一种人工改造的Cas12蛋白及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种人工改造的Cas12蛋白及其构建方法与应用。

背景技术

近几年，大量研究报道CRISPR/Cas12基因编辑系统对于体内基因敲除及体外诊断均具有强大的应用前景，尤其在病原微生物体外诊断领域衍生了很多高灵敏核酸检测技术，这主要得益于Cas12蛋白具备的“附带切割”功能。Cas12主要分为Cas12a与Cas12b亚型，当crRNA结合的cas12a/Cas12b与靶DNA发生碱基配对，Cas12a/Cas12b的核酸酶功能会被激活进而切割靶DNA，同时Cas12a/Cas12b对周围的DNA分子进行非特异性切割，即为“附带切割”功能。利用这一原理，在Cas12a/Cas12b切割体系中加入荧光探针，即可以通过检测附带切割产生的荧光信号来判断靶DNA是否存在，因此可以实现DNA的高灵敏检测。研究者将Cas12a/Cas12b与恒温扩增相结合，可检测低拷贝的核酸分子。尽管如此，Cas12a/Cas12b蛋白的切割活性不足以检测数拷贝核酸分子，其切割效率仍需要进一步提高。

因此，亟需提供一种酶切效率高的人工改造的Cas12蛋白及其构建方法来提高核酸分子检测的灵敏度。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种人工改造的Cas12蛋白及其构建方法与应用，解决了现有野生Cas12蛋白酶切效率低的问题，更有益于基因组的编辑和修饰。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种人工改造的Cas12蛋白，所述人工改造的Cas12蛋白包括Cas12a蛋白和/或Cas12b蛋白；所述Cas12a蛋白在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生如下突变：L806K和/或R838P；所述Cas12b蛋白在氨基酸序列SEQ ID NO.2的基础上发生如下突变：T379R和/或F380K。

本发明通过对Cas12蛋白的氨基酸序列进行定点突变改造，获得的Cas12蛋白和野生型Cas12蛋白相比具有更高的酶切效率，能够提高核酸分子检测的灵敏度，适用于病原微生物的核酸分子诊断、单核苷酸多样性检测或基因敲除，对于体外分子诊断具有重要应用价值。

SEQ ID NO.1：

MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN。

SEQ ID NO.2：

MAVKSMKVKLRLDNMPEIRAGLWKLHTEVNAGVRYYTEWLSLLRQENLYRRSPNGDGEQECYKTAEECKAELLERLRARQVENGHCGPAGSDDELLQLARQLYELLVPQAIGAKGDAQQIARKFLSPLADKDAVGGLGIAKAGNKPRWVRMREAGEPGWEEEKAKAEARKSTDRTADVLRALADFGLKPLMRVYTDSDMSSVQWKPLRKGQAVRTWDRDMFQQAIERMMSWESWNQRVGEAYAKLVEQKSRFEQKNFVGQEHLVQLVNQLQQDMKEASHGLESKEQTAHYLTGRALRGSDKVFEKWEKLDPDAPFDLYDTEIKNVQRRNTRRFGSHDLFAKLAEPKYQALWREDASFLTRYAVYNSIVRKLNHAKMFATFTLPDATAHPIWTRFDKLGGNLHQYTFLFNEFGEGRHAIRFQKLLTVEDGVAKEVDDVTVPISMSAQLDDLLPRDPHELVALYFQDYGAEQHLAGEFGGAKIQYRRDQLNHLHARRGARDVYLNLSVRVQSQSEARGERRPPYAAVFRLVGDNHRAFVHFDKLSDYLAEHPDDGKLGSEGLLSGLRVMSVDLGLRTSASISVFRVARKDELKPNSEGRVPFCFPIEGNENLVAVHERSQLLKLPGETESKDLRAIREERQRTLRQLRTQLAYLRLLVRCGSEDVGRRERSWAKLIEQPMDANQMTPDWREAFEDELQKLKSLYGICGDREWTEAVYESVRRVWRHMGKQVRDWRKDVRSGERPKIRGYQKDVVGGNSIEQIEYLERQYKFLKSWSFFGKVSGQVIRAEKGSRFAITLREHIDHAKEDRLKKLADRIIMEALGYVYALDDERGKGKWVAKYPPCQLILLEELSEYQFNNDRPPSENNQLMQWSHRGVFQELLNQAQVHDLLVGTMYAAFSSRFDARTGAPGIRCRRVPARCAREQNPEPFPWWLNKFVAEHKLDGCPLRADDLIPTGEGEFFVSPFSAEEGDFHQIHADLNAAQNLQRRLWSDFDISQIRLRCDWGEVDGEPVLIPRTTGKRTADSYGNKVFYTKTGVTYYERERGKKRRKVFAQEELSEEEAELLVEADEAREKSVVLMRDPSGIINRGDWTRQKEFWSMVNQRIEGYLVKQIRSRVRLQESACENTGDI。

优选地，所述Cas12a蛋白的来源包括Francisella novicida细菌；所述Cas12b蛋白的来源包括Alicyclobacillus acidiphilus细菌。

第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子含有第一方面所述的人工改造的Cas12蛋白的编码序列。

第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有第二方面所述的核酸分子。

第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有第二方面所述的核酸分子和/或第三方面所述的重组载体。

第五方面，本发明提供了一种第一方面所述的人工改造的Cas12蛋白的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

(1)将人工改造的Cas12蛋白的核酸序列SEQ ID NO.11和/或SEQ ID NO.12插入质粒中，得到重组质粒，以所述重组质粒为模板，对所述Cas12蛋白的第806位点、第838位点、第379位点和第380位点中任意一种或至少两种组合进行定点饱和突变；

(2)将步骤(1)获得的突变质粒转化至宿主菌，使用IPTG进行诱导，纯化，得到所述人工改造的Cas12蛋白。

SEQ ID NO.11：

agcatttatcaggaatttgtgaacaaatatagcctgagtaaaaccctgcgctttgaactgattccgcagggcaaaaccctggaaaatattaaagcacgtggcctgattctggatgatgaaaaacgtgccaaagattataaaaaagcgaaacagatcattgataaatatcatcaattttttattgaagaaattttaagcagcgtgtgcatttcggaagatctgctgcagaattatagcgacgtgtatttcaaactgaaaaaaagcgatgatgataacctgcagaaagatttcaaaagcgcgaaagataccatcaaaaaacagattagcgaatatattaaagatagcgaaaaattcaaaaacctgtttaaccagaacctgattgatgcgaaaaaaggccaagaatcagatctgattctgtggctgaaacagagcaaagataatggtatcgaactgttcaaagcaaacagcgatattaccgatatcgatgaagccctggaaattattaaaagcttcaaaggctggaccacctacttcaaaggctttcacgaaaaccgtaaaaacgtttatagc

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SEQ ID NO.12：

atggcggtgaaaagcatgaaagtgaaactgcgcctggataacatgccggaaattcgcgcgggcctgtggaaactgcataccgaagtgaacgcgggcgtgcgctattataccgaatggctgagcctgctgcgccaggaaaacctgtatcgccgcagcccgaacggcgatggcgaacaggaatgctataaaaccgcggaagaatgcaaagcggaactgctggaacgcctgcgcgcgcgccaggtggaaaacggccattgcggcccggcgggcagcgatgatgaactgctgcagctggcgcgccagctgtatgaactgctggtgccgcaggcgattggcgcgaaaggcgatgcgcagcagattgcgcgcaaatttctgagcccgctggcggataaagatgcggtgggcggcctgggcattgcgaaagcgggcaacaaaccgcgctgggtgcgcatgcgcgaagcgggcgaaccgggctgggaagaagaaaaagcgaaagcggaagcgcgcaaaagcaccgatcgcaccgcggatgtgctgcgcgcgctggcggattttggcctgaaaccgctgatgcgcgtgtataccgatagcgatatgagcagcgtgcagtggaaaccgctgcgcaaaggccaggcggtgcgcacctgggatcgcgatatgtttcagcaggcgattgaacgcatgatgagctgggaaagctggaaccagcgcgtgggcgaagcgtatgcgaaactggtggaacagaaaagccgctttgaacagaaaaactttgtgggccaggaacatctggtgcagctggtgaaccagctgcagcaggatatgaaagaagcgagccatggcctggaaagcaaagaacagaccgcgcattatctgaccggccgcgcgctgcgcggcagcgataaagtgtttgaaaaatgggaaaaactggatccggatgcgccgtttgatctgtatgataccgaaattaaaaacgtgcagcgccgcaacacccgccgctttggcagccatgatctgtttgcgaaactggcggaaccgaaatatcaggcgctgtggcgcgaagatgcgagctttctgacccgctatgcggtgtataacagcattgtgcgcaaactgaaccatgcgaaaatgtttgcgcgcaaaaccctgccggatgcgaccgcgcatccgatttggacccgctttgataaactgggcggcaacctgcatcagtatacctttctgcgcaacgaatttggcgaaggccgccatgcgattcgctttcagaaactgctgaccgtggaagatggcgtggcgaaagaagtggatgatgtgaccgtgccgattagcatgagcgcgcagctggatgatctgctgccgcgcgatccgcatgaactggtggcgctgtattttcaggattatggcgcggaacagcatctggcgggcgaatttggcggcgcgaaaattcagtatcgccgcgatcagctgaaccatctgcatgcgcgccgcggcgcgcgcgatgtgtatctgaacctgagcgtgcgcgtgcagagccagagcgaagcgcgcggcgaacgccgcccgccgtatgcggcggtgtttcgcctggtgggcgataaccatcgcgcgtttgtgcattttgataaactgagcgattatctggcggaacatccggatgatggcaaactgggcagcgaaggcctgctgagcggcctgcgcgtgatgagcgtggatctgggcctgcgcaccagcgcgagcattagcgtgtttcgcgtggcgcgcaaagatgaactgaaaccgaacagcgaaggccgcgtgccgttttgctttccgattgaaggcaacgaaaacctggtggcggtgcatgaacgcagccagctgctgaaactgccgggcgaaaccgaaagcaaagatctgcgcgcgattcgcgaagaacgccagcgcaccctgcgccagctgcgcacccagctggcgtatctgcgcctgctggtgcgctgcggcagcgaagatgtgggccgccgcgaacgcagctgggcgaaactgattgaacagccgatggatgcgaaccagatgaccccggattggcgcgaagcgtttgaagatgaactgcagaaactgaaaagcctgtatggcatttgcggcgatcgcgaatggaccgaagcggtgtatgaaagcgtgcgccgcgtgtggcgccatatgggcaaacaggtgcgcgattggcgcaaagatgtgcgcagcggcgaacgcccgaaaattcgcggctatcagaaagatgtggtgggcggcaacagcattgaacagattgaatatctggaacgccagtataaatttctgaaaagctggagcttttttggcaaagtgagcggccaggtgattcgcgcggaaaaaggcagccgctttgcgattaccctgcgcgaacatattgatcatgcgaaagaagatcgcctgaaaaaactggcggatcgcattattatggaagcgctgggctatgtgtatgcgctggatgatgaacgcggcaaaggcaaatgggtggcgaaatatccgccgtgccagctgattctgctggaagaactgagcgaatatcagtttaacaacgatcgcccgccgagcgaaaacaaccagctgatgcagtggagccatcgcggcgtgtttcaggaactgctgaaccaggcgcaggtgcatgatctgctggtgggcaccatgtatgcggcgtttagcagccgctttgatgcgcgcaccggcgcgccgggcattcgctgccgccgcgtgccggcgcgctgcgcgcgcgaacagaacccggaaccgtttccgtggtggctgaacaaatttgtggcggaacataaactggatggctgcccgctgcgcgcggatgatctgattccgaccggcgaaggcgaattttttgtgagcccgtttagcgcggaagaaggcgattttcatcagattcatgcggatctgaacgcggcgcagaacctgcagcgccgcctgtggagcgattttgatattagccagattcgcctgcgctgcgattggggcgaagtggatggcgaaccggtgctgattccgcgcaccaccggcaaacgcaccgcggatagctatggcaacaaagtgttttataccaaaaccggcgtgacctattatgaacgcgaacgcggcaaaaaacgccgcaaagtgtttgcgcaggaagaactgagcgaagaagaagcggaactgctggtggaagcggatgaagcgcgcgaaaaaagcgtggtgctgatgcgcgatccgagcggcattattaaccgcggcgattggacccgccagaaagaattttggagcatggtgaaccagcgcattgaaggctatctggtgaaacagattcgcagccgcgtgcgcctgcaggaaagcgcgtgcgaaaacaccggcgatatt。

优选地，步骤(1)中所述质粒包括PET28a、PET30a或PET30b。

优选地，步骤(2)中所述IPTG的浓度为0-1.5mmol/L。

上述0-1.5mmol/L中的具体点值可以选择0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L、1.5mmol/L等。

优选地，步骤(2)中所述诱导的时间为12-24h。

上述12-24h中的具体点值可以选择12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h等。

第六方面，本发明提供了一种复合物，所述复合物包括第一组分和第二组分；所述第一组分包括第一方面所述的人工改造的Cas12蛋白；所述第二组分包括crRNA或sgRNA。

优选地，所述crRNA的靶点为BRAF基因。

优选地，所述sgRNA的靶点为F3L基因。

优选地，所述crRNA的核酸序列包括SEQ ID NO.5所示的序列。

优选地，所述sgRNA的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。

SEQ ID NO.5：

AAUUUCUACUGUUGUAGAUGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU。

SEQ ID NO.6：

GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGG CAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACGAAAGGUGUUAACCCUGU CA。

第七方面，本发明提供了第一方面所述的人工改造的Cas12蛋白、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重组载体、第四方面所述重组细胞或第六方面所述的复合物在非治疗目的的基因组修饰或基因组编辑中的应用；所述基因修饰包括基因敲除和基因敲入。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过对Cas12蛋白的氨基酸序列进行定点突变改造，获得的Cas12蛋白和野生型Cas12蛋白相比具有更高的酶切效率，能够提高核酸分子检测的灵敏度，适用于病原微生物的核酸分子诊断、单核苷酸多样性检测或基因敲除，对于体外分子诊断具有重要应用价值。

附图说明

图1为改造后Cas12a蛋白纯化PAGE图；

图2为野生Cas12a与改造后Cas12a蛋白体外酶切的荧光检测结果图；

图3为改造后Cas12b蛋白纯化PAGE图；

图4为野生Cas12b与改造后Cas12b蛋白体外酶切的荧光检测结果图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例改造Cas12a蛋白及活性鉴定。

(1)序列突变

预测突变蛋白氨基酸的软件为AlphaFold，野生型Cas12a的氨基酸序列为SEQ IDNO.1，突变后的Cas12a氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

SEQ ID NO.3：

MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTKYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIRKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN。

(2)重组质粒的构建与表达

Cas12a蛋白的野生核酸序列和突变后的核酸序列在南京金斯瑞生物技术公司合成，通过NdeI和HindIII限制性内切酶克隆到PET28a质粒中，一代测序验证后正确。将表达质粒导入感受态细胞，挑取单个菌落，摇菌，使用不同终浓度IPTG(0、0.5、1和1.5mmol/L)诱导蛋白表达，16℃，14h后收集菌体。经超声破碎，12000r/min离心10min，收集上清，以10％SDS-PAGE电泳分析IPTG诱导表达效果，观察考马斯亮蓝染色后蛋白大小及变化，确立最佳IPTG浓度。通过His亲和层析纯化人工改造后的Cas12a蛋白，使用洗涤缓冲液(50mMNa2HPO4，0.3M NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)洗去杂质蛋白，洗脱缓冲液(50mM Na2HPO4，0.3MNaCl，250mM咪唑，pH 8.0)洗脱人工改造后的Cas12a蛋白。洗脱液采用SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色观察蛋白大小及纯度，结果如图1，同时使用Qubit荧光分光光度计测量蛋白的浓度。将洗脱后重组蛋白透析到保存液中(20mM Tris-HCl，pH 8.0)，储存于-80℃。

(3)特异性crNRA的制备及Cas12a的活性验证

为验证改造后的Cas12a的酶切效率，本发明中以BRAF基因的核酸片段为靶序列(SEQ ID NO.13：ATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATG)，对比野生Cas12a与改造后的Cas12a的活性，并设计BRAF特异性crRNA(BRAF-crRNA1，如SEQ ID NO.16：AAUUUCUACUGUUGUAGAUGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU)。利用生物公司合成Primer 1(SEQ ID NO.7：GAAATTAATACGACTCACTATAGGG)和Primer 2(SEQ ID NO.8：ATCGAGATTTCTCTGTAGCTAGACATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC)，我们通过PCR反应合成crRNA的转录模板，反应体系如表1，反应程序为：98℃预变性1min；98℃变性10sec，55℃退火15sec，72℃延伸50sec，30个循环；72℃终延伸5min。crRNA的转录模板经过体外转录成RNA。进行体外酶切荧光检测实验，反应体系如表2。

表1

表2

以未加Cas12a的反应体系为阴性对照，37℃温育40min，使用qPCR仪器检测荧光值，结果如图2所示，表明本发明定点突变改造后的Cas12a蛋白酶切效率更高。

实施例2

本实施例改造Cas12b蛋白及活性鉴定。

(1)序列突变

预测突变蛋白氨基酸的软件为AlphaFold，野生型Cas12b的氨基酸序列为SEQ IDNO.2，突变后的Cas12b氨基酸序列为SEQ ID NO.4；

SEQ ID NO.4：

MAVKSMKVKLRLDNMPEIRAGLWKLHTEVNAGVRYYTEWLSLLRQENLYRRSPNGDGEQECYKTAEECKAELLERLRARQVENGHCGPAGSDDELLQLARQLYELLVPQAIGAKGDAQQIARKFLSPLADKDAVGGLGIAKAGNKPRWVRMREAGEPGWEEEKAKAEARKSTDRTADVLRALADFGLKPLMRVYTDSDMSSVQWKPLRKGQAVRTWDRDMFQQAIERMMSWESWNQRVGEAYAKLVEQKSRFEQKNFVGQEHLVQLVNQLQQDMKEASHGLESKEQTAHYLTGRALRGSDKVFEKWEKLDPDAPFDLYDTEIKNVQRRNTRRFGSHDLFAKLAEPKYQALWREDASFLTRYAVYNSIVRKLNHAKMFARKTLPDATAHPIWTRFDKLGGNLHQYTFLRNEFGEGRHAIRFQKLLTVEDGVAKEVDDVTVPISMSAQLDDLLPRDPHELVALYFQDYGAEQHLAGEFGGAKIQYRRDQLNHLHARRGARDVYLNLSVRVQSQSEARGERRPPYAAVFRLVGDNHRAFVHFDKLSDYLAEHPDDGKLGSEGLLSGLRVMSVDLGLRTSASISVFRVARKDELKPNSEGRVPFCFPIEGNENLVAVHERSQLLKLPGETESKDLRAIREERQRTLRQLRTQLAYLRLLVRCGSEDVGRRERSWAKLIEQPMDANQMTPDWREAFEDELQKLKSLYGICGDREWTEAVYESVRRVWRHMGKQVRDWRKDVRSGERPKIRGYQKDVVGGNSIEQIEYLERQYKFLKSWSFFGKVSGQVIRAEKGSRFAITLREHIDHAKEDRLKKLADRIIMEALGYVYALDDERGKGKWVAKYPPCQLILLEELSEYQFNNDRPPSENNQLMQWSHRGVFQELLNQAQVHDLLVGTMYAAFSSRFDARTGAPGIRCRRVPARCAREQNPEPFPWWLNKFVAEHKLDGCPLRADDLIPTGEGEFFVSPFSAEEGDFHQIHADLNAAQNLQRRLWSDFDISQIRLRCDWGEVDGEPVLIPRTTGKRTADSYGNKVFYTKTGVTYYERERGKKRRKVFAQEELSEEEAELLVEADEAREKSVVLMRDPSGIINRGDWTRQKEFWSMVNQRIEGYLVKQIRSRVRLQESACENTGDI。

(2)重组质粒的构建与表达

Cas12b蛋白的野生核酸序列和突变后的核酸序列在南京金斯瑞生物技术公司合成，通过NdeI和HindIII限制性内切酶克隆到PET28a质粒中，一代测序验证后正确。蛋白表达操作步骤参照实施例1，纯化的蛋白结果见图3。

(3)特异性crNRA的制备及Cas12b的活性验证

为验证改造后的Cas12b的酶切效率，本发明中以猴痘病毒F3L基因的核酸片段为靶序列(SEQ ID NO.14：TCAGAATCTAATGATGACAT AACTAAGAAGTTTATCTACAGCCAATTTAGCTGCATTATTTTTAGCATCTCGTTTAGATTTTCCATCTGCCTTATCGAATACTCTTCCGTCAATGTCTACACAGGCATAAAATGTAGGAGAGTTACTAGGCCCCACTGATTCAATACGAAAAGACCAATCTCTCCTAGTTATTTGGCAGTACTCATTAATAACGGTGACAGGGTTAACACCTTTCCAATAAATAATTTTTTTAACCGGAATAACATCATCAAAAGACTTATTATCCTCTCTCATTGATTTTTCGCGGGATACATCATCTATTATAGCATCAGCATCAGAATCTGTAGGCCGTGTATCAGCATCCATTGTCGTAGACCAACGAGGAGGAGTATCGTCGGAACTGTACACCATAGTACTACGTTGAAGATCATACAGAGCTTTATTAACTTCTCGCTTCTCCAT)，对比野生Cas12b与改造后的Cas12b的活性，并设计F3L特异性sgRNA(F3L-sgRNA，如SEQ ID NO.15所示：GTCTAGAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTT CCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGCTTCTCAAATCTGAGAAGTGGCACGAAAGGTGTTAACCCTGTCA)。利用生物公司合成Primer 3(SEQ ID NO.9：GACTAATACGACTCACTATAGGTCTAGAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGG CCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGCTTCTCAAATCTGAGAAGTGGCAC)和Primer4(SEQ ID NO.10：ATTATTTATTGGAAA GGTGTGTGCCACTTCTCAGATTTGAGAAGCTCAACGGGC)，然后通过PCR反应合成crRNA的转录模板，后者经过体外转录成RNA。进行体外酶切荧光检测实验，反应体系如表3。

表3

以未加Cas12b的反应体系为阴性对照，50℃温育40min，使用qPCR仪器检测荧光值，结果如图4所示，表明改造后的Cas12a酶切效率更高。

综上所述，本发明通过对Cas12蛋白的氨基酸序列进行定点突变改造，获得的Cas12蛋白和野生型Cas12蛋白相比具有更高的酶切效率，能够提高核酸分子检测的灵敏度，适用于病原微生物的核酸分子诊断、单核苷酸多样性检测或基因敲除，对于体外分子诊断具有重要应用价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。