一种提升酿酒酵母血红素供给水平的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种提升酿酒酵母血红素供给水平的方法及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

血红素是一种由亚铁离子(Fe

随着干细胞培养的快速发展，在实验室生产少量的人造肉已经成为可能。由于成本高，人造肉仍处于发展初期。另外，目前的人造肉不能很好地模拟肉的真实的颜色和质地。因此，满足肌肉组织的真实颜色和营养风味的这些特征主要由血红素蛋白、肌红蛋白提供，血红素作为血红蛋白和肌红蛋白的必要组成部分越来越受到广泛关注。在常见的微生物底盘中，酿酒酵母一种单细胞真核生物，没有内毒素，也没有溶原性病毒，繁殖速度快，能进行高密度培养，在酿酒工业和面包业使用有数千年历史，是一种合适的GRAS(通常被认为是安全的)宿主，因此，应用的酿酒酵母表达系统来合成血红素是最佳的选择。

利用酿酒酵母合成血红素需要解决三个方面的难题：第一，血红素合成途径存在的空间隔离。在酿酒酵母中，由Hem1p催化合成5-氨基乙酰丙酸(ALA)的第一个血红素合成步骤和由Hem14p和Hem15p催化的后两个步骤位于线粒体中。相比之下，由Hem2p、Hem3p、Hem4p、Hem12p和Hem13p依次催化的其他中间步骤发生在细胞质中，合成的中间产物应该穿过线粒体的双膜来合成血红素，导致血红素的合成效率较低；第二，在酿酒酵母中实现不同来源基因的不同途径(C4/C5)高效合成5-氨基乙酰丙酸，提供充足的血红素前体；通过同源重组技术多位点整合C4途径在酿酒酵母基因组δ位点，实现ALA稳定合成；第三，增强胞内血红素的供应水平，由于血红素合成途径较长，涉及多达8个步骤的催化反应，因此选择最关键的限速酶进行增强表达，是增加胞内血红素含量，实现血红素高校合成的关键调控策略。针对异源基因的表达，酿酒酵母系统已经开发出了成熟的游离质粒和基因组整合表达系统和高密度表达的过程控制策略，因此实现难度相对较低。确定血红素合成途径最关键的限速酶进行增强表达则是酿酒酵母合成血红素的最大难点。

发明内容

本发明提供了一种提升血红素供给水平的基因工程菌，是在出发菌株的基础上，进行了如下至少一种改进：

(1)多拷贝表达核苷酸序列如Gene ID:851818所示的HEM1基因；

(2)表达核苷酸序列如Gene ID:851614所示的HEM13基因、截短的HEM14基因Hem14p

在一种实施方式中，截短的Hem1p

在一种实施方式中，所述多拷贝表达是使HEM1基因的拷贝数≥2。

在一种实施方式中，所述HEM1基因通过质粒pY26表达。

在一种实施方式中，所述HEM1基因以质粒pY26为表达载体，以TEF启动子调控表达。

在一种实施方式中，所述HEM1基因整合在所述菌株的基因组DNA上。

在一种实施方式中，所述HEM1基因整合在多克隆位点δ位点处。

在一种实施方式中，所述出发菌株还将CBD自组装结构域的编码基因整合在cut416d所在位置。

在一种实施方式中，所述CBD自组装结构域的编码基因如SEQ ID NO.6所示。

在一种实施方式中，所述HEM13基因、截短的HEM14(Hem14p

在一种实施方式中，所述基因工程菌包括但不限于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。

在一种实施方式中，所述基因工程菌还表达大豆血红蛋白、三叶草血红蛋白、猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、猪血红蛋白或牛血红蛋白中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述大豆血红蛋白、三叶草血红蛋白、猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、猪血红蛋白或牛血红蛋白以质粒pESC为表达载体。

截短的Hem1p

本发明还提供所述基因工程菌在发酵生产血红素、血红蛋白和/或肌红蛋白中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是将所述基因工程菌在发酵培养基中，于25～35℃发酵至少24h。

在一种实施方式中，所述发酵培养基中为包括但不限于添加亚铁离子的YNB、YPD培养基。

在一种实施方式中，所述发酵培养基含有菌体所需必须的氨基酸。

在一种实施方式中，所述血红蛋白包括具有功能活性的大豆血红蛋白、三叶草血红蛋白、猪血红蛋白或牛血红蛋白。

有益效果：

(1)本发明通过截短的Hem1p

(2)通过在酿酒酵母基因组的cut416d位点整合含有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列自组装的结构域CBD，实现关键酶胞内自组装，提高血红素合成，实现胞内血红素达到0.3mg/L；

(3)本发明通过表达具有功能活性的大豆血红蛋白、三叶草血红蛋白、猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、猪血红蛋白和牛血红蛋白，为在酿酒酵母中合成以血红素为辅基的蛋白提供胞内供给奠定基础。

附图说明

图1为酿酒酵母中血红素合成途径8个基因的亚细胞定位(Hem1p、Hem2p、Hem3p、Hem4p、Hem12p、Hem13p、Hem14p、Hem15p)，截短的Hem1p、截短的Hem14p的亚细胞和截短的Hem15p的亚细胞定位；

图2为筛选合成血红素前体ALA的C4/C5途径；

图3为重构血红素合成途径的菌株HEME-1、HEME-2、HEME-3和HEME-4；

图4为C4途径(Hem1p)的多位点整合的菌株C4-1到C4-10，组合代谢工程合成血红素的菌株HEME-5到HEME-10；

图5为大豆血红蛋白、三叶草血红蛋白、猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、猪血红蛋白和牛血红蛋白的蛋白摩尔比；

图6为大豆血红蛋白、三叶草血红蛋白、猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、猪血红蛋白和牛血红蛋白的特征吸收峰；

图7为大豆血红蛋白、三叶草血红蛋白、猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、猪血红蛋白和牛血红蛋白的CD色谱；

图8为大豆血红蛋白、三叶草血红蛋白、猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、猪血红蛋白和牛血红蛋白的过氧化物酶活性测定。

具体实施方式

5-氨基乙酰丙酸的测定：采用OPA(邻苯二甲醛)硼酸柱前衍生化进行HPLC分析

(1)流动相：A相，3.01g无水乙酸钠，200μl三乙胺，定容至1L，用5％的醋酸将PH调节到7.20±0.05，抽滤(水系)后加入5ml四氢呋喃；B相，3.01g无水乙酸钠定容至200ml，用5％的醋酸将PH调节到7.20±0.05，抽滤(水系)后再加400ml甲醇、400ml乙腈；

(2)色谱柱：色谱柱C18，ThermoODS2HYPERSIL 250×4.6Part No 31605254630，柱温40℃；

(3)流速：1.0ml/min；紫外检测器：338nm，进样量：30ul；

(4)进样程序：抽取，使用默认补偿值从含200ul/min的位置P1-A4上抽取7ul；清洗，在位置P1-A3清洗针一次；抽取，使用默认补偿值从含200ul/min的样品中抽取1ul；清洗，在位置P1-A3清洗针一次；混合，将来自空气中的8ul与最大速度混合3次；抽取，使用默认补偿值从含200ul/min的位置P1-A1上抽取2ul；清洗，在位置P1-A3清洗针一次；混合，将来自空气中的10ul与最大速度混合15次；抽取，使用默认补偿值从含200ul/min的位置P1-A5上抽取30ul；混合，将来自空气中的20ul与300ul/min混合3次；进样，进样。位置：A1 OPA衍生试剂，A3和A5水，A4硼酸。

(5)梯度洗脱

血红素检测方法：通过草酸处理测量细胞内血红素浓度。对于血红素提取，通过以12000rpm离心5min收集OD

实施例1合成血红素的关键酶胞内定位

以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组为模板，扩增得到HEM1(Gene ID:851818)、HEM2(GeneID:852842)、HEM3(Gene ID:851322)、HEM4(Gene ID:854452)、HEM12(Gene ID:851617)、HEM13(Gene ID:851614)、HEM14(Gene ID:856733)、HEM15(Gene ID:854347)和截短的Hem1p

实施例2 5-氨基乙酰丙酸C4/C5合成途径在酿酒酵母中的构建

构建5-氨基乙酰丙酸的C4合成途径：以酿酒酵母的基因组CEN.PK2-1C为模板，扩增得到HHEM1基因，应用Gibson Assembly构建游离表达载体pY26-TEF-GPD；构建5-氨基乙酰丙酸的C5合成途径：以大肠杆菌基因组为模板，扩增得到SEQ ID NO.2所示的GluTR和SEQID NO.3所示的GSAM的基因，以枯草芽孢杆菌的基因组为模板，扩增得到SEQ ID NO.4所示的GluTR和SEQ ID NO.5所示的GSAM的基因，应用Gibson Assembly构建游离表达载体pY26-TEF-GPD。将上述质粒pY26-Hem1p、pY26-Hem1p

实施例3基因组δ位点整合C4途径Hem1p

以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组为模板，扩增得到酿酒酵母HEM1基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，应用融合PCR技术分别构建包含δ位点的5’端同源臂300bp、启动子TEF1、HEM1基因和δ位点的3’端同源臂300bp的整合框，应用同源重组的方法将Hem1p整合框整合至酿酒酵母菌株的多位点δ位点中，获得C4-1到C4-10菌株。在YPD培养基中，接种量为1×10

实施例4酿酒酵母胞内自组装

以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组为模板，扩增得到cut416d基因序列上下游各500bp的片段，应用融合PCR将上游片段、CBD片段(SEQ ID NO.6)、下游片段共三个片段连接构建整合框，通过CRISPR/Cas9技术将整合框整合在酿酒酵母基因组cut416d上，获得酿酒酵母CEN.PK2-1C cut416d：：CBD；在此基础上，将Hem13p、Hem14p和Hem15p原始的启动子替换为强启动子TEF1，以酿酒酵母CEN.PK2-1C cut416d：：CBD基因组为模板，分别扩增得到HEM13(Gene ID:851614)和其原始启动子上游、下游片段各500bp的片段，截短的HEM14(Hem14p

实施例5通过组合代谢工程构建高效合成血红素的酿酒酵母工程菌

在实施例3构建的酿酒酵母工程菌C4-1到C4-10的基础上，利用CRISPR技术在酿酒酵母基因组的cut416d位点整合自组装的结构域CBD整合框，分别扩增HEM13的启动子(GeneID:851614)、截短的HEM14(Hem14p

实施例6摇瓶水平发酵合成血红蛋白或肌红蛋白

向实施例5构建的HEME-5菌体细胞中转入携带血红蛋白或肌红蛋白编码基因的质粒pESC，所述血红蛋白或肌红蛋白包括大豆血红蛋白(SEQ ID NO.11)、三叶草血红蛋白(SEQ ID NO.12)、猪肌红蛋白(SEQ ID NO.13)、牛肌红蛋白(SEQ ID NO.14)、猪血红蛋白(α亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，β亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示)和牛血红蛋白(α亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，β亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示)，获得具有血红蛋白或肌红蛋白合成能力的菌体细胞。

在摇瓶水平应用YPD发酵培养基，接种菌浓为1×10

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。