粒的细胞含量残留逐渐降低，当乙醇浓度增加至20vol％时，步骤S4消毒之后的牛骨颗粒的细胞含量残留达到0。

实施例4

步骤S1.脱脂：取一根牛骨，去除密质骨、软骨等附着组织，剩余松质骨部分使用大量纯化水清洗，将其内部血污及油脂冲洗掉，然后将冲洗干净的松质骨部分切割成1*1*2cm的颗粒；室温下用1.5vol％氢氧化钠和2vol％碳酸钠的混合溶液浸泡处理6h，期间确保骨颗粒被溶液浸没，结束后用纯化水多次冲洗

步骤S2.消毒：在室温下用0.4vol％过氧乙酸和24vol％乙醇的混合溶液浸泡2小时，期间确保骨颗粒被溶液浸没，灭活结束后，用纯化水多次清洗；

步骤S3.脱细胞：在室温下用0.15vol％的胰酶溶液浸泡处理24小时，当浸泡时间超过12小时，更换酶液一次，期间确保骨颗粒被溶液浸没，脱细胞结束后，用纯化水多次冲洗；

步骤S4.消毒：室温下用0.4g/L十二烷基硫酸钠、0.25g/L过氧乙酸和20vol％乙醇的混合溶液浸泡1h，结束后用纯化水多次清洗；

步骤S5.脱钙：室温下用0.5vol％、1vol％、1.5vol％、2vol％以及2.5vol％盐酸浸泡4小时、8小时、12小时、16小时以及20小时，期间确保骨颗粒被溶液浸没，脱钙结束后，用纯化水多次冲洗；

步骤S6.干燥：在-20℃条件下，真空冷冻干燥机下冷冻干燥24小时。

实验数据：

步骤S5中制备样品的孔隙率和蛋白含量见表4；

表4为步骤S5制备样品的孔隙率和蛋白含量；

表4为步骤S5制备样品的孔隙率和蛋白含量，从图中的数据可看出，浸泡时间为8小时，盐酸浓度逐渐增大，脱钙骨样品的孔隙率增大至78％±8.42，再随着盐酸浓度逐渐增大，脱钙骨样品的孔隙率变化不大，然而，当盐酸浓度超过1.5vol％时，脱钙骨的蛋白含量显著降低，表明盐酸的浓度对脱钙骨中生长因子等活性物质有影响；盐酸浓度为1.5vol％时，随着浸泡时间的延长，脱钙骨样品的孔隙率增大至78％±8.42，再随着盐酸浓度逐渐增大，脱钙骨样品的孔隙率变化不大，然而，当浸泡时间超过8小时时，脱钙骨的蛋白含量显著降低，表明浸泡时间对脱钙骨中生长因子等活性物质有影响。

实施例5

通过上述实验可以得知用于骨缺损修复的脱钙骨的最佳工艺为：步骤S1.脱脂：取一根牛骨，去除密质骨、软骨等附着组织，剩余松质骨部分使用大量纯化水清洗，将其内部血污及油脂冲洗掉，然后将冲洗干净的松质骨部分切割成1*1*2cm的颗粒；室温下用1.5vol％氢氧化钠和2vol％碳酸钠的混合溶液浸泡处理6h，期间确保骨颗粒被溶液浸没，结束后用纯化水多次冲洗

步骤S2.消毒：在室温下用0.4vol％过氧乙酸和24vol％乙醇的混合溶液浸泡2小时，期间确保骨颗粒被溶液浸没，灭活结束后，用纯化水多次清洗；

步骤S3.脱细胞：在室温下用0.15vol％的胰酶溶液浸泡处理24小时(12小时更换酶液一次)，期间确保骨颗粒被溶液浸没，脱细胞结束后，用纯化水多次冲洗；

步骤S4.消毒：室温下用0.4g/L十二烷基硫酸钠、0.25vol％过氧乙酸和20vol％乙醇的混合溶液浸泡1h，结束后用纯化水多次清洗；

步骤S5.脱钙：室温下用1.5vol％盐酸浸泡8小时，期间确保骨颗粒被溶液浸没，脱钙结束后，用纯化水多次冲洗；

步骤S6.干燥：在-20℃条件下，真空冷冻干燥机下冷冻干燥24小时。

实验数据：

步骤5中制备样品的细胞毒性见表5；

步骤6中制备样品的图片，如图1：

表5为实施例5获得样品细胞毒性分级

从图1和表5中可以看出，通过本申请的制备工艺可以制备出孔隙率高达78％±8.42的脱钙骨，并且脱钙骨的毒性分级为1级。

实施例6

热源实验：实验步骤：在36℃条件下，将实施例5制备的多孔脱钙骨浸泡在生理盐水中24小时，获得脱钙骨浸提液，再将脱钙骨浸提液静脉注射到新西兰大白兔体内，实时监测大白兔的体温3h，每0.5小时监测下大白兔，其监测温度如下表6。

表5为热源实验数据

溶血试验：将2ml的新西兰大白兔的血液加入含有2％(w/v)草酸钾溶液的10ml离心管中，混匀，备用；取1ml离心管中混匀的血液，向其中加入生理盐水稀释，混匀，备用；将脱钙骨浸提液分别加入到3个10ml离心管中，每个管5ml；同时，设置阳性对照组：3个加入5ml去离子水的10ml离心管；设置阴性对照组：3个加入5ml生理盐水的10ml离心管；将9个离心管放置于36℃条件下预热，分别向9个离心管中加入稀释的草酸钾溶液，继续孵育1h；取出离心管进行离心，采用分光光度法测量各个离心管的吸光度值。

表6为脱钙骨的溶血率测定结果

表5为热源实验数据，4只新西兰大白兔的体温分别升高0.97℃、-0.02℃、-0.49℃以及1.19℃，平均升温0.4℃，温度变化很小，可以判定该脱钙骨无致热性；表6为脱钙骨的溶血率测定结果，脱钙骨浸提液的溶血率为0.44％，远低于5％，从而证明该脱钙骨具有优良的生物相容性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。