与烟草蔗糖基因qSuc紧密连锁的共显性SSR标记及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与烟草蔗糖基因qSuc紧密连锁的共显性SSR标记及应用。

背景技术

烟草是一种叶用经济作物，烟叶中含有多种化学元素，目前已鉴定的化学成分达3000种以上，但随着气相色谱(GC)、液相色谱(LC)、气相色谱-质谱(GC-MS)、液相色谱-质谱(LC-MS)、红外光谱(IR)、核磁共振(NMR)及高分辨率质谱等现代分离分析仪器在烟草研究中的应用，将使曾经被掩盖的微量成分被揭示出来，进而使烟叶化学成分数量急剧增加。作为卷烟工业基础的烟叶原料，其品质的好坏直接影响卷烟成品质量。而烟叶品质是其叶片内多种化学成分综合作用的结果，因此，烟叶化学成分是烟叶品质鉴定的重要指标，也是外观质量和内在质量在外观特征和烟气特征上的表现。

迄今，针对烟叶化学成分的研究主要集中在烟叶化学成分的鉴定及主要化学成分与评吸质量、外观质量、物理特性和安全性等方面的密切关联，而针对烟叶化学成分的遗传分析及基因/QTL定位研究很少。Julio等(E.Julio,B.Denoyes-Rothan,J.-L.Verrier,F.Dorlhac de Borne,Detection of QTLs linked to leaf and smoke properties inNicotiana tabacum based on a study of 114recombinant inbred lines.MolBreeding,2006,DOI 10.1007/s11032-006-9019-0)是最早利用AFLP、ISSR、SSAP和SCAR标记在分子水平上开展烟叶化学成分基因/QTL定位研究的，其对总植物碱、烟碱(尼古丁)、降烟碱、假木贼碱、柠檬酸和苹果酸等6种烟叶化学成分进行了初步基因/QTL分析。但该基因/QTL定位分析的结果却是不完整且不准确的，主要原因为：首先，Julio等(2006)用于基因/QTL定位分析的烟草遗传连锁图谱质量较低，仅由184个标记构建了18个连锁群，尚未达到烟草的24条染色体(连锁群)完整要求；其次，其仅获得了与上述6种烟叶化学成分连锁的单侧标记，未能获得与目标基因/QTL(6种烟叶化学成分)连锁的两侧标记进行有效定位；最后，获得的单侧连锁标记与目标基因/QTL间的遗传距离较大，导致基因/QTL定位结果的准确性不高。紧接着，肖炳光等(肖炳光，卢秀萍，焦芳婵，李永平，孙玉合，郭兆奎，烤烟几种化学成分的QTL初步分析.作物学报，2008，34(10)：1762-1769.)利用11个ISSR标记和158个RAPD标记构建获得含有27条连锁群的低质量烟草遗传连锁图谱，对总糖、烟碱和氧化钾等3个烟叶化学成分进行基因/QTL分析。随后，蔡长春等(蔡长春，柴利广，王毅，徐芳森，张俊杰，林国平，白肋烟分子标记遗传图谱的构建及部分性状的遗传剖析.作物学报，2009，35(9)：1646-1654.)、李丽华等(李丽华，陈美霞，周东新，陈顺辉，陶爱芬，李延坤，马红勃，祁建民，郭玉春，烟草六个重要性状的QTL定位.作物学报，2011，37(9)：1577-1584.)和刘颖超等(刘颖超，方敦煌，徐海明，童治军，肖炳光，烟草生物碱性状的QTL定位.作物学报，2024，50(1)：42-54)分别利用AFLP和SRAP标记，ISSR和SRAP标记及SNP标记构建的较少标记数量低质量烟草遗传连锁图谱，对烟碱(尼古丁)、总氮、总糖、总氯、总钾、总植物碱、降烟碱、假木贼碱和新烟草碱等9个烟叶化学成分进行了基因/QTL分析，但定位分析结果的准确性仍较低。

而针对烟草蔗糖的QTL定位分析研究，迄今尚未见报道。故此，对烟草蔗糖性状遗传研究与定位分析的空白，严重地制约了利用与烟草蔗糖基因qSuc紧密连锁标记开展高含量蔗糖烟草新品种的选育进程。

鉴于此，本发明首先以优质烤烟品种Y3(烤后烟叶中具有高含量的烟草蔗糖，含基因qSuc)和主栽烤烟品种K326(烤后烟叶中不含烟草蔗糖)为亲本，通过杂交、连续套袋自交，构建一个含有269份株系的烟草重组自交系(RILs_F

发明内容

本发明正是为了解决烟草蔗糖性状QTL定位分析的空白，提供一种与烟草蔗糖基因qSuc紧密连锁的共显性SSR标记及应用。

本发明的第一目的在于提供一种与烟草蔗糖基因qSuc紧密连锁的共显性SSR标记；第二目的在于将上述共显性SSR标记应用于检测烟草基因组DNA中是否存在烟草蔗糖基因qSuc及待测植株中的烟草蔗糖的基因型状态。

本发明的创新点：本发明首次针对烟草蔗糖基因qSuc进行遗传与定位分析。本发明人的研究表明，烟草蔗糖属于典型的数量性状，且受烤烟品种Y3基因组内第13条染色体的QTL控制，该基因/QTL被暂命名为qSuc。

本发明采用如下技术方案实现。

一种与烟草蔗糖基因qSuc紧密连锁的共显性SSR标记，本发明所述的与烟草蔗糖基因qSuc紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM35521和TM34386，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示。

SEQ ID No.1：

GGCTTAACAAAGCGATAAAGAAATAATGGAAGTAAAAACAACAAAAATAATAATAACATCAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAAATTAAATTAAATTATTTTTGCAGCAAATTTCTACCTATGCGCTCATTTTACAAA。

SEQ ID No.2：

GGCTTAACAAAGCGATAAAGAAATAATGGAAGTAAAAACAACAAAAATAATAATAACATCAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAAATTAAATTAAATTATTTTTGCAGCAAATTTCTACCTATGCGCTCATTTTACAAA。

SEQ ID No.3：

TCACCTGAAAAAGGGGAAAACTGAATTAAACAAAAATATTGAGCCTGGGGTTGGTGGCGTCTCAAATGGAACAATACACACACACACACGCGCGCGCGCGCACACACACACACACACACACACACATATATATATATATACATGGATATTTTGAATCAGTAGCTCTG。

SEQ ID No.4：

TCACCTGAAAAAGGGGAAAACTGAATTAAACAAAAATATTGAGCCTGGGGTTGGTGGCGTCTCAAATGGAACAATACACACACACACACGCGCGCGCGCGCGCGCGCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACATATATATATATATACATGGATATTTTGAATCAGTAGCTCTG。

本发明所述共显性标记TM35521和TM34386位于目的基因qSuc两侧。

本发明所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：

扩增TM35521的引物序列为：

TM35521F：5’-GGCTTAACAAAGCGATAAAGAA-3’(SEQ ID NO.5)，

TM35521R：5’-TTTGTAAAATGAGCGCATAGG-3’(SEQ ID NO.6)；

扩增TM34386的引物序列为：

TM34386F：5’-TCACCTGAAAAAGGGGAAAA-3’(SEQ ID NO.7)，

TM34386R：5’-CAGAGCTACTGATTCAAAATATCCA-3’(SEQ ID NO.8)。

上述的与烟草蔗糖基因qSuc紧密连锁的共显性SSR标记的应用在于检测烟草基因组DNA中是否存在烟草蔗糖基因qSuc及待测植株中的烟草蔗糖的基因型状态。

本发明上述的应用，该应用的方法为，以TM35521和TM34386序列的引物分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物。

本发明PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示序列则表明该待测烟草植株存在高含量烟草蔗糖的纯合等位基因，基因型为SucSuc。

本发明PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示序列则为待测烟草植株无烟草蔗糖含量的纯合等位基因，基因型为sucsuc。

本发明PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.4所示序列，或同时含有如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示序列则为待测烟草植株存在中等含量烟草蔗糖的杂合等位基因，基因型为Sucsuc。

为了简捷高效选择具有高蔗糖含量潜力的烟草品种，本发明特异性地选择含烟草蔗糖基因qSuc的后代材料，可用于烟草蔗糖基因qSuc的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率及高含量蔗糖烟草品种选育的效率。利用本发明提供的2个与烟草蔗糖基因qSuc紧密连锁的共显性SSR标记，不仅可用于定性检测任何生育期的烟草基因组DNA中是否存在烟草蔗糖基因qSuc，还可以清晰、精准鉴别待测植株中的烟草蔗糖的基因型状态(即，具有最高含量值且稳定遗传的纯合基因型SucSuc、具有中等含量值且遗传不能稳定的杂合基因型Sucsuc、无含量值且稳定遗传的纯合基因型sucsuc)，进而既提高了具有高蔗糖含量烤烟新品种选育的科学性、可预测性，又加速了育种进程。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

1、填补了国内外关于烟草蔗糖基因qSuc遗传与定位研究的空白。

2、清晰、精准检测烟草蔗糖的基因型状态

提供了用于检测烟草蔗糖基因qSuc的分子标记，既可精准确定待测烟草中是否含有烟草蔗糖，又可清晰的鉴别出待测烟草植株中的蔗糖的基因型状态。

3、检测方法高效、稳定、可靠，且操作简捷和低成本

与现有的采用低通量、高成本、耗时费力的IC法检测成熟并烘烤后的烟草蔗糖含量相比，本发明所述的共显性SSR标记具有高效、稳定、可靠、简捷和低成本的特点。

4、不限检测时机

本方法可在烟草生长的任何时期进行检测，尤其是在烟草幼苗期的检测，可极大的缩短了实验周期，进而加速了选育高蔗糖含量的烤烟新品种进程。

下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。

附图说明

图1是基于烟草重组自交系群体(RILs_F

其中，利用软件为：QTL IciMapping v4.2；参数设置：定位方法为ICIM-ADD：Inclusive Composite Interval Mapping of ADDitive(and dominant)QTL，迭代次数为1000(Permutation times＝1000)，显著性为0.01(Significance＝0.01)，步长为0.5cM(Walk speed＝0.5cM)。横坐标为遗传距离(单位：厘摩cM)；纵坐标为LOD值。图中的横向虚线是在0.01显著性阈值下的LOD值＝3.5744；LOD曲线最高点为主效基因(qSuc)。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照相关产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明所述的与烟草蔗糖基因qSuc紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM35521和TM34386，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：

扩增TM35521的引物序列为：

TM35521F：5’-GGCTTAACAAAGCGATAAAGAA-3’，

TM35521R：5’-TTTGTAAAATGAGCGCATAGG-3’；

扩增TM34386的引物序列为：

TM34386F：5’-TCACCTGAAAAAGGGGAAAA-3’，

TM34386R：5’-CAGAGCTACTGATTCAAAATATCCA-3’。

本发明所述的与烟草蔗糖基因qSuc紧密连锁的共显性SSR标记的应用为所述的与烟草蔗糖基因qSuc紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在烟草蔗糖基因qSuc中的应用。

所述的与烟草蔗糖基因qSuc紧密连锁的共显性SSR标记的应用是分别以TM35521序列的引物和TM34386序列的引物扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物，如果PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示序列即为该烟草植株存在高烟草蔗糖含量的纯合等位基因qSucqSuc；如果PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.4所示序列则为待测烟草植株无烟草蔗糖含量的纯合等位基因qsucqsuc；如果PCR扩增产物中含有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示序列，或含有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列即为待测烟草植株中存在中等含量烟草蔗糖的杂合基因qSucqsuc。

实施例1与烟草蔗糖基因qSuc连锁的共显性SSR标记筛选

采用数量性状连锁分析(QTL)法并结合离子色谱(IC)法，在烟草全基因组范围内筛选与烟草蔗糖基因qSuc连锁的共显性SSR标记

一、实验材料

以综合性状优良但不含烟草蔗糖的烤烟品种K326为母本，以具有高烟草蔗糖含量的优质烤烟品种Y3为父本，经杂交、连续自交，获得269个株系的重组自交系(RILs_F

二、亲本及RILs_F

试验材料成苗后移栽至大田，待大田烟叶成熟时，每个株系随机选10株，且每株烟草选取3片中部叶片进行挂牌编号、烘烤；烘烤后，将上述每个株系的30片中部叶片混合在一起进行研磨成粉末状。

将获得的每个株系中部C3F级别粉末状烟草样品按照中华人民共和国烟草行业标准YCT 251—2008(烟草及烟草制品葡萄糖、果糖、蔗糖的测定离子色谱法)，进行烘烤后烟草叶片中蔗糖含量检测。

经IC法检测获得的269份RILs_F

三、SSR标记分析

烟草基因组DNA提取：采用常规CTAB法或植物组织DNA提取试剂盒均可，方法可参考已有的文献或试剂盒中的说明书。

PCR扩增及电泳检测：PCR扩增体系是常规的体系可参照已发表的文献，其中，本发明所提供的标记退火温度均为60℃；PCR扩增程序信息可参照相关文献；电泳检测也是采用常规的方法，可参照已发表的相关文献。

利用本实验室基于烤烟Y3基因组信息开发的约50000个SSR标记，对RILs_F

再利用筛选获得2158个多态SSR标记，对269份RILs_F

最后，利用遗传连锁作图软件JoinMap 4.0对269份RILs_F

四、烟草蔗糖(qSuc)的全基因组QTL定位分析

利用QTL定位分析软件QTL IciMapping v4.2对RILs_F

其中，相关参数设置为：定位方法选ICIM-ADD：Inclusive Composite IntervalMapping of ADDitive(and dominant)QTL，迭代次数为1000(Permutation times＝1000)，显著性为0.01(Significance＝0.01)，步长为0.5cM(Walk speed＝0.5cM)。

最后，在全基因组范围内的LOD＝3.5744条件下，位于第13号连锁群的62.00cM处定位获得烟草蔗糖性状的1个主效QTL(暂时命名为qSuc)。该主效QTL可解释约6.9349％的表型变异率，且此时的LOD值约为5.2429，详见图1和表1。

表1烟草蔗糖QTL(qSuc)信息统计

注：PVE为QTL的效应值，即，该QTL可解释表型变异百分比；Add为加性效应。

实施例2共显性连锁标记在RILs_F

利用获得的与烟草蔗糖基因qSuc两侧紧密连锁的共显性SSR标记TM35521和TM34386，对苗期的RILs_F

另一方面，待RILs_F

最后，分析269份RILs_F

具体的分析方法为：通过IC法检测获得的各株系烟草蔗糖含量高于或等于亲本Y3含量时，该株系的基因型中也是同时呈现如SEQ ID NO.1(185bp)和SEQ ID NO.3(167bp)所示序列即为纯合基因型SucSuc；

检测获得的各株系烟草蔗糖含量等于亲本K326含量(即，蔗糖含量为0)时，该株系的基因型中也是同时呈现如ID NO.2(245bp)和SEQ ID NO:4(199bp)所示序列即为纯合基因型sucsuc；

而当检测获得的各株系烟草蔗糖含量介于亲本Y3与K326之间，也即与子一代(F

实验结论：

以上结果表明，共显性标记TM35521和TM34386分别与烟草蔗糖基因qSuc紧密连锁，且该两个标记位于目的基因(qSuc)两侧。

利用上述两个共显性紧密连锁SSR标记，不仅可以精准、高效、便捷且低成本的实现烟草任何生育期的烟草蔗糖含量的检测，而且也可清晰鉴别待测植株中的烟草蔗糖的基因型状态(即，具有最高含量值且稳定遗传的纯合基因型SucSuc、具有中等含量值且遗传不能稳定的杂合基因型Sucsuc、无含量值且稳定遗传的纯合基因型sucsuc)，进而既提高了具有高烟草蔗糖含量的新品种选育的科学性、可预测性，又加速了育种进程。

以上所述的仅是本发明的部分具体实施例，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述(包括但不仅限于简写、缩写、本领域惯用的单位)。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。