一种甘油葡萄糖苷的分离纯化方法

技术领域

本发明属于分离技术领域，具体而言，涉及一种甘油葡萄糖苷的分离纯化方法。

背景技术

甘油葡萄糖苷是一种由葡萄糖基和甘油通过糖苷键连接而成的糖苷化合物，自然环境中它是一种植物和微生物在高渗胁迫下合成的一种保护物质，具有保护细胞免受高压渗透、干旱、高温和紫外线等恶劣环境的破坏作用。甘油葡萄糖苷具有滋润保湿的效果，且在体外高浓度下对细胞没有毒害作用非常适合皮肤使用。目前自然界中已鉴定发现六种不同的构型，其中具有重要生理功能的为2-甘油葡萄糖苷(简称αGG)。除了滋润保湿作用外，αGG在抑制糖代谢、保持蛋白质稳定性、防止蛀牙等方面具有重要作用。有望应用在医药和保健品领域。

专利CN115010774A公开了一种利用活性炭和硅藻土分离纯化甘油葡萄糖苷的方法，通过活性炭和硅藻土作为吸附介质，以水和乙醇依次作为洗脱剂，配合液相监控。此方法需要使用大量水与乙醇对废水处理成本高，且存在吸附量低，单次处理量少，设备成本高等问题。

专利CN113061152A公开了一种利用氨基型树脂分离纯化甘油葡萄糖苷的方法，通过赖氨酸转型的氨基型树脂作为吸附介质，配合液相监控。此方法需要使用氨基酸进行转型且用乙腈作为洗脱剂，成本较高。

专利CN202111616513.1公开了一种色谱分离甘油葡萄糖苷的方法，通过多重步骤制备的硅酸改性的钙锶型阳离子交换树脂作为吸附介质，用水在一定温度条件下作为洗脱剂。此方法需要采用五级分离，设备复杂，特制树脂制备成本高周期长，最终所得产品纯度较低。

综上所述，目前需要一种新的甘油葡萄糖苷的分离纯化方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种从焦糖磷酸化酶转化液中分离纯化甘油葡萄糖苷的方法，采用本方法可以获得高浓度、高纯度的甘油葡萄糖苷。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明的一个方面提供了一种甘油葡萄糖的分离纯化方法，所述方法包括以下步骤：

S1：脱糖：将甘油葡萄糖苷转化液脱糖，得到脱糖液；

S2：除菌：将所得脱糖液过陶瓷微滤膜，收集清液；

S3：除色素及小分子：将上述清液过有机纳滤膜，收集纳滤膜清液；

S4：脱色：将上述纳滤膜清液中加入活性炭脱色，脱色结束后过滤除去活性炭收集脱色液；

S5：除盐及色素：将上述脱色液依次通过强酸性阳离子树脂与强碱性阴离子树脂，收集流出液；

S6：浓缩：将上述流出液减压浓缩至甘油葡萄糖苷含量45％-50％停止浓缩。

优选地，步骤S1中所述甘油葡萄糖苷转化液中甘油葡萄糖苷含量为100g/L-120g/L，蔗糖含量为60-100g/L，果糖含量为150-220g/L，葡萄糖含量为30-60g/L。

优选地，步骤S1中所述脱糖采用酿酒酵母菌，所述酿酒酵母菌浓度为30-70g/L，所述脱糖条件为：30℃，200-600rpm通风发酵18-30h，氨水控制体系pH5.0。

优选地，步骤S2中所述陶瓷微滤膜孔径为0.01-0.2um，操作压力为0.1-0.5Mpa。

优选地，步骤S3中所述过滤条件为：有机纳滤膜分子量为100-1000Da，操作压力为1.5-4.0Mpa。

优选地，步骤S4中所述活性炭加入量为1-10％固含，所述脱色温度为30-90℃。

优选地，步骤S5中所述强酸性阳离子树脂与强碱性阴离子树脂流速均为1-4BV/h。

优选地，步骤S6中所述减压浓缩条件为：温度为30-90℃，操作压力-0.01～-0.1Mpa。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：本发明首次采用纳滤膜对甘油葡萄糖苷转化液进行除部分色素及小分子杂质，其中，纳滤膜除杂具有以下优点：第一，与超滤技术相比，降低了后续脱色所需使用的活性炭量，大大减少了废炭的产生，且降低了后续除碳的难度，有效提升了产品的纯度及颜色；第二，与色谱法相比，设备投资小，运行维护成本低，操作工艺简单；第三，小分子杂质的去除有效避免了后续浓缩过程中的蛋白变性导致成品浑浊透明度不够，改善了甘油葡萄糖苷的品相及纯度，使用此方法提取甘油葡萄糖苷，最终收率大于55％，浓度大于45％，溶液中只含有10％-15％的甘油作为另一种溶剂。本发明的甘油葡萄糖苷的分离纯化方法综合了脱糖，除菌、除色素、脱色，除盐等多个步骤，使得所提取的甘油葡萄糖苷纯度高，收率高且产量高。本发明的甘油葡萄糖苷在化妆品领域有着广泛的应用途径。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且够成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明的甘油葡萄糖苷转化液的分离纯化工艺流程图；

图2为根据本发明实施例1的纯化方法得到的成品图；

图3为根据本发明对比实施例1的纯化方法得到的成品图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所使用的脱糖专用菌为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae ATCC9763，购自上海保藏微生物中心)。

如无特殊说明，本发明实施例中高效液相色谱分析条件为：色谱柱为安捷伦Hi-Plex Na柱，柱温80℃，流动相为纯水，蒸发光设置：80℃，80℃，1.6SLM。

实施例1：

一种甘油葡萄糖苷的分离纯化方法，包括以下步骤：

S1：脱糖：取2L甘油葡萄糖苷转化液(其中，甘油葡萄糖苷含量为121.7g/L，蔗糖含量为100.9g/L，果糖含量为158.5g/L，葡萄糖含量为55.8g/L)，加入50g/L酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae ATCC9763，购自上海保藏微生物中心，下同)于30℃，400rpm下通风发酵30h，氨水控制体系pH5.0，进行发酵脱糖。

S2：除菌：将步骤S1所得脱糖液经过陶瓷微滤膜除去菌体及大分子蛋白，收集清液2L，其中陶瓷微滤膜孔径为0.05um，操作压力为0.5Mpa。

S3：除色素及小分子：将步骤S2所得清液经过有机纳滤膜除去清液中残留的色素、小分子肽链、短链蛋白等物质，收集纳滤膜清液2L；其中，有机纳滤膜分子量为1000Da，操作压力为2.5Mpa。

S4：脱色：将步骤S3所得清液加入活性炭脱色60min，脱色结束后过滤除去活性炭收集脱色液，所得脱色液透光率为95％；其中，活性炭加入量为3％固含量，脱色温度70℃。

S5：除盐及色素：将步骤S4所得脱色液依次通过强酸性阳离子树脂与强碱性阴离子树脂，柱中残留αGG用纯水冲出，收集流出液；其中树脂上样速度均为2BV/h。

S6:浓缩：将上述步骤S5中过树脂流出液减压浓缩至甘油葡萄糖苷含量45.7％停止浓缩；其中减压浓缩温度为60℃，操作压力为-0.095Mpa。

最后得到甘油葡萄糖苷水溶液312.2g，经高效液相色谱分析检测其含量为45.7％，经计算收率58.6％，外观为纯净透明微黄高粘度液体，如图2所示。

实施例2

一种甘油葡萄糖苷的分离纯化方法，包括以下步骤：

S1：脱糖：取2L甘油葡萄糖苷转化液(甘油葡萄糖苷含量为122.3g/L，蔗糖含量为101.9g/L，果糖含量为158.8g/L，葡萄糖含量为56.7g/L)，加入30g/L酿酒酵母菌于30℃，500rpm下通风发酵28h，氨水控制体系pH7.0，进行发酵脱糖。

S2：除菌：将步骤S1所得脱糖液经过陶瓷微滤膜除去菌体及大分子蛋白，收集清液2L，其中陶瓷微滤膜孔径为0.03um，操作压力为0.5Mpa。

S3：除色素及小分子：将步骤S2所得清液经过有机纳滤膜除去清液中残留的色素、小分子肽链、短链蛋白等物质，收集纳滤膜清液2L；其中，有机纳滤膜分子量为600Da，操作压力为2.5Mpa；

S4：脱色：将步骤S3所得清液加入活性炭脱色60min，脱色结束后过滤除去活性炭收集脱色液，所得脱色液透光率为93％；其中，活性炭加入量为3％固含量，脱色温度70℃。

S5：除盐及色素：将步骤S4所得脱色液依次通过强酸性阳离子树脂与强碱性阴离子树脂，柱中残留αGG用纯水冲出，收集流出液。其中树脂上样速度均为1.5BV/h。

S6:浓缩：将上述步骤S5中过树脂流出液减压浓缩至甘油葡萄糖苷含量47.6％停止浓缩；其中减压浓缩温度为60℃，操作压力为-0.095Mpa。

最后得到甘油葡萄糖苷水溶液288.4g，经高效液相色谱分析检测其含量为47.6％，经计算收率56.1％，外观为纯净透明无色高粘度液体。

实施例3

一种甘油葡萄糖苷的分离纯化方法，包括以下步骤：

S1：脱糖：取2L甘油葡萄糖苷转化液(甘油葡萄糖苷含量为100.7g/L，蔗糖含量为119.9g/L，果糖含量为162.7g/L，葡萄糖含量为58.6g/L)，加入70g/L酿酒酵母菌于30℃，400rpm下通风发酵30h，氨水控制体系pH7.0，进行发酵脱糖。

S2：除菌：将步骤S1所得脱糖液经过陶瓷微滤膜除去菌体及大分子蛋白，收集清液2L，其中陶瓷微滤膜孔径为0.01um，操作压力为0.5Mpa。

S3：除色素及小分子：将步骤S2所得清液经过有机纳滤膜除去清液中残留的色素、小分子肽链、短链蛋白等物质，收集纳滤膜清液2L，其中有机纳滤膜分子量为400Da，操作压力为2.5Mpa。

S4：脱色：将步骤S3所得清液加入活性炭脱色60min，脱色结束后过滤除去活性炭收集脱色液，所得脱色液透光率为97％，其中，活性炭加入量为3％固含量，脱色温度65℃。

S5：除盐及色素：将步骤S4所得脱色液依次通过强酸性阳离子树脂与强碱性阴离子树脂，柱中残留αGG用纯水冲出，收集流出液；其中树脂上样速度均为1BV/h。

S6:浓缩：将上述步骤S5中过树脂流出液减压浓缩至甘油葡萄糖苷含量48.3％停止浓缩；其中减压浓缩温度为55℃，操作压力为-0.095Mpa。

最后得到甘油葡萄糖苷水溶液232.1g，经高效液相色谱分析检测其含量为48.3％，经计算收率55.7％，外观为纯净透明无色高粘度液体。

对比实施例1

对上述实施例1的转化液，采用超滤膜过滤提取的方法，具体步骤如下：

S1：脱糖：取2L甘油葡萄糖苷转化液(其中，甘油葡萄糖苷含量为121.7g/L，蔗糖含量为100.9g/L，果糖含量为158.5g/L，葡萄糖含量为55.8g/L)，加入50g/L酿酒酵母菌于30℃，400rpm下通风发酵30h，氨水控制体系pH5.0，进行发酵脱糖。

S2：除菌：将步骤S1所得脱糖液经过陶瓷微滤膜除去菌体及大分子蛋白，收集清液2L，其中陶瓷微滤膜孔径为0.05um，操作压力为0.5Mpa。

S3：除色素及小分子：将步骤S2所得清液经过超滤膜除去清液中残留的色素、小分子肽链、短链蛋白等物质，收集超滤膜清液2L，其中超滤膜分子量为10KDa，操作压力为2.5Mpa。

S4：脱色：将步骤S3所得清液加入活性炭脱色60min，脱色结束后过滤除去活性炭收集脱色液，所得脱色液透光率为65％；其中，活性炭加入量为3％固含量，脱色温度70℃。

S5：除盐及色素：将步骤S4所得脱色液依次通过强酸性阳离子树脂与强碱性阴离子树脂，柱中残留αGG用纯水冲出，收集流出液；其中树脂上样速度均为2BV/h。

S6:浓缩：将上述步骤S5中过树脂流出液减压浓缩至甘油葡萄糖苷含量47.6％停止浓缩；其中减压浓缩温度为60℃，操作压力为-0.095Mpa。

最后得到甘油葡萄糖苷水溶液272.4g，经高效液相色谱分析，检测其含量为47.6％，经计算收率53.3％，外观为浑浊暗黄液体，如图3所示。

对比实施例2

对上述实施例2的转化液，采用超滤膜过滤提取的方法，具体步骤如下：

S1：脱糖：取2L甘油葡萄糖苷转化液(甘油葡萄糖苷含量为122.3g/L，蔗糖含量为101.9g/L，果糖含量为158.8g/L，葡萄糖含量为56.7g/L)，加入30g/L酿酒酵母菌于30℃，500rpm下通风发酵28h，氨水控制体系pH7.0，进行发酵脱糖。

S2：除菌：将步骤S1所得脱糖液经过陶瓷微滤膜除去菌体及大分子蛋白，收集清液2L，其中陶瓷微滤膜孔径为0.03um，操作压力为0.5Mpa。

S3：除色素及小分子：将步骤S2所得清液经过超滤膜除去清液中残留的色素、小分子肽链、短链蛋白等物质，收集超滤膜清液2L，其中超滤膜分子量为20KDa，操作压力为2.5Mpa；

S4：脱色：将步骤S3所得清液加入活性炭脱色60min，脱色结束后过滤除去活性炭收集脱色液，所得脱色液透光率为55％；其中，活性炭加入量为3％固含量，脱色温度70℃。

S5：除盐及色素：将步骤S4所得脱色液依次通过强酸性阳离子树脂与强碱性阴离子树脂，柱中残留αGG用纯水冲出，收集流出液。其中树脂上样速度均为1.5BV/h。

S6:浓缩：将上述步骤S5中过树脂流出液减压浓缩至甘油葡萄糖苷含量46.8％停止浓缩；其中减压浓缩温度为60℃，操作压力为-0.095Mpa。

最后得到甘油葡萄糖苷水溶液258.6g，经高效液相色谱分析检测其含量为46.8％，经计算收率49.5％，外观为浑浊暗黄液体。

对比实施例3

对上述实施例3的转化液，采用超滤膜过滤提取的方法，具体步骤如下：

S1：脱糖：取2L甘油葡萄糖苷转化液(甘油葡萄糖苷含量为100.7g/L，蔗糖含量为119.9g/L，果糖含量为162.7g/L，葡萄糖含量为58.6g/L)，加入70g/L酿酒酵母菌于30℃，400rpm下通风发酵30h，氨水控制体系pH7.0，进行发酵脱糖。

S2：除菌：将步骤S1所得脱糖液经过陶瓷微滤膜除去菌体及大分子蛋白，收集清液2L，其中陶瓷微滤膜孔径为0.01um，操作压力为0.5Mpa。

S3：除色素及小分子：将步骤S2所得清液经过超滤膜除去清液中残留的色素、小分子肽链、短链蛋白等物质，收集超滤膜清液2L，其中超滤膜分子量为10KDa，操作压力为2.5Mpa。

S4：脱色：将步骤S3所得清液加入活性炭脱色60min，脱色结束后过滤除去活性炭收集脱色液，所述脱色液透光率为69％，其中活性炭加入量为3％固含量，脱色温度65℃。

S5：除盐及色素：将步骤S4所得脱色液依次通过强酸性阳离子树脂与强碱性阴离子树脂，柱中残留αGG用纯水冲出，收集流出液；其中树脂上样速度均为1BV/h。

S6:浓缩：将上述步骤S5中过树脂流出液减压浓缩至甘油葡萄糖苷含量45.1％停止浓缩；其中减压浓缩温度为55℃，操作压力为-0.095Mpa。

最后得到甘油葡萄糖苷水溶液234.6g，经高效液相色谱分析检测其含量为45.1％，经计算收率52.5％，外观为浑浊暗黄液体。

上述对比例1-3中均采用超滤方法提取甘油葡萄糖苷，通过实施例1-3与对比例1-3相比分析可知，同样活性炭添加量与脱色条件，脱色透光率分别为90％以上与70％以下，说明同样活性炭添加量与脱色条件上，实施例优于对比例；此外，通过产品的对比上可以得知，实施例在产品外观及收率上都明显优于对比例，因此纳滤方式更适合甘油葡萄糖苷的提取。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。