一种利用有孢汉逊酵母HO-1发酵制备的再造烟叶

技术领域

本发明属于烟草制备技术领域，涉及造纸法制备再造烟叶技术，具体的涉及一种利用有孢汉逊酵母HO-1发酵制备的再造烟叶。

背景技术

仙人掌有孢汉逊酵母(Hansen iaspora opunt iae)在分类学上属于真核生物原界，真菌界，子囊菌门，酵母亚门，酵母纲，酵母目，酵母科，有孢汉逊酵母属。仙人掌有孢汉逊酵母是一种非酿酒酵母，可从天然采收的葡萄等浆果中分离出来，具有生产乙醇的能力并可导致浆果的腐败，还能够保护植物，避免真菌病害。

造纸法再造烟叶的制造是目前烟草行业中的重要技术，在卷烟中添加适量的再造烟叶，一方面可以最大限度地节省烟草原料，有效降低卷烟成本；另一方面可以在一定程度上使卷烟的物理性能和化学成分按人们的意愿或要求得到调整和改善，有效降低卷烟中的焦油量和其他有害物质，稳定卷烟产品质量，从而有助于卷烟内在品质的提高，是减少和改善烟草不良成分的一项重要技术措施。而鉴于造纸法再造烟叶是利用烟草物质(烟梗、烟末、碎烟片等)为主体原料，经过水提、浓缩后，固体部分加工成片基，液体部分形成浓缩液(即再造烟草浓缩液)，进一步配比成涂布液涂布在片基上，形成的烟草制品。在形成浓缩液的过程中，一些大分子物质溶于水，被保留下来，增加了浓缩液的粘度，影响涂布率，且属于吸食杂气前体物；浓缩液中的香味成分由于沸点较低，挥发损失较多，降低了造纸法再造烟叶的吸食品质，导致了再造烟叶与天然烟叶相比香气质不足。

为提升再造烟叶的香气质，研究者在生产工艺和外源添加香精香料方面进行了诸多尝试，如朱红琴等研究了再造烟叶干燥过程的干燥时间和温度对致香成分的影响(“干燥温度和时间对造纸法再造烟叶致香成分的影响”,朱红琴等，《河南农业大学学报》)；宁勇等在再造烟叶中添加沉香成分用于烟叶提香(“沉香成分在造纸法再造烟叶中的应用研究”，宁勇等，《林产工业》)，上述方法对于再造烟叶香气质的保留和改善能够起到一定效果，但对于再造烟叶本源性的香气质不佳的问题改善较小。

研究表明微生物发酵技术在不同烟草制品的增香方面均具有潜在的应用前景，例如杜飞等从茅台酒酒糟和茯砖茶筛选出产香酵母和产香曲霉，两者以绿茶末为原料发酵的产物具有茶香、酒香、蜜甜香及特殊香味，对烟草制品的感官品质改善明显(“两种产香微生物分离鉴定及其发酵液增香烟草研究”，杜飞等，《山地农业生物学报》)；叶建斌等利用红茶菌发酵烟草浸提液，获得了特色酸香型烟草浸膏(“红茶菌发酵制备特色酸香型烟草浸膏”，叶建斌等，《食品与生物技术学报》)。

可见，开发适合烟草制品增香的微生物菌种对于改善烟草浓缩液香气质不足的缺陷，最终达到改良再造烟叶品质具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用有孢汉逊酵母HO-1发酵制备的再造烟叶的技术，通过特定有孢汉逊酵母的选择，通过仙人掌有孢汉逊酵母HO-1发酵再造烟草浓缩液，从而获得有效增加酯类、醇类和酮类等烟草关键香味物质的效果，达到提质增香的目的，可有效提高再造烟叶的品质。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用有孢汉逊酵母HO-1发酵制备的再造烟叶，所述再造烟叶由造纸法制得，具体为采用仙人掌有孢汉逊酵母HO-1制备的种子液发酵再造烟草浓缩液制得；所述仙人掌有孢汉逊酵母HO-1，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其分类命名为仙人掌有孢汉逊酵母Hansen iaspora opunt iae，已于2023年07月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28023，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

优选的，所述仙人掌有孢汉逊酵母HO-1种子液的制备步骤如下：

将仙人掌有孢汉逊酵母HO-1单菌落接种到YPD液体培养基中，在温度25-35℃，pH3-5,转速为200r/min的摇床中培养24h，得种子液。

优选的，所述发酵的具体操作为：调节仙人掌有孢汉逊酵母HO-1种子液OD600＝1，以1:5的体积比接种至80％浓度梯度的再造烟草浓缩液中，25℃、pH4条件下，发酵24h。

优选的，所述80％浓度梯度的再造烟草浓缩液由再造烟叶浓缩液、YPD液体培养基和水按体积比8:1:1混合后制得。

优选的，所述YPD液体培养基的成分为：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，溶剂为水。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过特定有孢汉逊酵母的选择，将仙人掌有孢汉逊酵母HO-1扩增制备成种子液后，发酵再造烟草浓缩液制备造纸法再造烟叶时，可有效增加酯类、醇类、酮类和杂环及其他等烟草关键香味物质，提高其评吸效果。由于本发明可在短时间内，以较低成本和较高效率较好改善烟草的吸食品质，加上其操作流程较为简便，因而使得本申请在卷烟制备领域表现出较好的应用价值和应用前景。

附图说明

图1为仙人掌有孢汉逊酵母HO-1的平板划线下的菌体形态图；

图2为仙人掌有孢汉逊酵母HO-1的40倍显微镜形态图；

图3为有孢汉逊酵母系统发育树构建图；

图4为仙人掌有孢汉逊酵母HO-1最佳生长温度和培养基pH的确定结果图，其中A为初始浓度OD600＝0.2的菌体在不同温度下培养24h后的菌体浓度统计图，B为初始浓度OD600＝0.2的菌体在不同pH下培养24h后的菌体浓度统计图；

图5为不同稀释浓度的再造烟叶浓缩液经仙人掌有孢汉逊酵母HO-1发酵后的致香成分含量及种类变化图，红色曲线为发酵后，黑色曲线为发酵前，其中图5A为40％浓度的再造烟叶浓缩液，图5B为60％浓度的再造烟叶浓缩液，图5C为80％浓度的再造烟叶浓缩液，图5D为未经稀释的100％浓度再造烟叶浓缩液；

图6为仙人掌有孢汉逊酵母HO-1在最佳条件下，发酵80％稀释浓度的再造烟叶浓缩液的致香物质变化图，其中CK为未接种仙人掌有孢汉逊酵母HO-1组，HO-1为接种仙人掌有孢汉逊酵母HO-1组。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例所涉及的试剂均为市售渠道采购，未提及的方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。

YPD液体培养基配方：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，溶剂为水。

实施例1仙人掌有孢汉逊酵母HO-1的鉴定：

1、菌株的分离与培养：

该菌株来源于山东平度葡萄生产园的巨峰葡萄，具体获取方法为：

称取100g葡萄，加入30ml灭菌的生理盐水，常温下，200rpm摇床振荡培养5min，用无菌枪头吸500μl溶液至YPD培养基，涂布后，30℃培养过夜，挑选形态为圆形菌落、不透明的乳白色、边缘光滑的单个菌落，于3ml YPD液体培养基中，30℃恒温培养24h。

2、菌株的筛选与鉴定：

用接种环蘸取培养后的菌液，在YPD培养平板上进行画线，生长48h后观察菌体形态(见图1)。将OD600为0.2的菌液取100μl接入3ml YPD培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h，吸取菌液滴至载玻片并制成压片，于40倍物镜下观察菌体细胞形态，观察到细胞呈现不同形态，单细胞多以卵圆形为主，但有部分细胞头尾相接形成杆状(见图2)。

YPD液体培养结束后，由青岛蔚来生物科技有限公司进行序列测定，该菌株的26SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。测序结果与NCBI核酸序列数据库中的序列进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息，即为鉴定结果。基于邻位相接法，构建系统发育树进行种属见进化关系分析(见图3)，确定其为仙人掌有孢汉逊酵母Hanseniaspora opuntiae，命名为仙人掌有孢汉逊酵母HO-1。

实施例2仙人掌有孢汉逊酵母HO-1的培养：

1、最佳生长温度和培养基pH的确定：

温度条件分别设定为25℃、28℃、30℃、32℃、35℃，pH条件分别设定为pH4、pH5、pH6、pH7、pH8。将初始OD600为0.2的仙人掌有孢汉逊酵母HO-1菌体接入上述不同温度和不同pH的培养基中进行培养，培养24h后测定菌体浓度，结果分别见图4A和图4B。

由图4A可知，菌体在不同的培养温度下生长速度存在差异，在25℃-35℃的温度范围内生长呈现先升高后降低的趋势，在28℃时生长速度最大；由图4B可知，在不同的培养基pH条件下，菌体的生长能力不同，在pH4培养条件下菌体生长最快。综上所述，仙人掌有孢汉逊酵母HO-1最佳的生长温度和pH条件分别为25℃、pH4。

2、仙人掌有孢汉逊酵母HO-1种子液的制备：

将有孢汉逊酵母HO-1单菌落用接种环接种到YPD液体培养基中，于25-35℃(最优25℃)，pH3-5(最优pH4)，200rpm/min的摇床中培养24h，得到种子液。

实施例3仙人掌有孢汉逊酵母HO-1在烟草制品增香方面的应用：

由浙江中烟工业有限责任公司的再造烟叶浓缩液KY-7作为试验样品。

1、再造烟叶浓缩液浓度对仙人掌有孢汉逊酵母HO-1发酵的影响：

用水和YPD液体培养基按照相应的体积比将再造烟叶浓缩液分别稀释至40％(V

具体操作为：分别取2mL发酵前后不同浓度的再造烟叶浓缩液与等体积乙酸乙酯充分混匀后，40KHz超声10min。将体系取出后4000rpm/min离心10min，使有机溶剂相和水相分离，取1mL乙酸乙酯上清溶液过0.22μm膜后，将滤液装入进样瓶进行GC-MS/MS检测；

GC-MS/MS具体条件为：

色谱柱为毛细管柱HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，色谱柱初始温度设为40℃，保持2min，以5℃/min升温至185℃，保持1min，再以2℃/min升温至240℃，在该温度下保持10min，总计60.5min。载：氦气，柱流量1mL/min，进样口温度260℃。质谱条件：EI源，70eV，离子源温度230℃，质谱传输线温度270℃，四级杆温度150℃，质谱扫描范围40-450m/z。使用NIST 11.0标准谱图库进行检索分析，各浓度梯度的结果分别见图5A-5D。

由图5A-5D可知，再造烟叶浓缩液在40％、60％和80％浓度梯度下发酵24h，均有多个不同于对照组的新峰出现，再造烟叶浓缩液在100％浓度梯度下新峰较少(可能高浓度的烟叶浓缩液对于微生物生长不利)，说明仙人掌有孢汉逊酵母HO-1发酵稀释后的再造烟叶浓缩液，有多个新的物质产生。此外，发酵后的再造烟叶浓缩液中的部分物质丰度呈现增高变化，说明它们在再造烟叶浓缩液中的浓度经仙人掌有孢汉逊酵母HO-1发酵后提高。从节省后续浓缩时间的角度出发，选取浓度梯度为80％浓缩液作为最佳的再造烟叶浓缩液的发酵浓度。

2、仙人掌有孢汉逊酵母HO-1在最佳发酵条件下发酵对再造烟叶浓缩液中致香物质的影响：

选择80％浓度梯度的烟草浓缩液(V

取HO-1组或CK组的再造烟叶浓缩液5mL放入20mL顶空瓶中，50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取头于60℃萃取30min，取出，立即插入气相色谱仪进样口进行GC-MS/MS检测；

GC-MS/MS具体条件为：

色谱柱为毛细管柱DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，色谱柱初始温度设为45℃，保持3min，以3℃/min升温至180℃，保持1min，再以5℃/min升温至250℃，在该温度下保持5min，总计68min。载：氦气，柱流量1mL/min，进样口温度230℃。质谱条件：EI源，70eV，离子源温度230℃，质谱传输线温度270℃，四级杆温度150℃，质谱扫描范围35-550m/z。使用NIST 17.0标准谱图库进行检索分析，分别对HO-1和CK两组的酯类、醇类、酮类、酸类、醛类、酚类和杂环及其他等挥发性致香成分含量进行测定，结果分别见表1-7。

表1两组浓缩液中酯类物质含量(μg/mL)

酯类物质是重要香气物质，可赋予烟草浓郁的花香和果香。由表1可知，经仙人掌有孢汉逊酵母HO-1发酵后的烟草浓缩液新增9种酯类致香物质，且多为乙酯类物质，其中以乙酸苯乙酯含量最高，其具有蜂蜜香味，是一种重要的食用香料。此外，十六酸乙酯在杏、黑加仑、酸樱桃中均存在，其具有果爵和奶油香气，而乙酸乙酯、亚油酸乙酯等是中国白酒的重要风味物质，分别具有果甜香和焦香香气。

表2两组浓缩液中醇类物质含量(μg/mL)

由表2可知，除丙二醇、3-呋喃甲醇、芳樟醇外，经仙人掌有孢汉逊酵母HO-1发酵后的烟草浓缩液的多数醇类物质含量较CK组出现不同程度的提高，其中增幅最为显著的是苯乙醇，含量提高了15.34倍。苯乙醇具有清甜玫瑰和水果香气，其含量的增加对烟草浓缩液中主流烟气的改善较大，可改善烟草吃味。除原有醇类物质提升外，新增醇类致香物质6种，分别为异丁醇、正丁醇、异戊醇、2-甲基丁醇、金合欢醇和3-脱氧-17B-雌二醇。其中，异丁醇、正丁醇和异戊醇是茶香、酒香的重要致香成分之一，它们与酯类香气物质混合，可使香气更为丰富。

表3两组浓缩液中酮类物质含量(μg/mL)

由表3可知，与CK组相比，经经仙人掌有孢汉逊酵母HO-1发酵后的烟草浓缩液中，除2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮和4-氧代异佛尔酮含量降低外，包括大马士酮、茄酮、巨豆三稀酮等在内的多数酮类物质含量均有提高，其中茄酮在所有酮类致香物质中含量最高，提升的幅度也较大，由65.71μg/mL提升至92.14μg/mL。茄酮是烟草西伯三烯类物质的降解产物，具有甜香和鲜胡萝卜样香味，可增加烟草本香，使烟气丰满、醇和细腻。此外，经仙人掌有孢汉逊酵母HO-1发酵后的烟草浓缩液新增3种酮类致香物质，分别为2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮和香叶基丙酮，其中2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮具有奶油香味，在酒类、乳制品等中有广泛应用，香叶基丙酮具有生梨、苹果、热带水果的香气，在化妆品、香水、医药、烟草等行业被广泛应用。

表4两组浓缩液中酸类物质含量(μg/mL)

由表4可知，经仙人掌有孢汉逊酵母HO-1发酵后的烟草浓缩液中检测到乙酸1种酸类致香物质，相比CK组缺少了正壬酸和棕榈酸。

表5两组浓缩液中醛类物质含量(μg/mL)

如表5所示，经仙人掌有孢汉逊酵母HO-1发酵后的烟草浓缩液中的多数醛类致香物质含量出现降低，分别为苯乙醛、苯甲醛、2,4-二甲基苯甲醛、5-羟甲基糠醛和异戊醛。其中，糠醛类致香物质的降低利于减少烟草的苦味的和杂气。

表6两组浓缩液中酚类物质含量(μg/mL)

如表6所示，经仙人掌有孢汉逊酵母HO-1发酵后的烟草浓缩液中的酚类致香物质总量降低，主要以5-乙烯基-2甲氧基苯酚和乙基麦芽酚降低为主。此外，经仙人掌有孢汉逊酵母HO-1发酵后的烟草浓缩液新增2种酚类物质，分别为2,4-二叔丁基酚和2-甲氧基苯酚。

表7两组浓缩液中杂环及其他物质含量(μg/mL)

如表7所示，经仙人掌有孢汉逊酵母HO-1发酵后的烟草浓缩液中多数杂环及其他物质总含量降低，并新增γ-雪松烯和西松烯三种致香物质组分。

HO-1组和CK组的酯类、醇类、酮类、酸类、醛类、酚类和杂环及其他等挥发性致香成分总含量统计结果见表8和图6。

表8两组浓缩液中致香物质含量(μg/mL)

由表8和图6可知，经过仙人掌有孢汉逊酵母HO-1发酵后，浓缩液中的酯类、醇类和酮类等致香成分与未经发酵的CK组相比含量显著提升，经计算，提升幅度分别为361.12％、327.29％和34.98％，增加明显，经仙人掌有孢汉逊酵母HO-1发酵后的浓缩液整体品质有所提升。

3、造纸法再造烟叶的制备与评吸

按体积比V

将上述制备的造纸法再造烟叶进行切丝后制成单料烟，记为HO-1组；80％浓度梯度的烟草浓缩液不接种仙人掌有孢汉逊酵母HO-1，其他操作相同，制备的再造烟叶切丝后制成的单料烟记为CK组，由7位有评吸资质的专家对上述两组的单料烟进行评吸，并对烟支的香气、甜感、透发性、杂气、刺激性、余味和异味等指标特征进行打分，结果见表9。

表9两组再造烟叶的感官评吸结果

由表9可知，仙人掌有孢汉逊酵母HO-1发酵烟草浓缩液制备的造纸法再造烟叶具有较为浓郁的花果香气，香气质和香气量均有提升，烟气间的协调性变好，焦甜感和透发性增强、杂气减弱、刺激性降低、余味更加干净。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。