用于丙型肝炎病毒的含P7的核苷修饰mRNA-脂质纳米颗粒谱系疫苗

相关申请

本申请要求2021年7月6日提交的美国临时申请第63/218,685号的优先权，该临时申请的全部内容通过引证并入本文。

背景技术

仅在美国，丙型肝炎病毒(HCV)感染就带来了巨大的临床负担，影响了全球超过1.6亿人和460万美国人，是北美肝移植的主要原因。未经治疗的慢性HCV感染可导致肝硬化、门静脉高压和肝细胞癌。先前的治疗(包括基于干扰素治疗)成功率低，不良反应严重。虽然新一代口服抗病毒疗法的出现使疗效和耐受性得到了重大改善，但预防这种疾病仍然是控制这种疾病负担的重要策略。出于这些原因，迫切需要开发一种预防性HCV疫苗，并确定治疗性疫苗是否有助于治疗慢性感染患者。

目前的护理治疗标准包括使用直接起效抗病毒药物(DAA)、病毒NS3/4A蛋白酶的药理学抑制剂、NS5A或NS5B聚合酶的组合进行治疗，总体治疗效果大于90％。尽管取得了这一进展，但临床上已经观察到对这些治疗的病毒耐药性，并且与治疗失败有关。世界上大多数感染者都不知道自己的感染状况，可能会继续感染他人，治疗并不能防止治愈后再次感染。这些新疗法的高昂成本和大量HCV感染者意味着即使在发达国家，医疗系统也无法负担所有患者的治疗费用。这种限制在发展中国家甚至更为明显。因此，开发预防急性或慢性HCV感染的疫苗至关重要。

因此，在本领域中需要改进的丙型肝炎病毒(HCV)疫苗。本发明解决了这一需求。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的实施方式的以下详细描述。应当理解，本发明不限于附图中所示的实施方式的精确布置和手段。

图1A至图1C描绘了示例性实验的结果，证明了有和没有p7蛋白的mRNA构建体的体外测试和病毒蛋白表达。图1A描绘了结构设计。图1B描绘了该基因在各种细胞系裂解物中的表达。p7蛋白太小而不能用蛋白质印迹法(western blot)可视化。图1C描绘的数据证明在初步实验中，分泌的病毒蛋白未被可视化。

图2描绘了免疫原性研究设计。

图3A至图3C描绘了示例性实验的结果，证明了抗体的结合。图3A描绘了证明-p7、+p7、和sE2构建体产生的抗体引发了良好的自体结合的数据。图3B描绘了证明+p7构建体产生了引发良好异源结合的抗体的数据。图3C描绘了证明抗体异源结合的数据。

图4A至图4C描绘了示例性实验的结果，证明了用+p7和sE2构建体免疫引发了主要靶向构象表位的广泛反应性抗体。图4A描绘了示例性实验结果，证明了用-p7构建体免疫产生的抗体主要与自体和异源病毒蛋白的线性表位结合。图4B描绘了示例性实验结果，证明了用+p7构建体免疫产生的抗体与自体病毒蛋白的几乎所有线性表位和异源病毒蛋白的构象表位结合。图4C描绘了示例性实验结果，证明了用sE2构建体免疫产生的抗体仅与自体病毒蛋白的线性表位结合，并且主要与异源病毒蛋白的构象表位结合。

图5A和图5B描绘了示例性实验的结果，证明了中和抗体的产生。图5A描绘了证明用+p7构建体免疫引发自体中和抗体的数据。图5B描绘了证明没有组显示引发异源中和抗体的数据。

图6描绘了免疫原性研究的示例性实验设计，以检测广泛中和抗体的诱导。

图7A至图7C描绘了示例性实验的结果，证明了包括p7导致病毒蛋白的更高表达。图7A描绘了来自-p7的C、E1和E2的蛋白质印迹(WB)，显示病毒蛋白以预期大小表达。图7B描绘了E1+/-p7的半定量WB，显示峰值表达在24小时。图7C描绘了+/-p7裂解物的ELISA数据，证明了+p7裂解物中的C蛋白明显高于-p7。

图8A至图8C描绘了示例性实验的结果，证明了病毒蛋白在+/-p7中分泌，并且可以浓缩。图8A描绘了定量WB(qWB)或原始上清液，显示蛋白质分泌到上清液中，在72小时达到峰值。图8B描绘了+p7上清液的定量WB，显示E1E2异二聚体的产生。图8C描绘了+/-p7上清液的定量WB，显示E1E2异二聚体的产生。

图9描绘了测试p7对免疫原性影响的研究设计的图表。

图10描绘了证明-p7和+p7均可引发多功能CD4 CD8 T细胞反应的数据。相比之下，sE2没有引发功能性CD4或CD8反应。

图11描绘了测试p7对体内免疫原性影响的研究设计的图表。

图12描绘了证明包括p7导致异源构象表位的更高结合的示例性数据。

图13描绘了证明包括p7导致更广泛的抗体结合的示例性数据。

图14描绘了证明包括p7更好地实现整体中和的示例性数据。

图15描绘了证明包括p7会导致更广泛、更有效的多种HCV变体的中和的示例性数据。

具体实施方式

本发明涉及在受试者中诱导针对丙型肝炎病毒(HCV)的免疫反应的组合物和方法。在一些实施方式中，本发明提供了包含至少一种编码HCV p7蛋白和至少一种HCV抗原的核苷修饰的RNA的组合物。例如，在一个实施方式中，组合物是包含编码HCV p7蛋白和至少一种HCV抗原的至少一种核苷修饰的RNA的疫苗，其中疫苗在受试者中诱导对至少一种HCV抗原的免疫反应，并因此在受试者中诱导对丙型肝炎病毒或与丙型肝炎病毒相关的病理的免疫反应。在一些实施方式中，核苷修饰的RNA编码HCV核心蛋白、HCV包膜E1蛋白、HCV包膜E2蛋白中的至少一种或其组合，并且进一步编码HCV p7蛋白。在一些实施方式中，核苷修饰的RNA编码HCV核心蛋白、包膜E1蛋白、包膜E2蛋白和HCV p7蛋白。在一些实施方式中，至少一种核苷修饰的RNA包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。

在一个实施方式中，本发明提供了一种谱系疫苗(lineage vaccine)，其包含两种或更多种核苷修饰的RNA分子，其中所述两种或更多种核苷修饰的RNA分子编码HCV蛋白的连续谱系。在一个实施方式中，谱系疫苗包含两种或更多种LNP的组合，其中每种LNP包含编码HCV核心蛋白、包膜E1蛋白、包膜E2蛋白和HCV p7蛋白的核苷修饰的RNA。在一些实施方式中，将两种或更多种LNP顺序给予受试者以诱导针对HCV的免疫反应。

在一些实施方式中，本发明提供了通过给予至少一个LNP而在对其有需要的受试者中诱导针对HCV的免疫反应的方法，所述LNP包含编码HCV核心蛋白、包膜E1蛋白、包膜E2蛋白和HCV p7蛋白的核苷修饰的RNA。在一些实施方式中，本发明提供了通过给予包含至少两个LNP的谱系疫苗而在对其有需要的受试者中诱导针对HCV的免疫反应的方法，其中每个LNP包含编码相同谱系的HCV核心蛋白、包膜E1蛋白、包膜E2蛋白和HCV p7蛋白的核苷修饰的RNA。

在一些实施方式中，本发明提供了通过给予至少一个LNP而在对其有需要的受试者中治疗或预防HCV的方法，所述LNP包含编码HCV核心蛋白、包膜E1蛋白、包膜E2蛋白和HCVp7蛋白的核苷修饰的RNA。在一些实施方式中，本发明提供了通过给予包含至少两个LNP的谱系疫苗而在对其有需要的受试者中治疗或预防HCV的方法，其中每个LNP包含编码HCV核心蛋白、包膜E1蛋白、包膜E2蛋白和HCV p7蛋白的核苷修饰的RNA。

定义

除非另外定义，否则在本文使用的所有技术和科学术语具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

如本文使用的，以下各术语具有本节中与其相关的含义。

冠词“一个”和“一种”在本文中可用于指代一个或多于一个(即，至少一个)冠词的语法对象。举例来说，“一个元素”意指一个元素或多于一个元素。

如本文使用的，在提及可测量值(例如量、持续时间等)时，“约”意指包含与指定值相差±20％、±10％、±5％、±1％或±0.1％的变化，因为这种变化适合于执行所公开的方法。

如本文中使用的，术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是衍生自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)

术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的示例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab’)

如本文使用的，“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较大的一种。

如本文使用的，“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较小的一种。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

如本文使用的，术语“合成抗体”意指使用重组DNA技术产生的抗体。该术语还应被解释为指通过合成编码抗体的DNA分子而产生的抗体，并且该DNA分子表达抗体蛋白，或指定抗体的氨基酸序列，其中该DNA或氨基酸序列是使用本领域中可用且公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得的。该术语也应解释为意指抗体，其通过合成编码抗体的RNA分子而产生。RNA分子表达抗体蛋白或指定抗体的氨基酸序列，其中RNA是通过转录DNA(合成或克隆)、合成RNA或本领域可用且公知的其他技术获得的。

如本文使用的，术语“抗原”或“Ag”被定义为引发适应性免疫反应的分子。这种免疫反应可能涉及抗体产生，或特异性免疫原性感受态细胞的激活，或两者。本领域技术人员应理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA或RNA。本领域技术人员应理解，任何DNA或RNA，其包含编码引发适应性免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此编码本文使用的“抗原”。此外，本领域技术人员应理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发所需的免疫反应。此外，本领域技术人员应理解抗原根本不需要由“基因”编码。很明显，抗原可以由生物样品产生、合成或可以衍生自生物样品。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。

如本文中使用的，术语“佐剂”定义为增强抗原特异性适应性免疫反应的任何分子。

“疾病”是动物的健康状态，其中动物不能保持体内内稳态，并且其中如果疾病没有得到改善，那么动物的健康状况会继续恶化。相比之下，动物的“病症(disorder)”是指动物能够保持内稳态的健康状态，但动物的健康状态不如没有病症时有利。如果不治疗，病症不一定会导致动物健康状况的进一步下降。

如本文使用的，“有效量”意指提供治疗或预防益处的量。

“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，如基因、cDNA或mRNA，以在具有定义的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或定义的氨基酸序列以及由此产生的生物特性的生物过程中用作合成其他聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cDNA转录模板的非编码链都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接到待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足量顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括本领域中已知的所有载体，例如粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)RNA和结合重组多核苷酸的病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

“同源”是指两种多肽之间或两种核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中两者的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中每一个的位置都被腺嘌呤占据，则分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共享的匹配或同源位置的数量除以比较位置的数量×100的函数。例如，如果两个序列中的10个位置中有6个匹配或同源，那么这两个序列的同源性为60％。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％同源性。通常，当两个序列被比对以给出最大同源性时进行比较。

“免疫原”是指任何被引入体内以产生免疫反应的物质。这种物质可以是物理分子，如蛋白质，或者可以由载体编码，如DNA、mRNA或病毒。

如本文使用的，术语“免疫反应”通过非限制性示例是指涉及T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和/或抗原呈递细胞(APC)中效应子功能的激活和/或诱导的过程。因此，如本领域技术人员所理解的，免疫反应包括但不限于辅助T细胞的任何可检测的抗原特异性激活和/或诱导或细胞毒性T细胞活性或反应、抗体产生、抗原呈递细胞活性或浸润、巨噬细胞活性或浸润、嗜中性粒细胞活性或浸润等。

“分离的”意指改变或脱离天然状态。例如，活动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，例如宿主细胞中。

在本发明的上下文中，使用以下常见核苷的缩写(通过N-糖苷键与核糖或脱氧核糖结合的核碱基)。“A”是指腺苷，“C”是指胞苷，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，且“U”是指尿苷。

除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互为简并版本并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的短语核苷酸序列也可以包括内含子，达到编码蛋白质的核苷酸序列在某些版本中可以包含内含子的程度。

如本文使用的，术语“调节”意指与没有治疗或化合物的受试者的反应水平相比，和/或与其他方面相同但未经治疗的受试者的反应水平比较，介导受试者的反应水平的可检测的增加或降低。该术语包括干扰和/或影响天然信号或反应，从而介导受试者(如人类)的有益治疗反应。

除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互为简并版本并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可能包括内含子。此外，核苷酸序列可以含有能够通过细胞中的翻译机制进行翻译的修饰核苷。示例性的修饰核苷在本文其他地方进行了描述。例如，一些或所有尿苷已被假尿苷、1-甲基假尿苷或另一种修饰的核苷取代的mRNA，如本文其他地方所述的那些。在一些实施方式中，核苷酸序列可以包含其中一些或所有胞苷被甲基化胞苷或另一种修饰的核苷取代的序列，如本文其他地方描述的那些。

术语“可操作地连接”是指调控序列和异源核酸序列之间的功能连接，导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核苷酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接到编码序列。通常，可操作连接的DNA或RNA序列是连续的，并且在必要时将两个蛋白质编码区连接在同一阅读框中。

术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且是指适用于本文描述方法的任何动物或其细胞，无论是体外还是原位。在一些非限制性实施方式中，患者、受试者或个体是人。

如本文使用的，术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文使用的，核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有核酸是多核苷酸的一般知识，其可以水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。如本文使用的，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有核酸序列，包括但不局限于重组手段，即使用普通克隆技术和PCR

在一些情况下，本发明的多核苷酸或核酸是“核苷修饰的核酸”，其指包含至少一种修饰的核苷的核酸。“修饰的核苷”是指经过修饰的核苷。例如，在RNA中已经鉴定出超过一百种不同的核苷修饰(Rozenski等，1999,The RNA Modification Database:1999update.Nucl Acids Res 27:196-197)。

在一些实施方式中，“假尿苷”是指

如本文使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两种或更多种氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文使用的，术语指短链和长链，短链在本领域中通常也称为肽、寡肽和低聚物，长链在本领域中通常称为蛋白质，蛋白质有多种类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体，多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

如本文中使用的，术语“启动子”定义为启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞的合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列。作为一个非限制性示例，噬菌体RNA聚合酶识别的启动子用于通过体外转录产生mRNA。

如本文中所用，关于抗体的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中其他分子的抗体。例如，特异性结合一个物种的抗原的抗体也可以结合一种或多种其他物种的抗原。但是，这种跨物种反应性本身并不能改变抗体的特异性分类。在另一个示例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身并不改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合(specificbinding)”或“特异性结合(specifically binding)”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物种的相互作用，意思是该相互作用取决于化学物种上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是通常与蛋白质结合。如果抗体对表位“A”具有特异性，在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离的、未标记的A)的分子的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。

如本文使用的，术语“治疗性”是指治疗和/或预防。治疗效果是通过抑制、减少、缓解、预防或根除疾病或病症的至少一个体征或症状来获得的。

术语“治疗有效量”是指将引起研究人员、兽医、医生或其他临床医生正在寻求的组织、系统或受试者的生物或医学反应的受试者化合物的量。术语“治疗有效量”包括当给予时足以防止或在一定程度上减轻正在治疗的病症或疾病的一种或多种体征或症状的化合物的量。治疗有效量将根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗受试者的年龄、体重等而变化。

本文所用的术语“治疗”疾病意指降低受试者所经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。

如本文使用的，术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导”细胞是用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代受试者细胞及其子代。

如本文使用的，短语“在转录控制下”或“可操作地连接”意指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。

“载体”是包含分离的核酸的物质组合物，可用于将分离的核酸递送到细胞内部。本领域已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的示例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。

范围：在本公开中，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应理解为对本发明范围的非弹性限制。因此，应该认为对范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应被认为具有具体公开的子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。

描述

本发明涉及在受试者中诱导针对HCV的免疫反应的组合物和方法。在一些实施方式中，本发明涉及编码HCV p7蛋白和一种或多种另外的HCV抗原的组合的核苷修饰的mRNA分子，以及该构建体在受试者中诱导针对HCV的保护性或治疗性免疫反应的用途。在一些实施方式中，组合物包含LNP，所述LNP包封编码HCV p7蛋白和一种或多种另外的HCV抗原的组合的至少一种核苷修饰的mRNA分子。

在一些实施方式中，核苷修饰的RNA编码HCV核心蛋白、HCV包膜E1蛋白、HCV包膜E2蛋白中的至少一种或其组合，并且进一步编码HCV p7蛋白。在一些实施方式中，诱导的免疫反应是适应性免疫反应。在一些实施方式中，组合物包含含有LNP的疫苗，所述LNP包含编码HCV核心蛋白、HCV包膜E1蛋白、HCV包膜E2蛋白中的至少一种或其组合的核苷修饰的RNA，并且进一步编码HCV p7蛋白。在一些实施方式中，组合物包含包含两种或更多种LNP的谱系疫苗，其中每个LNP包含编码HCV核心蛋白、HCV包膜E1蛋白、HCV包膜E2蛋白中的至少一种或其组合的核苷修饰的RNA，并且进一步编码HCV p7蛋白。本发明的示例性组合物包括但不限于如美国专利申请第16/608,392号中所述的一种或多种mRNA分子，其进一步编码HCV p7蛋白。

在一些实施方式中，mRNA分子由包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10或其片段或变体的核苷酸序列的DNA分子编码。在一些实施方式中，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10的片段包括编码p7蛋白的序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10的片段包含编码HCV p7蛋白的序列，并且还包含编码至少一种HCV抗原的序列。

在一些实施方式中，组合物诱导保护性抗体的表达。在一些实施方式中，组合物诱导中和抗体的表达。在一些实施方式中，组合物诱导广泛中和抗体的表达。

在一个实施方式中，本发明的组合物包含体外转录(IVT)的RNA。例如，在一些实施方式中，本发明的组合物包含IVT RNA，其编码HCV p7蛋白并进一步编码至少一种HCV抗原。在一些实施方式中，HCV抗原是HCV包膜(E1和/或E2)蛋白、或HCV核心(C)蛋白、或其片段或变体中的至少一种。

在一些实施方式中，本发明提供了一种谱系疫苗，其能够启动并成熟针对快速突变的HCV病毒的免疫反应。在一些实施方式中，HCV抗原是被选择用于维持在HCV基因组中的抗原，即使当HCV基因组发生突变以避免免疫监视时也是如此。本发明的示例性谱系疫苗可以包括但不限于如美国专利申请第16/608,392号中描述的一种或多种mRNA分子，其进一步编码HCV p7蛋白。

在一些实施方式中，谱系疫苗包含一种或多种LNP，所述LNP包含由包含SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10的核苷酸序列或其片段或变体的DNA分子编码的mRNA分子。在一些实施方式中，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10的片段包含编码HCV p7蛋白的序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10的片段包含编码HCV p7蛋白的序列，并且还包含编码至少一种HCV抗原的序列。

在一些实施方式中，本组合物的核酸分子是核苷修饰的RNA。本发明部分基于这样的发现，即编码HCV抗原的核苷修饰的RNA可以诱导针对HCV的强健且持久的免疫反应。此外，HCV抗原编码核苷修饰的RNA可以诱导抗原特异性抗体产生。此外，HCV抗原编码的核苷修饰的RNA可以诱导保护性T细胞反应。核苷修饰的RNA可以诱导与当前HCV疫苗策略相当或优于其的适应性免疫反应。

在一些实施方式中，本组合物的核酸分子是纯化的核苷修饰的RNA。例如，在一些实施方式中，对组合物进行纯化，使得其不含双链污染物。

在一些实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)。例如，在一个实施方式中，组合物包含包封在LNP内的HCV抗原编码核酸分子。在一些情况下，LNP增强了核酸分子的细胞摄取。

在一些实施方式中，组合物包含佐剂。在一个实施方式中，组合物包含编码佐剂的核酸分子。例如，在一个实施方式中，组合物包含编码佐剂的核苷修饰的RNA。在一个实施方式中，组合物包含编码HCV抗原和佐剂的核苷修饰的RNA。在一个实施方式中，组合物包含编码HCV抗原的第一核苷修饰的RNA和编码佐剂的第二核苷修饰的RNA。

在一个实施方式中，本发明提供了一种在受试者中诱导针对HCV的免疫反应的方法。在一些实施方式中，该方法包括向受试者给予组合物，所述组合物包含编码HCV抗原、佐剂或其组合的一种或多种核苷修饰的RNA。

在一个实施方式中，该方法包括将组合物给予到受试者中，包括例如皮内给予或肌内给予。在一些实施方式中，该方法包括向受试者给予多个剂量。在另一个实施方式中，该方法包括给予单剂量的组合物，其中该单剂量在诱导适应性免疫反应方面是有效的。在一个实施方式中，该方法提供持续或延长的免疫反应。

疫苗

在一个实施方式中，本发明提供了用于在受试者中诱导针对HCV的免疫反应的免疫原性组合物。例如，在一个实施方式中，免疫原性组合物是疫苗。对于可用作疫苗的组合物，该组合物必须在细胞、组织或哺乳动物(例如人)中诱导针对HCV抗原的免疫反应。在一些情况下，疫苗诱导哺乳动物产生保护性免疫反应。如本文使用的，“免疫原性组合物”可以包含抗原(例如肽或多肽)、编码抗原的核酸、表达或呈递抗原或细胞组分的细胞、表达或呈递抗原或细胞组分的病毒或其组合。在特定的实施方式中，组合物包含或编码本文描述的任何肽抗原的全部或部分，或其免疫原性功能等价物。在其他实施方式中，组合物为包含额外的免疫刺激剂或编码这种试剂的核酸的混合物形式。免疫刺激剂包括但不限于额外的抗原、免疫调节剂、抗原呈递细胞、脂质纳米颗粒或佐剂。在其他实施方式中，一种或多种额外的试剂以任何组合共价结合到抗原或免疫刺激剂。

在本发明的上下文中，术语“疫苗”是指在接种到动物中时诱导免疫反应的组合物。在一些实施方式中，诱导的免疫反应提供保护性免疫。

本发明的疫苗的核酸和/或细胞组分的组成可以不同。在非限制性示例中，编码HCV抗原的核酸也可与佐剂配制。当然，应当理解，本文描述的各种组合物还可以包括额外的组分。例如，一种或多种疫苗组分可以包含在脂质、脂质体或脂质纳米颗粒中。在另一个非限制性示例中，疫苗可以包含一种或多种佐剂。根据本公开，本发明的疫苗及其各种组分可以通过本文公开的任何方法或本领域普通技术人员已知的方法制备和/或给予。

在各种实施方式中，通过HCV抗原表达诱导免疫可以通过在体内或体外观察宿主中免疫系统的全部或任何部分对HCV抗原的反应来检测。

例如，用于检测细胞毒性T淋巴细胞的诱导的方法是公知的。进入活体的异物通过抗原呈递细胞(APC)的作用呈递给T细胞和B细胞。以抗原特异性方式对APC呈递的抗原作出反应的一些T细胞由于抗原的刺激而分化成细胞毒性T细胞(也称为细胞毒性T淋巴细胞或CTL)。然后这些抗原刺激的细胞增殖。这一过程在本文中被称为T细胞的“激活”。因此，通过APC将多肽或肽或其组合的表位呈递给T细胞，并检测CTL的诱导，可以评估多肽或肽的表位或其组合对CTL的诱导。此外，APC具有激活B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞，巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和NK细胞的作用。

使用树突状细胞(DC)作为APC来评价CTL的诱导作用的方法在本领域是公知的。DC是APC中具有强大CTL诱导作用的代表性APC。在本发明的方法中，多肽或肽或其组合的表位最初由DC表达，然后将该DC与T细胞接触。在与DC接触后对感兴趣的细胞具有细胞毒性作用的T细胞的检测显示多肽或肽或其组合的表位具有诱导细胞毒性T细胞的活性。此外，还可以通过测量CTL在携带固定肽或肽组合的抗原呈递细胞存在下产生和释放的IFN-γ，通过使用抗IFN-γ抗体(如ELISPOT测定)进行可视化来检测诱导的免疫反应。

除了DC，外周血单核细胞(PBMC)也可以用作APC。据报道，CTL的诱导通过在GM-CSF和IL-4存在下培养PBMC而增强。类似地，CTL已被证明是通过在钥孔戚血蓝蛋白(KLH)和IL-7存在下培养PBMC来诱导的。

通过这些方法确认具有CTL诱导活性的抗原是具有DC激活作用和随后的CTL诱导活性的抗原。此外，由于APC呈递抗原而获得细胞毒性的CTL也可以用作对抗抗原相关病症的疫苗。

通过HCV抗原表达诱导免疫可以通过观察诱导针对HCV抗原的抗体产生来进一步证实。例如，当在用编码抗原的组合物免疫的实验室动物中诱导针对抗原的抗体时，并且当抗原相关的病理学被这些抗体抑制时，确定该组合物诱导免疫。

在动物中诱导的抗体反应的特异性可以包括与递送的抗原的许多区域结合，以及诱导具有中和能力的抗体，这些抗体可以预防感染或降低疾病严重程度。

通过观察CD4+T细胞的诱导，可以进一步证实HCV抗原表达对免疫的诱导。CD4+T细胞也可以裂解靶细胞，但主要提供帮助诱导其他类型的免疫反应，包括CTL和抗体产生。CD4+T细胞辅助的类型可以表征为Th1、Th2、Th9、Th17、T调节性(Treg)或T滤泡辅助(Tfh)细胞。CD4+T细胞的每种亚型都有助于某些类型的免疫反应。在一个实施方式中，组合物选择性地诱导T滤泡辅助细胞，其驱动有效的抗体反应。

本发明的治疗性化合物或组合物可以预防性地(即，预防疾病或病症)或治疗性地(例如，治疗疾病或病症)给予患有或有发展疾病或病症的风险(或易感)的受试者。这类受试者可以使用标准临床方法进行鉴定。在本发明的上下文中，预防性给予发生在疾病的显性临床症状出现之前，从而预防或替代地延迟疾病或病症的进展。在医学领域的上下文中，术语“预防”包括任何减轻疾病死亡率或发病率负荷的活动。预防可发生在一级、二级和三级预防水平下。虽然一级预防避免疾病的发展，但二级和三级水平的预防包括旨在预防疾病进展和症状出现的活动，以及通过恢复功能和减少与疾病相关的并发症来减少已经确立的疾病的负面影响。

抗原

本发明提供了一种在受试者中诱导免疫反应的组合物。在一个实施方式中，组合物包含HCV抗原。在一个实施方式中，组合物包含编码HCV抗原或其片段或变体的核酸序列。例如，在一些实施方式中，组合物包含编码HCV抗原的核苷修饰的RNA，或其片段或变体。在一些实施方式中，组合物包含编码HCV抗原的纯化的核苷修饰的RNA，或其片段或变体。抗原可以包括但不限于在受试者中诱导免疫反应的多肽、肽、蛋白质、病毒或细胞。

在一个实施方式中，抗原包含与HCV相关的多肽或肽，使得抗原诱导针对该抗原并因此针对HCV的免疫反应。在一个实施方式中，抗原包含与HCV相关的多肽或肽的片段，使得抗原诱导针对HCV的免疫反应。

在一些实施方式中，HCV抗原是HCV包膜E1蛋白、HCV包膜E2蛋白、HCV核心(C)蛋白或其片段中的至少一种。

在一些方面，核心用于允许形成含有E1和E2的分泌型亚病毒颗粒。在某些情况下，这些分泌型颗粒是呈递给B细胞的更好形式。

在一个实施方式中，抗原包含蛋白质，所述蛋白质包含来自MHC II类的信号肽(SP)。可以使用的其他信号肽包括但不限于衍生自IL-2、tPA、小鼠和人IgG的信号序列，以及合成优化的信号序列。

在一个实施方式中，组合物包含核苷修饰的RNA，其包含编码C-E1-E2-p7的核酸序列，其中核酸序列由包含SEQ ID NO:2-10中的至少一个、或其片段或变体的DNA序列编码，其中核酸序列包含至少一种修饰的核苷。

HCV p7蛋白和HCV抗原可以是任何HCV类型或菌株，包括但不限于1a、1b、1c、1e、1g、1h、1l、2a、2b、2c、2d、2e、2i、2j、2k、2m、2q、2r、3a、3b、3g、3h、3i、3k、4a、4b、4c、4d、4f、4g、4k、4l、4m、4n、4o、4p、4q、4r、4t、4v、4w、5a、6a、6b、6c、6d、6e、6f、6g、6h、6i、6j、6k、6l、6m、6n、6o、6p、6q、6r、6s、6t、6u、6v、6w、6xa、和7a、或其片段或变体。

在一些实施方式中，HCV抗原包含与本文描述的HCV抗原的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列，并且保留原始氨基酸序列的免疫原性功能。例如，在一些实施方式中，HCV抗原的氨基酸序列相对于原始氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％的同一性程度。

在一个实施方式中，HCV p7蛋白和至少一种HCV抗原由核酸分子的核酸序列编码。在一些实施方式中，核酸序列包含DNA、RNA、cDNA、病毒DNA、其变体、其片段或其组合。在一个实施方式中，核酸序列包括修饰的核酸序列。例如，在一个实施方式中，HCV p7蛋白和至少一种HCV抗原编码核酸序列包含核苷修饰的RNA，如本文其他地方详细描述的。在一些情况下，核酸序列包括编码接头或标签序列的一种或多种额外的序列。

在一个实施方式中，HCV p7蛋白和至少一种HCV抗原由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的核酸序列、或其片段或变体编码。在一个实施方式中，SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的片段编码HCV p7蛋白。在一些实施方式中，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、或SEQID NO:10的片段包含编码HCV p7蛋白的序列，并且还包含编码至少一种HCV抗原的序列。

谱系免疫原

为了分离某些突变病毒的广泛中和抗体(BnAbs)，已经提出使用计算机产生的克隆谱系来提供替代疫苗方法。可以设想基于谱系的方法的三个一般步骤。首先，利用单细胞技术从一组克隆相关和抗原特异性的记忆B细胞中获得单克隆抗体。这有助于识别天然免疫球蛋白重(VDJ)和轻(VJ)基因对。其次，使用计算机方法来推断未突变的祖先BCR(即，结合抗原并启动广泛中和抗体反应的天然B细胞的推定受体)。此外，鉴定了在克隆谱系发展的关键分支点上可能的中间抗体。最后，设计的免疫原首先结合并扩展未突变的BCR，然后是驱动祖先BCR产生广泛中和反应的中间抗原。(参见Nat Biotechnol.2012May 7；30(5):423-433.doi:10.1038/nbt.2197中的综述)在一些实施方式中，本发明涉及一种谱系疫苗，其包含连续给予两种或更多种包含核苷修饰的RNA分子的LNP，其中所述谱系疫苗诱导广泛的中和抗体。在一个实施方式中，HCV p7蛋白与至少一种另外的HCV抗原具有相同的谱系。

本发明的示例性谱系疫苗可以包括但不限于如美国专利申请第16/608,392号中描述的一种或多种mRNA分子，其进一步编码HCV p7蛋白。

在一些实施方式中，谱系疫苗包含一种或多种LNP，所述LNP包含由包含SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10的核苷酸序列或其片段或变体的DNA分子编码的mRNA分子。在一些实施方式中，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10的片段包含编码HCV p7蛋白的序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10的片段包含编码HCV p7蛋白的序列，并且还包含编码至少一种HCV抗原的序列。

在一些实施方式中，谱系疫苗包含至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种LNP的组合，其包含至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种mRNA分子的组合。在一种实施方式中，mRNA分子的组合由至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种DNA分子编码，所述DNA分子包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10的核苷酸序列或其片段或变体。在一种实施方式中，谱系疫苗包括配制用于连续给予的LNP，其中疫苗中的每种LNP包括由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10编码的mRNA分子。因此，在一种实施方式中，谱系疫苗包括给予至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种由SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、和SEQ ID NO:10编码的mRNA分子的组合。

佐剂

在一个实施方式中，组合物包含佐剂。在一个实施方式中，组合物包含编码佐剂的核酸分子。在一个实施方式中，编码佐剂的核酸分子是IVT RNA。在一个实施方式中，编码佐剂的核酸分子是核苷修饰的RNA。

示例性佐剂包括但不限于α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达的趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC、)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86。可能是有用佐剂的其他基因包括编码以下的基因：MCP-I、MIP-Ia、MIP-Ip、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-I、VLA-I、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-I、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形态、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-I、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-I、Ap-I、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP 1、TAP2、抗CTLA4-sc、抗LAG3-Ig、抗TIM3-Ig及其功能片段。

在一些实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒充当佐剂。

核酸

在一个实施方式中，本发明包括编码HCV p7蛋白的核酸分子。在一个实施方式中，本发明包括核苷修饰的核酸分子。在一个实施方式中，核苷修饰的核酸分子编码HCV p7蛋白。在一个实施方式中，核苷修饰的核酸分子进一步编码至少一种HCV抗原。在一个实施方式中，核苷修饰的核酸分子编码HCV p7蛋白和多种抗原，包括一种或多种HCV抗原。在一些实施方式中，核苷修饰的核酸分子编码HCV p7蛋白和至少一种诱导针对HCV抗原的适应性免疫反应的HCV抗原。在一个实施方式中，本发明包括编码佐剂的核苷修饰的核酸分子。

核酸分子可以使用本领域的任何方法制备，包括但不限于体外转录、化学合成等。

如本文描述，编码HCV p7蛋白和至少一种HCV抗原的核苷酸序列可以替代地包括相对于原始核苷酸序列的序列变异，例如一种或多种核苷酸的替换、插入和/或缺失，条件是所得多核苷酸编码根据本发明的多肽。因此，本发明的范围包括与本文描述的核苷酸序列基本同源并且编码HCV p7蛋白和至少一种感兴趣的HCV抗原的核苷酸序列。

如本文使用的，当其核苷酸序列与原始核苷酸序列相比具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％的同一性程度时，该核苷酸序列与本文描述的任何核苷酸序列“基本同源”。与编码抗原的核苷酸序列基本同源的核苷酸序列通常可以基于例如通过引入保守或非保守替换而包含在核苷酸序列中的信息从抗原的生产者生物体中分离。可能的修饰的其他示例包括在序列中插入一种或多种核苷酸，在序列的任何末端添加一种或多种核苷酸，或在序列的任何末端或序列内部删除一种或多种核苷酸。使用本领域技术人员广泛已知的计算机算法和方法来确定两个多核苷酸之间的同一性程度。

此外，本发明的范围包括编码与本文描述氨基酸序列基本同源的氨基酸序列并保留原始氨基酸序列的免疫原性功能的核苷酸序列。

如本文使用的，当其氨基酸序列与原始氨基酸序列相比具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％的同一性程度时，该氨基酸序列与本文描述的任何氨基酸序列“基本同源”。两个氨基酸序列之间的同一性可以通过使用BLASTN算法(BLAST Manual,Altschul,S.等，NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894,Altschul,S.等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990))测定。

在一个实施方式中，本发明涉及构建体，其包含编码HCV p7蛋白和至少一种HCV抗原的核苷酸序列。在一个实施方式中，构建体包含编码多种HCV抗原的多个核苷酸序列。例如，在一些实施方式中，构建体编码1种或多种、2种或更多种、3种或更多种、或所有HCV抗原。在一个实施方式中，本发明涉及构建体，其包含编码佐剂的核苷酸序列。在一个实施方式中，构建体包含编码HCV p7蛋白的第一核苷酸序列和编码至少一种HCV抗原的第二核苷酸序列。

在一个实施方式中，组合物包含多个构建体，每个构建体编码HCV p7蛋白和至少一种HCV抗原。在一些实施方式中，组合物包含1种或多种、2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、15种或更多种或20种或更多种构建体。在一个实施方式中，组合物包含约5至11种构建体。在一个实施方式中，组合物包含第一构建体，所述第一构建体包含编码HCV p7蛋白的核苷酸序列；和包含编码至少一种HCV抗原的核苷酸序列的第二构建体。

在另一个实施方式中，构建体可操作地结合到翻译控制元件。构建体可以结合用于表达本发明的核苷酸序列的可操作结合的调控序列，从而形成表达盒。

载体

编码HCV p7蛋白、至少一种HCV抗原或佐剂的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过从表达该基因的细胞中筛选文库，通过从已知包含该基因的载体中衍生该基因，或者通过使用标准技术直接从含有该基因的细胞和组织中分离。可替代地，感兴趣的基因可以以合成方式生产。

核酸可以被克隆到多种类型的载体中。例如，核酸可以被克隆到载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒、PCR产生的线性DNA序列和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体、测序载体和优化用于体外转录的载体。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束、碳水化合物、肽、阳离子聚合物和脂质体。在体外和体内用作递送溶媒的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。

在其中使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送溶媒是脂质体。脂质制剂的用途被设想用于将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一个方面，核酸可以与脂质结合。与脂质相关的核酸可以包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体脂质双层内、通过与脂质体和寡核苷酸相关的连接分子附接到脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质结合、以悬浮液的形式包含在脂质中、含有胶束或与胶束复合、或以其他方式与脂质结合。脂质、脂质/RNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可能存在于双层结构中、以胶束形式存在或与“坍塌(collapsed)”结构一起存在。它们也可以简单地分散在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴，以及含有长链脂族烃类及其衍生物的一类化合物，如脂肪酸类、醇类、胺类、氨基醇类和醛类。

适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma,St.Louis,MO获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可从K&K实验室(Plainview,NY)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。使用氯仿是因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，包括通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质溶媒。脂质体可以被表征为具有具有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有通过水性介质分离的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，它们会自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh等，1991Glycobiology 5:505-10)。然而，也包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构，或者仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了阳离子脂质转染试剂(lipofectamine)-核酸复合物。

无论用于将外源核酸引入宿主细胞或以其他方式使细胞暴露于本发明的组合物的方法如何，为了确认宿主细胞中存在mRNA序列，可以进行多种测定。这样的测定包括例如，本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定如Northern印迹和RT-PCR；“生物化学”测定如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫原性手段(ELISA和免迹印迹)或通过本文描述的测定来鉴定落入本发明范围内的试剂。

体外转录的RNA

在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码HCV p7蛋白和/或HCV抗原的体外转录(IVT)RNA。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码多种HCV抗原的IVT RNA。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码佐剂的IVT RNA。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码一种或多种HCV抗原和一种或多种佐剂的IVT RNA。

在一个实施方式中，可以将IVT RNA作为瞬时转染的形式引入细胞。RNA是通过使用合成产生的质粒DNA模板通过体外转录产生的。可以使用合适的引物和RNA聚合酶通过PCR将来自任何来源的感兴趣的DNA直接转化为用于体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是例如，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他合适的DNA来源。在一个实施方式中，用于体外转录的所需模板是能够诱导适应性免疫反应的HCV抗原。在一个实施方式中，用于体外转录的所需模板是能够增强适应性免疫反应的佐剂。

在一个实施方式中，用于PCR的DNA含有开放阅读框。DNA可以来自生物体基因组中天然存在的DNA序列。在一个实施方式中，DNA是一部分基因的感兴趣的全长基因。该基因可以包括5’和/或3’非翻译区(UTR)中的一些或全部。该基因可以包括外显子和内含子。在一个实施方式中，用于PCR的DNA是人类基因。在另一个实施方式中，用于PCR的DNA是包括5’和3’UTR的人类基因。在另一个实施方式中，用于PCR的DNA是来自病原或共生生物体的基因，包括细菌、病毒、寄生虫和真菌。在另一个实施方式中，用于PCR的DNA来自病原或共生生物体，包括细菌、病毒、寄生虫和真菌，包括5’和3’UTR。DNA可以替代地为在天然存在的生物体中不正常表达的人工DNA序列。示例性的人工DNA序列是包含连接在一起以形成编码融合蛋白的开放阅读框架的基因部分的序列。连接在一起的DNA部分可以来自单个生物体或来自多于一个生物体。

可以用作PCR的DNA来源的基因包括编码多肽的基因，所述多肽在生物体中诱导或增强适应性免疫反应。在一些情况下，基因可用于短期治疗。在一些情况下，基因对表达基因的剂量具有有限的安全性。

在各种实施方式中，质粒用于产生用于转染的mRNA的体外转录的模板。

还可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。在一些实施方式中，RNA具有5’和3’UTR。在一个实施方式中，5’UTR的长度在0至3,000个核苷酸之间。要添加到编码区的5’和3’UTR序列的长度可以通过不同的方法改变，包括但不限于设计退火到UTR的不同区域的PCR引物。使用这种方法，本领域的普通技术人员可以在转染转录的RNA后修改实现最佳翻译效率所需的5’和3’UTR长度。

5'和3'UTR可以是感兴趣基因的天然存在的内源性5'和3'UTR。可替代地，对感兴趣的基因不是内源性的UTR序列可以通过将UTR序列掺入正向和反向引物或通过模板的任何其他修饰来添加。使用对感兴趣的基因不是内源性的UTR序列可用于修饰RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3’UTR序列中富含AU的元素可能降低mRNA的稳定性。因此，基于本领域熟知的UTR的特性，可以选择或设计3’UTR以增加转录的RNA的稳定性。

在一个实施方式中，5’UTR可以包含内源性基因的Kozak序列。可替代地，当如上所述通过PCR添加对感兴趣的基因不是内源性的5’UTR时，可以通过添加5’UTR序列来重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎不是所有RNA都需要Kozak序列才能实现有效翻译。许多mRNA需要Kozak序列是本领域已知的。在其他实施方式中，5’UTR可以衍生自RNA病毒，其RNA基因组在细胞中是稳定的。在其他实施方式中，各种核苷酸类似物可用于3’或5’UTR以阻止mRNA的核酸外切酶降解。

为了能够从DNA模板合成RNA，转录启动子应该附接到待转录的序列上游的DNA模板上。当将充当RNA聚合酶启动子的序列添加到正向引物的5’端时，RNA聚合酶启动子被掺入到待转录的开放阅读框上游的PCR产物中。在一个实施方式中，启动子是T7 RNA聚合酶启动子，如本文其他地方所述。其他有用的启动子包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。

在一个实施方式中，mRNA具有5'端上的帽和3'聚(A)尾，其决定核糖体结合、翻译起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板上，例如质粒DNA上，RNA聚合酶产生长的环连体(concatameric)产物，该产物不适合在真核细胞中表达。在3'UTR末端线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，当其在转录后被聚腺苷酸化时，其在真核转染中是有效的。

在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以将转录物的3'端延伸到模板的最后一个碱基之外(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003))。

将聚A/T片段整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的聚A/T序列可能导致质粒不稳定性，这可以通过使用重组无能细菌细胞进行质粒繁殖来改善。

在使用聚(A)聚合酶(如大肠杆菌聚A聚合酶(E-PAP)或酵母聚A聚合酶)体外转录后，可以进一步延长RNA的聚(A)尾。在一个实施方式中，将聚(A)尾部的长度从100个核苷酸增加到300至400个核苷酸导致RNA的翻译效率增加约两倍。此外，不同化学基团附着在3'端可以提高mRNA的稳定性。这种附接可以包含修饰的/人工的核苷酸、适体和其他化合物。例如，可以使用聚(A)聚合酶将ATP类似物掺入到聚(A)尾中。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。

5’帽也为mRNA分子提供稳定性。在一个实施方式中，通过该方法产生的RNA包括5’帽1结构。这种帽1结构可以使用牛痘病毒加帽酶和2'-O-甲基转移酶产生(CellScript,Madison,WI)。可替代地，使用本领域已知的和本文描述的技术提供5’帽(Cougot等，Trendsin Biochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango等，Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。

可以使用多种不同方法中的任何一种将RNA引入靶细胞，例如，可商购的方法，其包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、细胞融合仪(Eppendort,Hamburg Germany)、使用脂质转染、聚合物包封、肽介导的转染或显微注射和基因枪递送系统如“基因枪”的阳离子脂质体介导的转染(参见例如，Nishikawa等人，Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001))。在一些实施方式中，使用包括使用

核苷修饰的RNA

在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码HCV p7蛋白和至少一种如本文描述的另外的HCV抗原的核苷修饰的核酸。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码HCV p7蛋白和至少一种另外的HCV抗原的核苷修饰的mRNA分子。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码如本文描述的佐剂的核苷修饰的核酸。

在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码HCV p7蛋白的一系列核苷修饰的mRNA分子，所述HCV p7蛋白在每次后续注射时改变以遵循谱系方案。在一个实施方式中，本发明的组合物包含一系列核苷修饰的mRNA分子，其中每个mRNA分子编码HCV p7蛋白和至少一种另外的HCV抗原，所述HCV抗原在每次后续注射时改变以遵循谱系方案。

与未修饰的mRNA相比，核苷修饰的mRNA具有特别的优点，包括例如增加的稳定性、低或缺乏先天免疫原性以及增强的翻译。在美国专利第8,278,036号、第8,691,966号和第8,835,108号中进一步描述了可用于本发明的核苷修饰的mRNA，其各自的全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方式中，核苷修饰的mRNA不激活任何病理生理通路，在递送后非常有效且几乎立即翻译，并且用作体内持续几天至几周的连续蛋白质生产的模板(Karikó等，2008,Mol Ther 16:1833-1840；Karikí等，2012,Mol Ther 20:948-953)。发挥生理作用所需的mRNA量很小，这使其适用于人类治疗。例如，如本文描述，编码HCV抗原的核苷修饰的mRNA已经证明了诱导抗原特异性抗体产生的能力。例如，在一些情况下，与未修饰的mRNA编码的抗原相比，由核苷修饰的mRNA编码的抗原诱导更大的抗原特异性抗体产生。

在一些情况下，通过递送编码mRNA来表达蛋白质比使用蛋白质、质粒DNA或病毒载体的方法具有很多益处。在mRNA转染过程中，所需蛋白质的编码序列是递送到细胞的唯一物质，从而避免了与质粒主链、病毒基因和病毒蛋白相关的所有副作用。更重要的是，与基于DNA和病毒的载体不同，mRNA不具有被结合到基因组中的风险，并且蛋白质产生在mRNA递送后立即开始。例如，在体内注射编码mRNA的15分钟至30分钟内，已经测量到高水平的循环蛋白。在一些实施方式中，使用mRNA而不是蛋白质也具有许多优点。循环中或组织中的蛋白质的半衰期通常很短，因此蛋白质治疗需要频繁给药，而mRNA为持续几天至几周的连续蛋白质产生提供了模板。蛋白质的纯化是个问题，并且它们可能含有引起不良影响的聚集体和其他杂质(Kromminga和Schellekens,2005,Ann NY Acad Sci 1050:257-265)。

在一些实施方式中，核苷修饰的RNA包括天然存在的修饰的核苷假尿苷。在一些实施方式中，包含假尿苷使mRNA更稳定、无免疫原性，和高度可翻译的(Karikó等，2008,MolTher 16:1833-1840；Anderson等，2010,Nucleic Acids Res 38:5884-5892；Anderson等，2011,Nucleic Acids Research 39:9329-9338；Karikó等，2011,Nucleic Acids Research39:e142；Karikó等，2012,Mol Ther 20:948-953；Karikó等，2005,Immunity23:165-175)。

已经证明，修饰的核苷，包括RNA中的假尿苷的存在抑制了它们的先天免疫原性(Karikó等，2005,Immunity 23:165-175)。此外，含有假尿苷的蛋白质编码的体外转录的RNA可以比不含修饰的核苷或含有其他修饰的核苷的RNA更有效地翻译(Karikó等，2008,Mol Ther 16:1833-1840)。随后，证实了存在假尿苷提高了RNA的稳定性(Anderson等，2011,Nucleic Acids Research 39:9329-9338)，并且减弱了PKR的激活和翻译的抑制(Anderson等，2010,Nucleic Acids Res 38:5884-5892)。

对于含有1-甲基-假尿苷的RNA，也观察到了与针对假尿苷描述的类似效果。

在一些实施方式中，核苷修饰的核酸分子是纯化的核苷修饰的核苷酸分子。例如，在一些实施方式中，对组合物进行纯化以去除双链污染物。在一些情况下，使用制备型高效液相色谱(HPLC)纯化程序来获得具有优异翻译潜力且没有先天免疫原性的含有假尿苷的RNA(Karikó等，2011,Nucleic Acids Research 39:e142)。向小鼠和猕猴给予HPLC纯化的含有假尿苷的编码促红细胞生成素的RNA导致血清EPO水平显著升高(Karikó等，2012,MolTher 20:948-953)，从而证实含有假尿苷的mRNA适合体内蛋白质疗法。在一些实施方式中，使用非HPLC方法纯化核苷修饰的核酸分子。在一些情况下，使用色谱法纯化核苷修饰的核酸分子，包括但不限于HPLC和快速蛋白质液相色谱法(FPLC)。示例性的基于FPLC的纯化程序描述于Weissman等，2013,Methods Mol Biol,969:43-54中。示例性的纯化程序也描述在美国专利申请公开第US2016/0032316号中，其全部内容通过引证并入本文。

本发明包括RNA、寡核糖核苷酸和包含假尿苷或修饰的核苷的多核糖核苷酸分子。在一些实施方式中，组合物包含编码抗原的分离的核酸，其中所述核酸包含假尿苷或修饰的核苷。在一些实施方式中，组合物包含载体，所述载体包含编码抗原、佐剂或其组合的分离的核酸，其中所述核酸包含假尿苷或修饰的核苷。

在一个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA是IVT RNA，如本文其他地方描述的。例如，在一些实施方式中，核苷修饰的RNA通过T7噬菌体RNA聚合酶合成。在另一个实施方式中，核苷修饰的mRNA由SP6噬菌体RNA聚合酶合成。在另一个实施方式中，核苷修饰的RNA通过T3噬菌体RNA聚合酶合成。

在一个实施方式中，修饰的核苷是m1acp3Ψ(1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m1Ψ(1-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是Ψm(2'-O-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m5D(5-甲基二氢尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m3Ψ(3-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是未进一步修饰的假尿苷部分。在另一个实施方式中，修饰的核苷是任何上述假尿苷的单磷酸盐、二磷酸盐或三磷酸盐。在另一个实施方式中，修饰的核苷是本领域已知的任何其他假尿苷样核苷。

在另一个实施方式中，在本发明的核苷修饰的RNA中修饰的核苷是尿苷(U)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是胞苷(C)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是腺苷(A)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是鸟苷(G)。

在另一个实施方式中，本发明的修饰核苷是m5C(5-甲基胞苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m5U(5-甲基尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m6A(N6-甲基腺苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是s2U(2-硫代尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是Ψ(假尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是Um(2'-O-甲基尿苷)。

在其他实施方式中，修饰的核苷是m1A(1-甲基腺苷)；m2A(2-甲基腺苷)；Am(2'-O-甲基腺苷)；ms2m6A(2-甲硫基-N6-甲基腺苷)；i6A(N6-异戊烯基腺苷)；ms2i6A(2-甲硫基-N6异戊烯基腺苷)；io6A(N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷)；ms2io6A(2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷)；g6A(N6-甘氨酸基氨基甲酰基腺苷)；t6A(N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷)；ms2t6A(2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷)；m6t6A(N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷)；hn6A(N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷)；ms2hn6A(2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷)；Ar(p)(2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯))；I(肌苷)；m1I(1-甲基肌苷)；m1Im(1,2'-O-二甲基肌苷)；m3C(3-甲基胞苷)；Cm(2'-O-甲基胞苷)；s2C(2-硫代胞苷)；ac4C(N4-乙酰基胞苷)；f5C(5-甲酰基胞苷)；m5Cm(5,2'-O-二甲基胞苷)；ac4Cm(N4-乙酰基-2'-O-甲基胞苷)；k2C(赖胞苷)；m1G(1-甲基鸟苷)；m2G(N2-甲基鸟苷)；m7G(7-甲基鸟苷)；Gm(2'-O-甲基鸟苷)；m22G(N2,N2-二甲基鸟苷)；m2Gm(N2,2'-O-二甲基鸟苷)；m22Gm(N2,N2,2'-O-三甲基鸟苷)；Gr(p)(2'-O-核糖基鸟苷(磷酸酯))；yW(怀丁苷)；o2yW(过氧基怀丁苷)；OHyW(羟基怀丁苷)；OHyW*(修饰不良的(undermodified)羟基怀丁苷)；imG(怀俄苷)；mimG(甲基怀俄苷)；Q(辫苷)；oQ(环氧基辫苷)；galQ(半乳糖基-辫苷)；manQ(甘露糖基-辫苷)；preQ0(7-氰基-7-脱氮鸟苷)；preQ1(7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷)；G+(古嘌苷)；D(二氢尿苷)；m5Um(5,2'-O-二甲基尿苷)；s4U(4-硫代尿苷)；m5s2U(5-甲基-2-硫代尿苷)；s2Um(2-硫代-2'-O-甲基尿苷)；acp3U(3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷)；ho5U(5-羟基尿苷)；mo5U(5-甲氧基尿苷)；cmo5U(尿苷5-氧基乙酸)；mcmo5U(尿苷5-氧基乙酸甲基酯)；chm5U(5-(羧基羟基甲基)尿苷))；mchm5U(5-(羧基羟基甲基)尿苷甲基酯)；mcm5U(5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mcm5Um(5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基尿苷)；mcm5s2U(5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷)；nm5s2U(5-氨基甲基-2-硫代尿苷)；mnm5U(5-甲基氨基甲基尿苷)；mnm5s2U(5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)；mnm5se2U(5-甲基氨基甲基-2-硒基尿苷)；ncm5U(5-氨基甲酰基甲基尿苷)；ncm5Um(5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷)；cmnm5U(5-羧基甲基氨基甲基尿苷)；cmnm5Um(5-羧基甲基氨基甲基-2'-O-甲基尿苷)；cmnm5s2U(5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)；m62A(N6,N6-二甲基腺苷)；Im(2'-O-甲基肌苷)；m4C(N4-甲基胞苷)；m4Cm(N4,2'-O-二甲基胞苷)；hm5C(5-羟基甲基胞苷)；m3U(3-甲基尿苷)；cm5U(5-羧基甲基尿苷)；m6Am(N6,2'-O-二甲基腺苷)；m62Am(N6,N6,O-2'-三甲基腺苷)；m2,7G(N2,7-二甲基鸟苷)；m2,2,7G(N2,N2,7-三甲基鸟苷)；m3Um(3,2'-O-二甲基尿苷)；m5D(5-甲基二氢尿苷)；f5Cm(5-甲酰基-2'-O-甲基胞苷)；m1Gm(1,2'-O-二甲基鸟苷)；m1Am(1,2'-O-二甲基腺苷)；τm5U(5-牛磺酸基甲基尿苷)；τm5s2U(5-牛磺酸基甲基-2-硫代尿苷))；imG-14(4-去甲基怀俄苷)；imG2(异怀俄苷)；或ac6A(N6-乙酰基腺苷)。

在另一个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA包含上述修饰中的2种或更多种的组合。在另一个实施方式中，核苷修饰的RNA包含上述修饰中的3种或更多种的组合。在另一个实施方式中，核苷修饰的RNA包含上述修饰中的多于3种的组合。

在各种实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA中0.1％至100％的残基被修饰(例如，通过假尿苷、1-甲基-假尿苷或另一种修饰的核苷碱基的存在)。在一个实施方式中，修饰的残基的分数为0.1％。在另一个实施方式中，修饰的残基的分数为0.2％。在另一个实施方式中，分数为0.3％。在另一个实施方式中，分数为0.4％。在另一个实施方式中，分数为0.5％。在另一个实施方式中，分数为0.6％。在另一个实施方式中，分数为0.7％。在另一个实施方式中，分数为0.8％。在另一个实施方式中，分数为0.9％。在另一个实施方式中，分数为1％。在另一个实施方式中，分数为1.5％。

在另一个实施方式中，分数为2％。在另一个实施方式中，分数为2.5％。

在另一个实施方式中，分数为3％。在另一个实施方式中，分数为4％。在另一个实施方式中，分数为5％。在另一个实施方式中，分数为6％。在另一个实施方式中，分数为7％。在另一个实施方式中，分数为8％。在另一个实施方式中，分数为9％。在另一个实施方式中，分数为10％。在另一个实施方式中，分数为12％。在另一个实施方式中，分数为14％。在另一个实施方式中，分数为16％。在另一个实施方式中，分数为18％。在另一个实施方式中，分数为20％。在另一个实施方式中，分数为25％。在另一个实施方式中，分数为30％。在另一个实施方式中，分数为35％。在另一个实施方式中，分数为40％。在另一个实施方式中，分数为45％。在另一个实施方式中，分数为50％。在另一个实施方式中，分数为55％。在另一个实施方式中，分数为60％。在另一个实施方式中，分数为65％。在另一个实施方式中，分数为70％。在另一个实施方式中，分数为75％。在另一个实施方式中，分数为80％。在另一个实施方式中，分数为85％。在另一个实施方式中，分数为90％。在另一个实施方式中，分数为91％。在另一个实施方式中，分数为92％。在另一个实施方式中，分数为93％。在另一个实施方式中，分数为94％。在另一个实施方式中，分数为95％。在另一个实施方式中，分数为96％。在另一个实施方式中，分数为97％。在另一个实施方式中，分数为98％。在另一个实施方式中，分数为99％。在另一个实施方式中，分数为100％。

在另一个实施方式中，分数为小于5％。在另一个实施方式中，分数为小于3％。在另一个实施方式中，分数为小于1％。在另一个实施方式中，分数为小于2％。在另一个实施方式中，分数为小于4％。在另一个实施方式中，分数为小于6％。在另一个实施方式中，分数为小于8％。在另一个实施方式中，分数为小于10％。在另一个实施方式中，分数为小于12％。在另一个实施方式中，分数为小于15％。在另一个实施方式中，分数为小于20％。在另一个实施方式中，分数为小于30％。在另一个实施方式中，分数为小于40％。在另一个实施方式中，分数为小于50％。在另一个实施方式中，分数为小于60％。在另一个实施方式中，分数为小于70％。

在另一个实施方式中，0.1％的给定核苷(即尿苷、胞苷、鸟苷或腺苷)的残基被修饰。在另一个实施方式中，修饰的残基的分数为0.2％。在另一个实施方式中，分数为0.3％。在另一个实施方式中，分数为0.4％。在另一个实施方式中，分数为0.5％。在另一个实施方式中，分数为0.6％。在另一个实施方式中，分数为0.7％。在另一个实施方式中，分数为0.8％。在另一个实施方式中，分数为0.9％。在另一个实施方式中，分数为1％。在另一个实施方式中，分数为1.5％。在另一个实施方式中，分数为2％。在另一个实施方式中，分数为2.5％。在另一个实施方式中，分数为3％。在另一个实施方式中，分数为4％。在另一个实施方式中，分数为5％。在另一个实施方式中，分数为6％。在另一个实施方式中，分数为7％。在另一个实施方式中，分数为8％。在另一个实施方式中，分数为9％。在另一个实施方式中，分数为10％。在另一个实施方式中，分数为12％。在另一个实施方式中，分数为14％。在另一个实施方式中，分数为16％。在另一个实施方式中，分数为18％。在另一个实施方式中，分数为20％。在另一个实施方式中，分数为25％。在另一个实施方式中，分数为30％。在另一个实施方式中，分数为35％。在另一个实施方式中，分数为40％。在另一个实施方式中，分数为45％。在另一个实施方式中，分数为50％。在另一个实施方式中，分数为55％。在另一个实施方式中，分数为60％。在另一个实施方式中，分数为65％。在另一个实施方式中，分数为70％。在另一个实施方式中，分数为75％。在另一个实施方式中，分数为80％。在另一个实施方式中，分数为85％。在另一个实施方式中，分数为90％。在另一个实施方式中，分数为91％。在另一个实施方式中，分数为92％。在另一个实施方式中，分数为93％。在另一个实施方式中，分数为94％。在另一个实施方式中，分数为95％。在另一个实施方式中，分数为96％。在另一个实施方式中，分数为97％。在另一个实施方式中，分数为98％。在另一个实施方式中，分数为99％。在另一个实施方式中，分数为100％。在另一个实施方式中，被修饰的给定核苷酸的分数为小于8％。在另一个实施方式中，分数为小于10％。在另一个实施方式中，分数为小于5％。在另一个实施方式中，分数为小于3％。在另一个实施方式中，分数为小于1％。在另一个实施方式中，分数为小于2％。在另一个实施方式中，分数为小于4％。在另一个实施方式中，分数为小于6％。在另一个实施方式中，分数为小于12％。在另一个实施方式中，分数为小于15％。在另一个实施方式中，分数为小于20％。在另一个实施方式中，分数为小于30％。在另一个实施方式中，分数为小于40％。在另一个实施方式中，分数为小于50％。在另一个实施方式中，分数为小于60％。在另一个实施方式中，分数为小于70％。

在一些实施方式中，组合物包含单链核苷修饰的RNA的纯化制剂。例如，在一些实施方式中，单链核苷修饰的RNA的纯化制剂基本上不含双链RNA(dsRNA)。在一些实施方式中，相对于所有其他核酸分子(DNA、dsRNA等)，纯化的制剂是至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.5％、或至少99.9％的单链核苷修饰的RNA。

在另一个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA在细胞中比具有相同序列的未修饰的RNA分子更有效地被翻译。在另一个实施方式中，核苷修饰的RNA表现出被靶细胞翻译的增强的能力。在另一个实施方式中，翻译相对于其未修改的对应物增强了2倍。在另一个实施方式中，翻译增强了3倍。在另一个实施方式中，翻译增强了4倍。在另一个实施方式中，翻译增强了5倍。在另一个实施方式中，翻译增强了6倍。在另一个实施方式中，翻译增强了7倍。在另一个实施方式中，翻译增强了8倍。在另一个实施方式中，翻译增强了9倍。在另一个实施方式中，翻译增强了10倍。在另一个实施方式中，翻译增强了15倍。在另一个实施方式中，翻译增强了20倍。在另一个实施方式中，翻译增强了50倍。在另一个实施方式中，翻译增强了100倍。在另一个实施方式中，翻译增强了200倍。在另一个实施方式中，翻译增强了500倍。在另一个实施方式中，翻译增强了1000倍。在另一个实施方式中，翻译增强了2000倍。在另一个实施方式中，因子为10-1000倍。在另一个实施方式中，因子为10-100倍。在另一个实施方式中，因子为10-200倍。在另一个实施方式中，因子为10-300倍。在另一个实施方式中，因子为10-500倍。在另一个实施方式中，因子为20-1000倍。在另一个实施方式中，因子为30-1000倍。在另一个实施方式中，因子为50-1000倍。在另一个实施方式中，因子为100-1000倍。在另一个实施方式中，因子为200-1000倍。在另一个实施方式中，翻译可以增强任何其他显著的量或量的范围。

在另一个实施方式中，与具有相同序列的未修饰的体外合成的RNA分子相比，本发明的核苷修饰的抗原编码RNA诱导显著更强的适应性免疫反应。在另一个实施方式中，修饰的RNA分子诱导比其未修饰的对应物大2倍的适应性免疫反应。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增加了3倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增加了4倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增加了5倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增加了6倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增加了7倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增加了8倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增加了9倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增加了10倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增加了15倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增加了20倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增加了50倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增加了100倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增加了200倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增加了500倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增加了1000倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增加了2000倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增加了另一倍数差异。

在另一个实施方式中，“诱导显著更强的适应性免疫反应”是指适应性免疫反应的可检测的增加。在另一个实施方式中，该术语是指适应性免疫反应的倍数增加(例如，上面提到的倍数增加中的1)。在另一个实施方式中，该术语是指一种增加，使得核苷修饰的RNA可以以比未修饰的RNA分子更低的剂量或频率给予，同时仍然诱导类似有效的适应性免疫反应。在另一个实施方式中，该增加使得核苷修饰的RNA可以使用单剂量给予以诱导有效的适应性免疫反应。

在另一个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA表现出比具有相同序列的未修饰的体外合成的RNA分子显著更低的先天免疫原性。在另一个实施方式中，修饰的RNA分子表现出比其未修饰的对应物低2倍的先天性免疫反应。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低3倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低4倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低5倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低6倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低7倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低8倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低9倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低10倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低15倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低20倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低50倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低100倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低200倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低500倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低1000倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低2000倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低另一倍数差异。

在另一个实施方式中，“表现出明显较低的先天免疫原性”是指先天免疫原性的可检测的降低。在另一个实施方式中，该术语是指先天免疫原性的倍数降低(例如，上面提到的倍数降低中的一种)。在另一个实施方式中，该术语是指一种降低使得可以在不触发可检测的先天免疫反应的情况下给予有效量的核苷修饰的RNA。在另一个实施方式中，该术语是指一种降低，使得核苷修饰的RNA可以重复给予，而不会引发足以可检测地减少由修饰的RNA编码的蛋白质的产生的先天免疫反应。在另一个实施方式中，这种降低使得核苷修饰的RNA可以重复给予，而不会引发足以可检测地消除由修饰的RNA编码的蛋白质的产生的先天免疫反应。

脂质纳米颗粒

在一个实施方式中，核苷修饰的RNA的递送包括任何合适的递送方法，包括本文其他地方描述的示例性RNA转染方法。在一些实施方式中，向受试者递送核苷修饰的RNA包括在接触步骤之前将核苷修饰的RNA与转染试剂混合。在另一个实施方式中，本发明的方法还包括将核苷修饰的RNA与转染试剂一起给予。在另一个实施方式中，转染试剂是阳离子脂质试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是阳离子聚合物试剂。

在另一个实施方式中，转染试剂是基于脂质的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是基于蛋白质的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是基于碳水化合物的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是基于阳离子脂质的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是基于阳离子聚合物的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是基于聚乙烯亚胺的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是磷酸钙。在另一个实施方式中，转染试剂是

在另一个实施方式中，转染试剂形成脂质体。在另一个实施方式中，脂质体增加细胞内稳定性，增加摄取效率并提高生物活性。在另一个实施方式中，脂质体是由以与构成细胞膜的脂质类似的方式排列的脂质组成的中空球形囊泡。在另一个实施方式中，它们具有用于包埋水溶性化合物的内部水性空间，并且尺寸在直径为0.05微米至几微米的范围内。在另一个实施方式中，脂质体可以以生物活性形式将RNA递送到细胞。

在一个实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)和本文描述的一种或多种核酸分子。例如，在一个实施方式中，组合物包含LNP和编码一种或多种抗原、佐剂或其组合的一种或多种核苷修饰的RNA分子。

术语“脂质纳米颗粒”是指具有至少一个纳米级尺寸(例如1-1,000nm)的颗粒，其包括一种或多种脂质，例如式(I)、(II)或(III)的脂质。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包含在包含本文描述的核苷修饰的RNA的制剂中。在一些实施方式中，此类脂质纳米颗粒包含阳离子脂质(例如，式(I)、(II)或(III)的脂质)和一种或多种赋形剂，所述赋形剂选自中性脂质、带电脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质(例如聚乙二醇化脂质，例如结构(IV)的聚乙二醇化脂质(例如化合物Iva)。在一些实施方式中，核苷修饰的RNA被包封在脂质纳米颗粒的脂质部分或被脂质纳米颗粒的部分或全部脂质部分包被的水性空间中，从而保护其免受酶促降解或由宿主生物体或细胞的机制诱导的其他不期望的影响，例如不利的免疫反应。

在各种实施方式中，脂质纳米颗粒的平均直径为约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm、或约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、或150nm，并且基本上是无毒的。在一些实施方式中，核苷修饰的RNA当存在于脂质纳米颗粒中时，在水溶液中耐核酸酶降解。

LNP可以包括能够形成颗粒的任何脂质，一个或多个核酸分子附接到该颗粒上，或者一个或多个核苷酸分子包封在该颗粒中。术语“脂质”是指一组有机化合物，它们是脂肪酸(如酯)的衍生物，通常以不溶于水但可溶于许多有机溶剂为特征。脂质通常至少分为三类：(1)“单纯脂质”，包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，包括磷脂和糖脂；和(3)“衍生的脂质”，如类固醇。

在一个实施方式中，LNP包含一种或多种阳离子脂质和一种或多种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质和聚乙二醇化脂质。

在一个实施方式中，LNP包括阳离子脂质。如本文使用的，术语“阳离子脂质”是指当pH降低到脂质的可离子化基团的pK以下时为阳离子或变为阳离子(质子化)的脂质，但在更高的pH值下逐渐变得更中性。在低于pK的pH值下，脂质然后能够与带负电荷的核酸结合。在一些实施方式中，阳离子脂质包括两性离子脂质，其在pH降低时呈现正电荷。

在一些实施方式中，阳离子脂质包括在选择性pH(例如生理pH)下携带净正电荷的多种脂质物质中的任何一种。这样的脂质包括但不限于，N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)；N-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)；N-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)；3-(N—(N′,N′-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰胺基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)、二十八烷基酰胺基甘氨酰基羧基精胺(DOGS)、1,2-二油酰基-3-二甲基丙烷铵(DODAP)、N,N-二甲基-2,3-二油酰基氧基)丙基胺(DODMA)、和N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵(DMRIE)。此外，可获得许多可用于本发明的阳离子脂质的商业制剂。这些包括例如，

在一个实施方式中，阳离子脂质是氨基脂质。适用于本发明的合适的氨基脂质包括WO 2012/016184中描述的那些，其全部内容通过引用并入本文。代表性氨基脂质包括但不限于，1,2-二亚油烯基氧基-3-(二甲氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油烯基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油烯基硫代-3-二甲氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油烯基氧基-3-二甲氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油烯基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油烯基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亚油烯基氨基)-1,2-丙烷二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基氨基)-1,2-丙烷二醇(DOAP)、1,2-二亚油烯基氧代-3-(2-N,N-二甲氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、和2,2-二亚油烯基-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)。

合适的氨基脂质包括具有下式的那些：

其中R1和R2相同或不同，并且独立地为可选取代的C

R3和R4相同或不同，并且独立地为可选取代的C

R5不存在或存在，并且当存在时为氢或C

m、n和p相同或不同，并且独立地为0或1，条件是m、n和p不同时为0；

q为0、1、2、3或4；且

Y和Z相同或不同，并且独立地为O、S或NH。

在一个实施方式中，R1和R2各自为亚油基，并且氨基脂质为二亚油基氨基脂质。在一个实施方式中，氨基脂质是二亚油基氨基脂质。

代表性的有用的二亚油基氨基脂质具有下式：

其中n为0、1、2、3或4。

在一个实施方式中，阳离子脂质是DLin-K-DMA。在一个实施方式中，阳离子脂质是DLin-KC2-DMA(上述DLin-K-DMA，其中n为2)。

在一个实施方式中，LNP的阳离子脂质组分具有式(I)的结构：

或其药用盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：

L

R

R

R

R

R

R

R

a和d各自独立地为0至24的整数；且

b和c各自独立地为1至24的整数；且

e为1或2。

在式(I)的一些实施方式中，R

在式(I)的又一实施方式中，R

当a为6时，R

在式(I)的其他实施方式中，R

在式(I)的一些实施方式中，L

在式(I)的一些实施方式中，L

在式(I)的一些实施方式中，L

在式(I)的一些其他实施方式中，L

在式(I)的其他实施方式中，L

应当理解，本说明书中使用的“碳-碳”双键是指以下结构之一：

其中R

在其他实施方式中，式(I)的脂质化合物具有以下结构(Ia)：

在其他实施方式中，式(I)的脂质化合物具有以下结构(Ib)：

在其他实施方式中，式(I)的脂质化合物具有以下结构(Ic)：

在式(I)的脂质化合物的一些实施方式中，a、b、c和d各自独立地为2至12的整数或4至12的整数。在其他实施方式中，a、b、c和d各自独立地为8至12或5至9的整数。在一些实施方式中，a为0。在一些实施方式中，a为1。在其他实施方式中，a为2。在更多实施方式中，a为3。在其他实施方式中，a为4。在一些实施方式中，a为5。在其他实施方式中，a为6。在更多实施方式中，a为7。在其他实施方式中，a为8。在一些实施方式中，a为9。在其他实施方式中，a为10。在更多实施方式中，a为11。在其他实施方式中，a为12。在一些实施方式中，a为13。在其他实施方式中，a为14。在更多实施方式中，a为15。在其他实施方式中，a为16。

在式(I)的一些其他实施方式中，b为1。在其他实施方式中，b为2。在更多实施方式中，b为3。在其他实施方式中，b为4。在一些实施方式中，b为5。在其他实施方式中，b为6。在更多实施方式中，b为7。在其他实施方式中，b为8。在一些实施方式中，b为9。在其他实施方式中，b为10。在更多实施方式中，b为11。在其他实施方式中，b为12。在一些实施方式中，b为13。在其他实施方式中，b为14。在更多实施方式中，b为15。在其他实施方式中，b为16。

在式(I)的一些更多实施方式中，c为1。在其他实施方式中，c为2。在更多实施方式中，c为3。在其他实施方式中，c为4。在一些实施方式中，c为5。在其他实施方式中，c为6。在更多实施方式中，c为7。在其他实施方式中，c为8。在一些实施方式中，c为9。在其他实施方式中，c为10。在更多实施方式中，c为11。在其他实施方式中，c为12。在一些实施方式中，c为13。在其他实施方式中，c为14。在更多实施方式中，c为15。在其他实施方式中，c为16。

在式(I)的一些其他实施方式中，d为0。在一些实施方式中，d为1。在其他实施方式中，d为2。在更多实施方式中，d为3。在其他实施方式中，d为4。在一些实施方式中，d为5。在其他实施方式中，d为6。在更多实施方式中，d为7。在其他实施方式中，d为8。在一些实施方式中，d为9。在其他实施方式中，d为10。在更多实施方式中，d为11。在其他实施方式中，d为12。在一些实施方式中，d为13。在其他实施方式中，d为14。在更多实施方式中，d为15。在其他实施方式中，d为16。

在式(I)的一些其他各种实施方式中，a和d是相同的。在一些其他实施方式中，b和c是相同的。在一些其他特定实施方式中，a和d是相同的，b和c是相同的。

式(I)中的a和b之和以及c和d之和是可以改变以获得具有所需性质的式(I)的脂质的系数。在一个实施方式中，a和b选择为使得它们之和是范围为14至24的整数。在其他实施方式中，c和d选择为使得它们之和是范围为14至24的整数。在进一步的实施方式中，a和b之和以及c和d之和是相同的。例如，在一些实施方式中，a和b之和以及c和d之和都是相同的整数，其可以在14至24的范围内。在更多的实施方式中，选择a、b、c和d，使得a和b之和以及c和d之和为12或更大。

在式(I)的一些实施方式中，e为1。在其他实施方式中，e为2。

式(I)的R

在式(I)的一些实施方式中，R

在式(I)的进一步实施方式中，R

在式(I)的一些实施方式中，R

在前述实施方式中，式(I)的R

在式(I)的前述实施方式中，R

在式(I)的前述实施方式中的一些其他实施方式中，R

在式(I)的一些不同实施方式中，R

在各种不同的实施方式中，式(I)的脂质具有下表1中所示的结构之一。

表1式(I)的代表性脂质

/>

/>

/>

/>

/>

/>

在一些实施方式中，LNP包含式(I)的脂质、核苷修饰的RNA和一种或多种选自中性脂质、类固醇和聚乙二醇化脂质的赋形剂。在一些实施方式中，式(I)的脂质是化合物I-5。在一些实施方式中，式(I)的脂质是化合物I-6。

在一些其他实施方式中，LNP的阳离子脂质组分具有式(II)的结构：

或其药用盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：L

G

G

G

R

R

R

R

R

R

R

R

a、b、c、和d各自独立地为1至24的整数；且

x是0、1或2。

在式(II)的一些实施方式中，L

–O(C＝O)-、-(C＝O)O-或直接键。在其他实施方式中，G

在式(II)的一些不同的实施方式中，L

在式(II)的其他前述实施方式中，脂质化合物具有以下结构(IIA)或(IIB)之一：

在式(II)的一些实施方式中，脂质化合物具有结构(IIA)。在其他实施方式中，脂质化合物具有结构(IIB)。

在式(II)的任何前述实施方式中，L

在式(II)的一些不同实施方式中，L

在式(II)的不同实施方式中，L

在式(II)的其他不同实施方式中，对于R

在式(II)的其他不同实施方式中，对于R

在式(II)的更多实施方式中，对于R

在式(II)的其他不同实施方式中，对于R

在式(II)的各种其他实施方式中，脂质化合物具有以下结构(IIC)或(IID)之一：

/>

其中e、f、g和h各自独立地为1至12的整数。

在式(II)的一些实施方式中，脂质化合物具有结构(IIC)。在其他实施方式中，脂质化合物具有结构(IID)。

在结构(IIC)或(IID)的各种实施方式中，e、f、g和h各自独立地为4至10的整数。

在式(II)的一些实施方式中，a、b、c和d各自独立地为2至12的整数或4至12的整数。在其他实施方式中，a、b、c和d各自独立地为8至12或5至9的整数。在一些实施方式中，a为0。在一些实施方式中，a为1。在其他实施方式中，a为2。在更多实施方式中，a为3。在其他实施方式中，a为4。在一些实施方式中，a为5。在其他实施方式中，a为6。在更多实施方式中，a为7。在其他实施方式中，a为8。在一些实施方式中，a为9。在其他实施方式中，a为10。在更多实施方式中，a为11。在其他实施方式中，a为12。在一些实施方式中，a为13。在其他实施方式中，a为14。在更多实施方式中，a为15。在其他实施方式中，a为16。

在式(II)的一些实施方式中，b为1。在其他实施方式中，b为2。在更多实施方式中，b为3。在其他实施方式中，b为4。在一些实施方式中，b为5。在其他实施方式中，b为6。在更多实施方式中，b为7。在其他实施方式中，b为8。在一些实施方式中，b为9。在其他实施方式中，b为10。在更多实施方式中，b为11。在其他实施方式中，b为12。在一些实施方式中，b为13。在其他实施方式中，b为14。在更多实施方式中，b为15。在其他实施方式中，b为16。

在式(II)的一些实施方式中，c为1。在其他实施方式中，c为2。在更多实施方式中，c为3。在其他实施方式中，c为4。在一些实施方式中，c为5。在其他实施方式中，c为6。在更多实施方式中，c为7。在其他实施方式中，c为8。在一些实施方式中，c为9。在其他实施方式中，c为10。在更多实施方式中，c为11。在其他实施方式中，c为12。在一些实施方式中，c为13。在其他实施方式中，c为14。在更多实施方式中，c为15。在其他实施方式中，c为16。

在式(II)的一些实施方式中，d为0。在一些实施方式中，d为1。在其他实施方式中，d为2。在更多实施方式中，d为3。在其他实施方式中，d为4。在一些实施方式中，d为5。在其他实施方式中，d为6。在更多实施方式中，d为7。在其他实施方式中，d为8。在一些实施方式中，d为9。在其他实施方式中，d为10。在更多实施方式中，d为11。在其他实施方式中，d为12。在一些实施方式中，d为13。在其他实施方式中，d为14。在更多实施方式中，d为15。在其他实施方式中，d为16。

在式(II)的一些实施方式中，e为1。在其他实施方式中，e为2。在更多实施方式中，e为3。在其他实施方式中，e为4。在一些实施方式中，e为5。在其他实施方式中，e为6。在更多实施方式中，e为7。在其他实施方式中，e为8。在一些实施方式中，e为9。在其他实施方式中，e为10。在更多实施方式中，e为11。在其他实施方式中，e为12。

在式(II)的一些实施方式中，f为1。在其他实施方式中，f为2。在更多实施方式中，f为3。在其他实施方式中，f为4。在一些实施方式中，f为5。在其他实施方式中，f为6。在更多实施方式中，f为7。在其他实施方式中，f为8。在一些实施方式中，f为9。在其他实施方式中，f为10。在更多实施方式中，f为11。在其他实施方式中，f为12。

在式(II)的一些实施方式中，g为1。在其他实施方式中，g为2。在更多实施方式中，g为3。在其他实施方式中，g为4。在一些实施方式中，g为5。在其他实施方式中，g为6。在更多实施方式中，g为7。在其他实施方式中，g为8。在一些实施方式中，g为9。在其他实施方式中，g为10。在更多实施方式中，g为11。在其他实施方式中，g为12。

在式(II)的一些实施方式中，h为1。在其他实施方式中，e为2。在更多实施方式中，h为3。在其他实施方式中，h为4。在一些实施方式中，e为5。在其他实施方式中，h为6。在更多实施方式中，h为7。在其他实施方式中，h为8。在一些实施方式中，h为9。在其他实施方式中，h为10。在更多实施方式中，h为11。在其他实施方式中，h为12。

在式(II)的一些其他各种实施方式中，a和d是相同的。在一些其他实施方式中，b和c是相同的。在一些其他特定实施方式中，a和d是相同的，b和c是相同的。

式(II)中的a和b之和以及c和d之和是可以改变以获得具有所需性质的脂质的因素。在一个实施方式中，a和b选择为使得它们之和是范围为14至24的整数。在其他实施方式中，c和d选择为使得它们之和是范围为14至24的整数。在进一步的实施方式中，a和b之和以及c和d之和是相同的。例如，在一些实施方式中，a和b之和以及c和d之和都是相同的整数，其可以在14至24的范围内。在更多的实施方式中，选择a、b、c和d，使得a和b之和以及c和d之和为12或更大。

式(II)的R

在式(II)的一些实施方式中，R

在式(II)的进一步实施方式中，R

在式(II)的一些实施方式中，R

在前述实施方式中，式(II)的R

在前述实施方式中，式(II)的R

在式(II)的各种前述实施方式中，R

在式(II)的前述实施方式中的一些其他实施方式中，R

在式(II)的一些不同实施方式中，R

在前述式(II)的脂质的其他实施方式中，G3为C

在各种不同的实施方式中，脂质化合物具有下表2中所示的结构之一。

表2式(II)的代表性脂质

/>

/>

/>

/>

/>

在一些实施方式中，LNP包含式(II)的脂质、核苷修饰的RNA和一种或多种选自中性脂质、类固醇和聚乙二醇化脂质的赋形剂。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-9。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-10。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-11。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-12。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-32。

在一些其他实施方式中，LNP的阳离子脂质组分具有式(III)的结构：

或其药用盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：

L

G

G

R

R

R

R

R

x是0、1或2。

在式(III)的前述实施方式中的一些中，脂质具有以下结构(IIIA)或(IIIB)之一：

其中：

A为3至8元环烷基或亚环烷基环；

R

n为范围从1至15的整数。

在式(III)的前述实施方式中的一些中，脂质具有结构(IIIA)，并且在其他实施方式中，脂质具有结构的(IIIB)。

在式(III)的其他实施方式中，脂质具有以下结构(IIIC)或(IIID)之一：

其中y和z各自独立地为范围从1至12的整数。

在式(III)的任何前述实施方式中，L

在式(III)的一些不同实施方式中，脂质具有以下结构(IIIE)或(IIIF)之一：

在式(III)的前述实施方式中的一些中，脂质具有以下结构(IIIG)、(IIIH)、(IIII)或(IIIJ)之一：

在式(III)的前述实施方式中的一些中，n是2至12的整数，例如2至8或2至4。例如，在一些实施方式中，n为3、4、5或6。在一些实施方式中，n为3。在一些实施方式中，n为4。在一些实施方式中，n为5。在一些实施方式中，n为6。

在式(III)的前述实施方式中的一些其他实施方式中，y和z各自独立地为2至10的整数。例如，在一些实施方式中，y和z各自独立地为4至9或4至6的整数。

在式(III)的前述实施方式中的一些中，R

在式(III)的一些实施方式中，G

在式(III)的一些其他前述实施方式中，R

其中：

R

a为从2至12的整数，

其中R

在式(III)的前述实施方式中的一些实施方式中，R

在式(III)的不同实施方式中，R

在式(III)的前述实施方式中的一些中，R

在各种不同的实施方式中，式(III)的阳离子脂质具有下表3中所示的结构之一。

表3

式(III)的代表性化合物

/>

/>

/>

/>

/>

在一些实施方式中，LNP包含式(III)的脂质、核苷修饰的RNA和一种或多种选自中性脂质、类固醇和聚乙二醇化脂质的赋形剂。在一些实施方式中，式(III)的脂质是化合物III-3。在一些实施方式中，式(III)的脂质是化合物III-7。

在一些实施方式中，阳离子脂质以约30摩尔％至约95摩尔％的量存在于LNP中。在一个实施方式中，阳离子脂质以约30摩尔％至约70摩尔％的量存在于LNP中。在一个实施方式中，阳离子脂质以约40摩尔％至约60摩尔％的量存在于LNP中。在一个实施方式中，阳离子脂质以约50摩尔％的量存在于LNP中。在一个实施方式中，LNP仅包含阳离子脂质。

在一些实施方式中，LNP包括一种或多种另外的脂质，其在颗粒形成期间稳定颗粒的形成。

合适的稳定脂质包括中性脂质和阴离子脂质。

术语“中性脂质”是指在生理pH下以不带电或中性两性离子形式存在的多种脂质物种中的任何一种。代表性的中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑脂醣苷。

示例性的中性脂质包括例如，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-一甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、和1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。在一个实施方式中，中性脂质是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。

在一些实施方式中，LNP包含选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM的中性脂质。在各种实施方式中，阳离子脂质(例如，式(I)的脂质)与中性脂质的摩尔比为约2:1至约8:1。

在各种实施方式中，LNP还包含类固醇或类固醇类似物。“类固醇”是一种包含以下碳骨架的化合物：

在一些实施方式中，类固醇或类固醇类似物是胆固醇。在这些实施方式中的一些中，阳离子脂质(例如，式(I)的脂质)与胆固醇的摩尔比为约2:1至1:1。

术语“阴离子脂质”是指在生理pH下带负电的任何脂质。这些脂质包括磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油和棕榈酰油酰基磷脂酰甘油(POPG)、以及连接到中性脂质的其他阴离子修饰基团。

在一些实施方式中，LNP包括糖脂(例如，单唾液酸神经节苷脂GM

在一些实施方式中，LNP包括聚合物缀合的脂质。术语“聚合物缀合的脂质”是指包含脂质部分和聚合物部分的分子。聚合物缀合的脂质的一个示例是聚乙二醇化脂质。术语“聚乙二醇化脂质”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。聚乙二醇化脂质是本领域已知的，并且包括1-(一甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-s-DMG)等。

在一些实施方式中，LNP包含额外的稳定脂质，其为聚乙二醇-脂质(聚乙二醇化脂质)。合适的聚乙二醇-脂质包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油。代表性的聚乙二醇-脂质包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA、和PEG-s-DMG。在一个实施方式中，聚乙二醇-脂质是N-[(甲氧基聚(乙二醇)

在一些实施方式中，LNP包含具有以下结构(IV)的聚乙二醇化脂质：

或其药用盐、互变异构体、或立体异构体，其中：

R

Z的平均值范围为30至60。

在聚乙二醇化脂质(IV)的前述实施方式中的一些中，当z为42时，R

在各种实施方式中，z跨越这样选择的范围，使得(II)的PEG部分具有约400g/mol至约6,000g/mol的平均分子量。在一些实施方式中，平均z为约45。

在其他实施方式中，聚乙二醇化脂质具有以下结构之一：

其中n是选择为使得聚乙二醇化脂质的平均分子量为约2,500g/mol的整数。

在一些实施方式中，另外的脂质以约1摩尔％至约10摩尔％的量存在于LNP中。在一个实施方式中，另外的脂质以约1摩尔％至约5摩尔％的量存在于LNP中。在一个实施方式中，另外的脂质以约1摩尔％或约1.5摩尔％的量存在于LNP中。

在一些实施方式中，LNP包括式(I)的脂质、核苷修饰的RNA、中性脂质、类固醇和聚乙二醇化脂质。在一些实施方式中，式(I)的脂质是化合物I-6。在不同的实施方式中，中性脂质是DSPC。在其他实施方式中，类固醇是胆固醇。在仍然不同的实施方式中，聚乙二醇化脂质是化合物IVa。

在一些实施方式中，LNP包括一个或多个靶向部分，其能够将LNP靶向细胞或细胞群体。例如，在一个实施方式中，靶向部分是将LNP导向存在于细胞表面上的受体的配体。

在一些实施方式中，LNP包括一个或多个内化结构域。例如，在一个实施方式中，LNP包含一个或多个与细胞结合以诱导LNP内化的结构域。例如，在一个实施方式中，一个或多个内化结构域与存在于细胞表面上的受体结合，以诱导受体介导的LNP摄取。在一些实施方式中，LNP能够在体内结合生物分子，其中LNP结合的生物分子然后可以被细胞表面受体识别以诱导内化。例如，在一个实施方式中，LNP结合系统ApoE，这导致LNP和相关货物(cargo)的摄取。

本领域中描述了其他示例性LNP及其制造，例如在美国专利申请公开第US20120276209号，Semple等，2010,Nat Biotechnol.,28(2):172-176；Akinc等，2010,MolTher.,18(7):1357-1364；Basha等，2011,Mol Ther,19(12):2186-2200；Leung等，2012,JPhys Chem C Nanomater Interfaces,116(34):18440-18450；Lee等，2012,Int JCancer.,131(5):E781-90；Belliveau等，2012,Mol Ther nucleic Acids,1:e37；Jayaraman等，2012,Angew Chem Int Ed Engl.,51(34):8529-8533；Mui等，2013,Mol TherNucleic Acids.2,e139；Maier等，2013,Mol Ther.,21(8):1570-1578；和Tam等，2013,Nanomedicine,9(5):665-74中，其各自的全部内容通过引证并入本文。

以下反应方案例示了制备式(I)、(II)或(III)的脂质的方法。

一般反应方案1

式(I)的脂质(例如化合物A-5)的实施方式可以根据一般反应方案1(“方法A”)制备，其中R是饱和或不饱和的C

一般反应方案2

式(I)化合物(例如化合物B-5)的其他实施方式可以根据一般反应方案2(“方法B”)制备，其中R是饱和或不饱和的C

应当注意，尽管起始材料A-1和B-1在上文中被描述为仅包括饱和亚甲基碳，但包括碳-碳双键的起始材料也可用于制备包括碳-碳双键的化合物。

一般反应方案3

式(I)的脂质(例如化合物C-7或C9)的不同实施方式可以根据一般反应方案3(“方法C”)制备，其中R是饱和或不饱和的C

一般反应方案4

式(II)的化合物(例如化合物D-5和D-7)的实施方式可根据一般反应方案4(“方法D”)制备，其中R

一般反应方案5

式(II)的脂质(例如化合物E-5)的实施方式可以根据一般反应方案5(“方法E”)制备，其中R

一般反应方案6

一般反应方案6提供了用于制备式(III)的脂质的示例性方法(方法F)。一般反应方案6中的G

应当注意，用于制备式(III)的脂质的各种替代策略对于本领域普通技术人员而言是可获得的。例如，其中L

本领域技术人员应理解，在本文描述的方法中，中间体化合物的官能团可能需要由合适的保护基团保护。这样的官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。适用于羟基的保护基团包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。用于氨基、脒基和胍基的合适保护基团包括叔丁氧基羰基、苄氧基羰基等。适用于巯基的保护基团包括-C(O)-R”(其中R”为烷基、芳基或芳基烷基)、对甲氧基苄基、三苯甲基等。适用于羧酸的保护基团包括烷基、芳基或芳基烷基酯。可以根据本领域技术人员已知的并且如本文描述的标准技术来添加或去除保护基团。Green,T.W.和P.G.M.Wutz,Protective Groups in Organic Synthesis(1999),第3版,Wiley中详细描述了保护基团的使用。如本领域技术人员所理解的，保护基团也可以是聚合物树脂，例如Wang树脂、Rink树脂或2-氯三苯甲基-氯化物树脂。

药物组合物

本文描述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知或随后开发的任何方法制备。通常，此类制备方法包含使活性成分与载体或一种或多种其他辅助成分结合的步骤，然后，如有必要或需要，将产品成型或包装成期望的单剂量或多剂量单位。

尽管本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合于伦理上给予于人的药物组合物，但本领域技术人员应理解此类组合物通常适用于给予于各种动物。为使组合物适合于对各种动物给予而对适合给予于人的药物组合物的修饰是众所周知的，并且普通熟练的兽医药理学家可以通过仅仅是普通的实验(如果有的话)设计和进行这种修饰。设想本发明的药物组合物的给予受试者包括但不限于人类和其他灵长类动物，哺乳动物包括商业上相关的哺乳动物，如非人灵长类动物、牛、猪、马、绵羊、猫和狗。

可用于本发明方法的药物组合物可以以在适用于眼科、口服、直肠、阴道、胃肠外、局部、肺部、鼻内、颊、静脉内、脑室内、皮内、肌内或其他给予途径的制剂中制备、包装或销售。其他设想的制剂包括喷射的纳米颗粒、脂质体制剂、含有活性成分的重新密封的红细胞和基于免疫原性的制剂。

本发明的药物组合物可以作为单个单位剂量或作为多个单个单位剂量成批地制备、包装或销售。如本文使用的，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的离散量的药物组合物。活性成分的量通常等于将给受试者给予的活性成分的剂量或这种剂量的方便分数，诸如例如，这种剂量的一半或三分之一。

本发明的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和任何另外的成分的相对量将根据所治疗受试者的特性、体型、和病况而变化，并进一步取决于给予该组合物的途径。举例来说，组合物可包含0.1％至100％(w/w)的活性成分。

除了活性成分之外，本发明的药物组合物还可以包括一种或多种额外的药物活性剂。

本发明的药物组合物的控释或缓释制剂可以使用常规技术制备。

如本文使用的，药物组合物的“肠胃外给予”包括任何给予途径，其特征在于对受试者组织的物理破裂和通过组织破裂给予药物组合物。因此，肠胃外给予包括但不限于通过注射组合物、通过手术切口给予组合物、通过穿透组织的非手术伤口给予组合物等来给予药物组合物。特别地，设想肠胃外给予包括但不限于眼内、玻璃体内、皮下、腹膜内、肌内、皮内、胸骨内注射、瘤内、静脉内、脑室内和肾透析输注技术。

适用于胃肠外给予的药物组合物的制剂包括与药学上可接受的载体(例如无菌水或无菌等渗盐水)组合的活性成分。这样的制剂可以以适合推注给予或连续给予的形式制备、包装或销售。可注射制剂可以以单位剂型制备、包装或销售，如安瓿或含有防腐剂的多剂量-容器。用于肠胃外给予的制剂包括但不限于悬浮液、溶液、油性或水性溶媒中的乳液、糊剂和植入式缓释或可生物降解制剂。此类制剂可还包含一种或多种额外成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外给予的制剂的一个实施方式中，活性成分以干燥(即粉末或颗粒)形式提供，用于在重构组合物的肠胃外给予之前用合适的溶媒(例如-无菌无热原水)重构。

药物组合物可以以无菌可注射的水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售。这种悬浮液或溶液可以根据已知技术配制，并且除了活性成分之外，还可以包括其他成分，例如本文描述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。这种无菌可注射制剂可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，例如水或--1,3-丁二醇来制备。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格溶液、等渗氯化钠溶液和固定油，如合成单甘油酯或双甘油酯-。其他有用的肠胃外可给予制剂包括那些包含微晶形式、脂质体制剂或作为生物可降解聚合物系统的组分的活性成分的制剂。用于缓释或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合物或疏水性材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶性聚合物或微溶性盐。

本发明的药物组合物可以以适于经由颊腔进行肺部给予的制剂形式制备、包装或销售。这种制剂可以包括干颗粒，该干颗粒包含活性成分，并且其直径在约0.5纳米至约7纳米的范围内。在一些实施方式中，制剂可以包括干颗粒，该干颗粒包含活性成分，并且其直径在约1纳米至约6纳米的范围内。这种组合物方便地为干粉形式，用于使用包括干粉储存器的装置给予，推进剂流可被引导至该干粉储存器以分散粉末，或者使用自推进溶剂/粉末分配容器(例如包括在密封容器中溶解或悬浮在低沸点推进剂中的活性成分的装置-)给予。-在一些实施方式中，这种粉末包括颗粒，其中按重量计至少98％的颗粒具有大于0.5纳米的直径，并且按数量计至少95％的颗粒具有小于7纳米的直径。在一些实施方式中，按重量计至少95％的颗粒具有大于1纳米的直径，并且按数量计至少90％的颗粒具有小于6纳米的直径。在一些实施方式中，干粉组合物包括固体细粉末稀释剂如糖，并且方便地以单位剂量形式提供。

低沸点推进剂通常包括在大气压下沸点低于65°F的液体推进剂。通常，推进剂可以构成组合物的50％(w/w)至99.9％(w/w)，并且活性成分可以构成组合物的0.1％(w/w)至20％(w/w)。推进剂可还包含额外成分，例如液体非离子或固体阴离子表面活性剂或固体稀释剂(在一些实例中具有与包含活性成分的颗粒相同数量级的粒度)。

适用于胃肠外给予的药物组合物的制剂包括与药学上可接受的载体(例如无菌水或无菌等渗盐水)组合的活性成分。这样的制剂可以以适合推注给予或连续给予的形式制备、包装或销售。可注射制剂可以以单位剂型制备、包装或销售，如安瓿或含有防腐剂的多剂量-容器。用于肠胃外给予的制剂包括但不限于悬浮液、溶液、油性或水性溶媒中的乳液、糊剂和植入式缓释或可生物降解制剂。此类制剂可还包含一种或多种额外成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外给予的制剂的一个实施方式中，活性成分以干燥(即粉末或颗粒)形式提供，用于在重构组合物的肠胃外给予之前用合适的溶媒(例如无菌无热原水)重构。

药物组合物可以以无菌可注射的水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售。这种悬浮液或溶液可以根据已知技术配制，并且除了活性成分之外，还可以包括其他成分，例如本文描述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。这种无菌可注射制剂可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，例如水或1,3-丁二醇来制备。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格溶液、等渗氯化钠溶液和固定油，如合成单甘油酯或双甘油酯-。其他有用的肠胃外可给予制剂包括那些包含微晶形式、脂质体制剂或作为生物可降解聚合物系统的组分的活性成分的制剂。用于缓释或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合物或疏水性材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶性聚合物或微溶性盐。

如本文使用的，“另外的成分”包括但不限于以下一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；造粒剂和崩解剂；粘结剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理上可降解的组合物，例如明胶；水性溶媒和溶剂；油性溶媒和溶剂；悬浮剂；分散剂或润湿剂；乳化剂、润肠剂；缓冲剂；盐类；增稠剂；填料；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；以及药学上可接受的聚合物或疏水性材料。可包含在本发明的药物组合物中的其他“另外的成分”是本领域已知的，并描述于例如“Remington's PharmaceuticalSciences(1985,Genaro编辑，,Mack Publishing Co.,Easton,PA)”中，其通过引用并入本文。

治疗方法

本发明提供了在受试者中诱导针对HCV的适应性免疫反应的方法，包括给予有效量的组合物，所述组合物包含一种或多种编码HCV p7蛋白和至少一种另外的HCV抗原的分离核酸。

在一个实施方式中，方法为受试者提供对HCV、HCV感染或与HCV相关的疾病或病症的免疫力。因此，本发明提供了一种治疗或预防与HCV相关的感染、疾病或病症的方法。

在一个实施方式中，将组合物给予具有与HCV相关的感染、疾病或病症的受试者。在一个实施方式中，将组合物给予有发展与HCV相关的感染、疾病或病症风险的受试者。例如，组合物可以给予有接触HCV风险的受试者。在一个实施方式中，将组合物给予生活在HCV流行的地理区域、前往或预计前往该地理区域的受试者。在一个实施方式中，将组合物给予与生活在HCV流行的地理区域、前往或预计前往该地理区域的另一个人接触或预计其接触的受试者。在一个实施方式中，将组合物给予通过其职业、性或其他接触而知情地暴露于HCV的受试者。

在一个实施方式中，该方法包括给予组合物，所述组合物包含编码HCV p7蛋白和至少一种另外的HCV抗原的一种或多种核苷修饰的核酸分子。

在一些实施方式中，该方法包括对受试者给予多个核苷修饰的mRNA分子，其中每个mRNA分子编码HCV p7蛋白和至少一种另外的HCV抗原。

在一个实施方式中，该方法包括给予一系列组合物作为谱系疫苗，所述组合物包含编码HCV p7蛋白和至少一种另外的HCV抗原的核苷修饰的核酸分子。在一些实施方式中，该方法包括交错给予多种组合物，其中每种组合物包含编码HCV p7蛋白和至少一种另外的HCV抗原的核苷修饰的核酸分子。

在一些实施方式中，本发明的方法允许本文描述的HCV p7蛋白、至少一种HCV抗原或佐剂在给予后持续表达至少几天。在一些实施方式中，本发明的方法允许本文描述的HCVp7蛋白、至少一种HCV抗原、蛋白质或佐剂在给予后持续表达至少2周。在一些实施方式中，本发明的方法允许本文描述的HCV p7蛋白、至少一种HCV抗原、或佐剂在给予后持续表达至少1个月。然而，在一些实施方式中，该方法还提供瞬时表达，因为在一些实施方式中，核酸没有整合到受试者基因组中。

在一些实施方式中，该方法包括给予核苷修饰的RNA，其提供本文描述的HCV p7蛋白、至少一种HCV抗原或佐剂的稳定表达。在一些实施方式中，给予核苷修饰的RNA导致很少或没有先天免疫反应，同时诱导有效的适应性免疫反应。

在一些实施方式中，该方法提供针对HCV的持续保护。例如，在一些实施方式中，该方法提供针对HCV的持续保护达大于2周。在一些实施方式中，该方法提供针对HCV的持续保护达1个月或更长。在一些实施方式中，该方法提供针对HCV的持续保护达2个月或更长。在一些实施方式中，该方法提供针对HCV的持续保护达3个月或更长。在一些实施方式中，该方法提供针对HCV的持续保护达4个月或更长。在一些实施方式中，该方法提供针对HCV的持续保护达5个月或更长。在一些实施方式中，该方法提供针对HCV的持续保护达6个月或更长。在一些实施方式中，该方法提供针对HCV的持续保护达1年或更长。

在一个实施方式中，组合物的单次免疫诱导针对HCV的持续保护达1个月或更长、2个月或更长、3个月或更长、4个月或更长、5个月或更长、6个月或更长、或1年或更长。

本发明组合物在治疗方法中的给予可以使用本领域已知的方法以多种不同的方式实现。在一个实施方式中，本发明的方法包括受试者的全身给予，包括例如肠内或肠胃外给予。在一些实施方式中，该方法包括组合物的皮内递送。在另一个实施方式中，方法包括组合物的静脉内递送。在一些实施方式中，方法包括组合物的肌肉内递送。在一个实施方式中，方法包括组合物的皮下递送。在一个实施方式中，方法包括组合物的吸入。在一个实施方式中，方法包括组合物的鼻内递送。

应当理解，本发明的组合物可以单独或与另一种试剂联合给予受试者。

因此，本发明的治疗和预防方法包括编码本文描述的HCV p7蛋白和至少一种另外的HCV抗原的药物组合物用于实践本发明的方法的用途。可用于实施本发明的药物组合物可被给予以递送1ng/kg/d至100mg/kg/d的剂量。在一个实施方式中，本发明设想了给予的剂量导致本发明化合物在哺乳动物中的浓度为10nM至10μM。

通常，在本发明的方法中，可给予哺乳动物，例如人类的剂量范围为每公斤哺乳动物体重0.01μg至约50mg，而给予的精确剂量将取决于许多因素，包括但不限于哺乳动物的类型和正在治疗的疾病状态的类型、哺乳动物的年龄和给予途径。在一些实施方式中，化合物的剂量将在每千克哺乳动物体重约0.1μg至约10mg变化。在一些实施方式中，剂量将在每千克哺乳动物体重约1μg至约1mg变化。

组合物可以以每天几次的频率给予哺乳动物，或者可以不太频繁地给予，例如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、或者甚至更不频繁，例如每隔几个月、每隔几年一次，或者甚至更不频繁，例如每隔10-20年、每隔15-30年一次，或者甚至更不频繁，例如每隔50-100年一次。剂量频率对本领域技术人员来说将是显而易见的，并且将取决于任何数量的因素，例如但不限于正在治疗的疾病的类型和严重程度、哺乳动物的类型和年龄等。

在一些实施方式中，本发明的免疫原性组合物或疫苗的给予可以通过单次给予进行或通过多次给予加强。

在一个实施方式中，本发明包括一种方法，该方法包括给予一种或多种编码HCVp7蛋白和至少一种HCV抗原的组合物。在一些实施方式中，该方法具有相加效应，其中给予HCV p7蛋白和至少一种HCV抗原的组合的总效应等于给予HCV p7蛋白和至少一种HCV抗原的效应的总和。在其他实施方式中，该方法具有协同效应，其中给予HCV p7蛋白和至少一种HCV抗原的组合的总效应大于给予HCV p7蛋白和至少一种HCV抗原的效应的总和。

实验实施例

通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅用于说明目的，除非另有规定，否则不旨在作为限制。因此，本发明不应被解释为局限于以下实施例，而是应被解释成包含由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。

在没有进一步描述的情况下，相信本领域的普通技术人员可以使用前面的描述和下面的说明性实施例来制作和利用本发明并实践要求保护的方法。因此，以下工作实施例不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。

实施例1：核苷修饰的mRNA疫苗接种对丙型肝炎病毒的保护作用

在体外研究了两种不同的mRNA构建体。它们都含有编码结构HCV蛋白C、E1和E2的mRNA。第二构建体还编码小病毒蛋白p7，其在感染性病毒组装和释放中发挥作用(图1A)。

蛋白质印迹(Western Blot)显示，蛋白C、E1和E2在几种常见细胞系的细胞裂解物中以其预期大小表达(图1B)。虽然p7本身太小，无法直接可视化，但研究表明，将p7包含在mRNA构建体中不会对其他病毒蛋白的表达产生负面影响。最初可视化病毒蛋白分泌到细胞上清液中的尝试没有成功，但仍在继续进行尝试。

对四个实验组进行了免疫原性研究(图2)。第一个，“-p7”，代表没有p7的疫苗构建体。第二个，“+p7”，代表包含p7蛋白的疫苗构建体。sE2是衍生自与用于mRNA疫苗的患者相同的患者的可溶性蛋白E2。它被包括在内是因为期望它能提供足够的免疫反应，作为mRNA构建体的比较。

图3示出了条形图，总结了在最低稀释度下用不同实验疫苗构建体免疫的小鼠血清的结合抗体反应。针对自体病毒蛋白(衍生自与衍生出疫苗序列相同的病毒的蛋白)，所有三个实验组(阴性对照、空LNP除外)都显示出相同的高水平结合(图3A)。针对异源病毒蛋白(即衍生自与衍生疫苗序列不同的病毒的蛋白。该病毒属于同一基因型1a，但从另一名患者身上分离出来)，-p7构建体显示出最小抗体结合。sE2构建体显示出中等水平结合。包含p7的构建体显示出高水平结合(图3B)。

这些曲线显示了来自所有实验组针对自体和异源病毒蛋白的结合抗体反应的完整数据。在左边，来自三种疫苗构建体(-p7、+p7和sE2)的曲线显示了在不同稀释液下对自体病毒蛋白的两种结合水平的相似性。在右边，曲线显示了不同结合水平，+p7化合物产生了更好的结合反应。

图3C示出了来自-p7和+p7组的每只小鼠的抗体结合。表明接受不含p7的mRNA构建体的小鼠具有可变的反应，包括3只未显示出结合的小鼠和2只对异源病毒伪颗粒具有中等或最小结合的小鼠。相比之下，用含有p7的mRNA构建体免疫的小鼠显示出与组中所有5只小鼠的高水平结合。在该构建体中包含p7似乎增加了免疫反应的效力以及接种者的反应率。

图4提供了饼形图，示出了由于结合构象表位与线性表位而导致的结合抗体反应的分解图。构象表位是蛋白质正确折叠时的3D组分，正如在循环中感染功能性病毒的情况下经常看到的那样。线性表位是根据其序列并排发现的氨基酸序列，而不是由于蛋白质的折叠模式而彼此靠近的氨基酸。它们可以存在于折叠和未折叠的蛋白质中，但构象表位主要可供仅在折叠蛋白质中的抗体识别。因此，构象表位的靶向对于疫苗构建体来说可能更可取，因为与真实感染的上下文具有更高的相关性。与异源病毒蛋白的结合代表在不同病毒变体中更广泛保守的表位的结合，而与自体病毒蛋白的结合可以针对该单个病毒特异性的表位或在病毒变体中广泛保守的表位。

由-p7构建体引发的自体和异源抗体结合反应(如图3所示)，主要针对线性表位，而不是构象表位(图4A)。

对于+p7构建体，几乎所有与自体病毒蛋白结合的抗体都是针对线性表位，而不是构象表位。然而，相比之下，靶向更广泛保守的表位(在异源病毒蛋白上发现)的抗体结合主要针对构象表位(图4B)。

与图4B类似，对于sE2蛋白，几乎所有针对自体病毒蛋白的反应都是针对线性表位的，但异源病毒蛋白的结合主要是针对构象表位的(图4C)。

这表明+p7构建体显示出作为疫苗构建体的更大的可取性，因为靶向广泛保守的构象表位可能导致对不同HCV病毒变体的更高水平的保护。

图5示出了中和测定的结果，其使用HCV伪颗粒来评估衍生自接种疫苗的小鼠的血清是否能够防止伪颗粒感染易感细胞。将小鼠血清以不同的稀释度递送到细胞中，以确定血清(及其内所含的抗体)能够多大程度地中和(即，防止伪颗粒感染细胞)在其表面上表达HCV E1和E2糖蛋白的伪颗粒。

针对自体病毒蛋白，–p7和+p7疫苗组在测试的最低稀释度(最高浓度)下显示出某种程度的中和(图5A)。对于-p7组，表现出中和的小鼠数量尚不清楚，因此正在重复这项研究以提供更多的清晰度，但似乎所有+p7小鼠都表现出对自体病毒伪颗粒的中和。相比之下，sE2组没有表现出中和。

针对异源病毒蛋白，–p7、+p7和sE2疫苗组没有显示出明显的中和(图5B)。

图6概述了用于鉴定广泛结合/中和抗体的额外免疫原性研究的实验设计。

实施例2：了解p7在丙型肝炎疫苗设计中的作用

本文提供的数据描述了HCV的mRNA-LNP疫苗的设计和优化。

结构蛋白(C、E1、E2)有利于纳入HCV疫苗中，因为它们能促进体液反应。非结构蛋白(NS)2-5B、C、E1和E2都促进细胞反应。然而，NS1(又名p7)在疫苗中的作用尚不清楚。本文提供的数据提供了具有和不具有p7的疫苗设计的头对头比较。

图7示出了病毒蛋白在细胞内表达，并且示出了包括p7导致显著更高的表达。病毒蛋白以预期的大小表达(在多个细胞系中)(图7A)。峰值表达出现在24小时(图7B)。+p7裂解物中的C蛋白明显高于-p7(图7C)。

图8示出了病毒蛋白在+/-p7中分泌，并且可以浓缩。病毒蛋白分泌到上清液中，在72小时达到峰值(图8A)。对+p7和-p7上清液的分析显示产生了E1E2异二聚体(图8B和图8C)。

设计了一项研究来测试p7对免疫原性的影响(图9)。-p7和+p7均可引发多功能CD4CD8 T细胞反应(图10)。相比之下，sE2没有引发功能性CD4或CD8反应。

设计了一项研究来测试p7对体内免疫原性的影响(图11)。包括p7导致异源构象表位的更高结合(图12)、更广泛的抗体结合(图13)、更好的整体中和(图14)和更广泛、更有效的多种HCV变体的中和(图15)。

因此，所提供的数据表明，在mRNA-LNP疫苗构建体中包括病毒蛋白p7可显著改善大量不同HCV变体的结合和中和。这似乎是由于当存在p7时，一般的病毒蛋白(特别是VLP)的表达和分泌得到改善。

实施例3：序列

在DNA合成之前，将所有免疫原构建体插入以下载体中：

2560_pUC-modTEV-A101(SEQ ID NO:1)

ccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgaattgtaatacgactcactataagcataaaagtctcaacacaacatatacaaaacaaacgaatctcaagcaatcaagcattctacttctattgcagcaatttaaatcatttcttttaaagcaaaagcaattttctgaaaattttcaccatttacgaacgatagcgctcgagatctactagtagtgactgactaggatctggttaccactaaaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacacttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacattctaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacttaagcggccgcgaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggca

免疫原构建体序列(DNA)

以下提供的免疫原基于图6的树标记为A-I。

HCV A CE1E2p7(SEQ ID NO:2)

atgtccaccaaccccaagccccagcgcaagaccaagcgcaacaccaaccgccgcccccaggacgtgaagttccccggcggcggccagatcgtgggcggcgtgtacctgctgccccgccgcggcccccgcctgggcgtgcgcgccacccgcaagacctccgagcggtcccagccccgcggccgccgccagcccatccccaaggcccgccgccccgagggccgcacctgggcccagcccggctacccctggcccctgtacggcaacgagggctgcggctgggccggctggctgctgtccccccgcggctcccgcccctcctggggccccaccgacccccgccgccgctcccgcaacctgggcaaggtgatcgacaccctgacctgcggcttcgccgacctgatgggctacatccccctgatcggcgcccccctgggcggcgccgcccgcgccctggcccacggcgtgcgcgtgctggaggacggcgtgaactacgccaccggcaacctgcccggctgctccttctccatcttcctgctggccctgctgtcctgcctgaccgtgcccgcctccgcctaccaggtgcgcaactccaccggcatctaccacgtgaccaacgactgccccaactcctccatcgtgtacgaggccgacaacgccatcctgcacacccccggctgcgtgccctgcgtgcgcgagggcaacgtgtccaagtgctgggtggccatgacccccaccgtggccacccgcgacggcaagctgcccaccacccagctgcgccgccacatcgacctgctggtgggctccgccaccctgtgctccgccctgtacgtgggcgacctgtgcggctccgtgttcctggtgggccagctgttcaccttctccccccgccgccactggaccacccaggagtgcaactgctccatctaccccggccacatcaccggccaccgcatggcctgggacatgatgatgaactggtcccccaccgccgccctggtggtggcccagctgctgcgcatcccccaggccatcgtggacatgatcgccggcgcccactggggcgtgctggccggcatcgcctacttctccatggtgggcaactgggccaaggtgctggtggtgctgctgctgttcgccggcgtggacgccaacaccgtgctgatcggcggccaggccgcctacaccgcctcctccttcaccgccctgctgacccccggcgccaagcagaacatccagctgatcaacaccaacggctcctggcacctgaaccgcaccgccctgaactgcaacgactccctgaacaccggctggctggccggcctgttctaccaccacaagttcaactcctccggctgccccgagcgcatggcctcctgccgccccctgaccgacttcgaccagggctggggccccatctcccacgccaacggctccggccccgaccagcgcccctactgctggcactaccccccccgcccctgcggcatcgtgcccgccaagaccgtgtgcggccccgtgtactgcttcaccccctcccccgtggtggtgggcaccaccgaccgcgccggcgcccccgcctacaactggggcgagaacgacaccgacgtgttcgtgctgaacaacacccgcccccccctgggcaactggttcggctgcacctggatgaactccaccggcttcaccaaggcctgcggcgcccccccctgcgccatcggcggcgtgggcaacaagaccctgtactgccccaccgactgcttccgcaagcaccccgaggccacctactcccgctgcggctccggcccctggatcaccccccgctgcctggtggactacccctaccgcctgtggcactacccctgcaccatcaactacaccgtgttcaagatccgcatgtacgtgggcggcgtggagcaccgcctggaggccgcctgcaactggacccgcggcgagcggtgcgacctggaggaccgcgaccgctccgagctgtcccccctgctgctgtccaccacccagtggcaggtgctgccctgctccttcaccaccctgcccgccctgtccaccggcctgatccacctgcaccagaacatcgtggacgtgcagtacctgtacggcgtgggctcctccatcgcctcctgggccatcaagtgggactacgtggtgctgctgttcctgctgctggccgacgcccgcgtgtgctcctgcctgtggatgatgctgctgatctcccaggtggaggccgccctggagaacctggtggtgctgaacgccgcctccctggccggcacccacggcctggtgtccttcctggtgttcttctgcttcgcctggtacctgaagggcaagtgggtgcccggcgccgtgtacgccatctacggcgtgtggcccctgctgctgctgctgctggccctgccccagcgcgcctacgcctaa

HCV B CE1E2p7(SEQ ID NO:3)

atgtccaccaaccccaagccccagcgcaagaccaagcgcaacaccaaccgccgcccccaggacgtgaagttccccggcggcggccagatcgtgggcggcgtgtacctgctgccccgccgcggcccccgcctgggcgtgcgcgccacccgcaagacctccgagcggtcccagccccgcggccgccgccagcccatccccaaggcccgccgccccgagggccgcacctgggcccagcccggctacccctggcccctgtacggcaacgagggctgcggctgggccggctggctgctgtccccccgcggctcccgcccctcctggggccccaccgacccccgccgccgctcccgcaacctgggcaaggtgatcgacaccctgacctgcggcttcgccgacctgatgggctacatccccctggtgggcgcccccctgggcggcgccgcccgcgccctggcccacggcgtgcgcgtgctggaggacggcgtgaactacgccaccggcaacctgcccggctgctccttctccatcttcctgctggccctgctgtcctgcctgaccgtgcccgcctccgcctaccaggtgcgcaactccaccggcatctaccacgtgaccaacgactgccccaactcctccatcgtgtacgaggccgacaacgccatcctgcacacccccggctgcgtgccctgcgtgcgcgagggcaacgtgtccaagtgctgggtggccatgacccccaccgtggccacccgcgacggcaagctgcccaccacccagctgcgccgccacatcgacctgctggtgggctccgccaccctgtgctccgccctgtacgtgggcgacctgtgcggctccgtgttcctggtgggccagctgttcaccttctccccccgccgccactggaccacccaggagtgcaactgctccatctaccccggccacatcaccggccaccgcatggcctgggacatgatgatgaactggtcccccaccgccgccctggtggtggcccagctgctgcgcatcccccaggccatcgtggacatgatcgccggcgcccactggggcgtgctggccggcatcgcctacttctccatggtgggcaactgggccaaggtgctggtggtgctgctgctgttcgccggcgtggacgccaacaccgtgctgatcggcggccgcgccgcccacaccgcctcctccttcaccgccttcttcacccccggcgccaagcagaacatccagctgatcaacaccaacggctcctggcacctgaaccgcaccgccctgaactgcaacgactccctggacaccggctggctggccggcctgttctaccaccacaagttcaactcctccggctgccccgagcgcatggcctcctgccgccccctgaccgacttcgaccagggctggggccccatctcccacgccaacggctccggccccgaccagcgcccctactgctggcactaccccccccgcccctgcggcatcgtgcccgccaagaccgtgtgcggccccgtgtactgcttcaccccctcccccgtggtggtgggcaccaccgaccgcgccggcgcccccgcctacaactggggcgagaacgacaccgacgtgttcgtgctgaacaacacccgcccccccctgggcaactggttcggctgcacctggatgaactccaccggcttcaccaaggcctgcggcgcccccccctgcgccatcggcggcgtgggcaacaagaccctgtactgccccaccgactgcttccgcaagcaccccgaggccacctactcccgctgcggctccggcccctggatcaccccccgctgcctggtgcactacccctaccgcctgtggcactacccctgcaccatcaactacaccgtgttcaagatccgcatgtacgtgggcggcgtggagcaccgcctggaggccgcctgcaactggacccgcggcgagcggtgcgacctggaggaccgcgaccgctccgagctgtcccccctgctgctgtccaccacccagtggcaggtgctgccctgctccttcaccaccctgcccgccctgtccaccggcctgatccacctgcaccagaacatcgtggacgtgcagtacctgtacggcgtgggctcctccatcgcctcctgggccatcaagtgggactacgtggtgctgctgttcctgctgctggccgacgcccgcgtgtgctcctgcctgtggatgatgctgctgatctcccaggtggaggccgctatgcaccagaacatcgtggacgtgcagtacctgtacggcgtgggctcctccgtggcctcctgggccatcaagtgggagtacgtggtgctgctgttcctgctgctggccgacgcccgcgtgtgctcctgcctgtggatgatgttcctgatctcccaggtggaggccgccctggagaacctggtgatcctgaacgccgcctccctggccggcacccacggcctggtgtccttcctggtgttcttctgcttcgcctggtacctgaagggccgctgggtgcccggcgccgcctacgccctgtacggcatgtggcccctgctcctgctcctgctcgccctgccccagcgcgcctacgcctaa

HCV C CE1E2p7(SEQ ID NO:4)

atgtccaccaaccccaagccccagcgcaagaccaagcgcaacaccaaccgccgcccccaggacgtgaagttccccggcggcggccagatcgtgggcggcgtgtacctgctgccccgccgcggcccccgcctgggcgtgcgcgccacccgcaagacctccgagcggtcccagccccgcggccgccgccagcccatccccaaggcccgccgccccgagggccgcacctgggcccagcccggctacccctggcccctgtacggcaacgagggctgcggctgggccggctggctgctgtccccccgcggctcccgcccctcctggggccccaccgacccccgccgccgctcccgcaacctgggcaaggtgatcgacaccctgacctgcggcttcgccgacctgatgggctacatccccctggtgggcgcccccctgggcggcgccgcccgcgccctggcccacggcgtgcgcgtgctggaggacggcgtgaactacgccaccggcaacctgcccggctgctccttctccatcttcctgctggccctgctgtcctgcctgaccgtgcccgcctccgcctaccaggtgcgcaactccaccggcatctaccacgtgaccaacgactgccccaactcctccatcgtgtacgaggccgacaacgccatcctgcacacccccggctgcgtgccctgcgtgcgcgagggcaacgtgtccaagtgctgggtggccatgacccccaccgtggccacccgcgacggcaagctgcccaccacccagctgcgccgccacatcgacctgctggtgggctccgccaccctgtgctccgccctgtacgtgggcgacctgtgcggctccgtgttcctggtgggccagctgttcaccttctccccccgccgccactggaccacccaggagtgcaactgctccatctaccccggccacatcaccggccaccgcatggcctgggacatgatgatgaactggtcccccaccgccgccctggtggtggcccagctgctgcgcatcccccaggccatcgtggacatgatcgccggcgcccactggggcgtgctggccggcatcgcctacttctccatggtgggcaactgggccaaggtgctggtggtgctgctgctgttcgccggcgtggacgccaacaccgtgctgatcggcgagcgcgccgcccacgccgcctcctccttcaccgccttcctgacccccggcgccaagcagaacatccagctgatcaacaccaacggctcctggcacctgaaccgcaccgccctgaactgcaacgactccctggacaccggctggctggccggcctgttctaccaccacaagttcaactcctccggctgccccgagcgcatggcctcctgccgccccctgaccgactacgaccagggctggggccccatctcccacgccaacggctccggccccgaccagcgcccctactgctggcactaccccccccgcccctgcggcatcgtgcccgccaagaccgtgtgcggccccgtgtactgcttcaccccctcccccgtggtggtgggcaccaccgaccgcgccggcgcccccgcctacaactggggcgagaacgacaccgacgtgttcgtgctgaacaacacccgcccccccctgggcaactggttcggctgcacctggatgaactccaccggcttcaccaaggcctgcggcgcccccccctgcgccatcggcggcgtgggcaacaagaccctgtactgccccaccgactgcttccgcaagcaccccgaggccacctactcccgctgcggctccggcccctggatcaccccccgctgcctggtgcactacccctaccgcctgtggcactacccctgcaccatcaactacaccgtgttcaagatccgcatgtacgtgggcggcgtggagcaccgcctggaggccgcctgcaactggacccgcggcgagcggtgcgacctggaggaccgcgaccgctccgagctgtcccccctgctgctgtccaccacccagtggcaggtgctgccctgctccttcaccaccctgcccgccctgtccaccggcctgatccacctgcaccagaacatcgtggacgtgcagtacctgtacggcgtgggctcctccatcgcctcctgggccatcaagtgggactacgtggtgctgctgttcctgctgctggccgacgcccgcgtgtgctcctgcctgtggatgatgctgctgatctcccaggtggaggccgccctggagaacctggtggtgctgaacgccgcctccctggccggcacccacggcctggtgtccttcctggtgttcttctgcttcgcctggtacctgaagggcaagtgggtgcccggcgccgtgtacgccatctacggcgtgtggcccctgctgctgctgctgctggccctgccccagcgcgcctacgcctaa

HCV D CE1E2p7(SEQ ID NO:5)

atgtccaccaaccccaagccccagcgcaagaccaagcgcaacaccaaccgccgcccccaggacgtgaagttccccggcggcggccagatcgtgggcggcgtgtacctgctgccccgccgcggcccccgcctgggcgtgcgcgccacccgcaagacctccgagcggtcccagccccgcggccgccgccagcccatccccaaggcccgccgccccgagggccgcacctgggcccagcccggctacccctggcccctgtacggcaacgagggctgcggctgggccggctggctgctgtccccccgcggctcccgcccctcctggggccccaccgacccccgccgccgctcccgcaacctgggcaaggtgatcgacaccctgacctgcggcttcgccgacctgatgggctacatccccctggtgggcgcccccctgggcggcgccgcccgcgccctggcccacggcgtgcgcgtgctggaggacggcgtgaactacgccaccggcaacctgcccggctgctccttctccatcttcctgctggccctgctgtcctgcctgaccgtgcccgcctccgcctaccaggtgcgcaactccaccggcatctaccacgtgaccaacgactgccccaactcctccatcgtgtacgaggccgacaacgccatcctgcacacccccggctgcgtgccctgcgtgcgcgagggcaacgtgtccaagtgctgggtggccatgacccccaccgtggccacccgcgacggcaagctgcccaccacccagctgcgccgccacatcgacctgctggtgggctccgccaccctgtgctccgccctgtacgtgggcgacctgtgcggctccgtgttcctggtgggccagctgttcaccttctccccccgccgccactggaccacccaggagtgcaactgctccatctaccccggccacatcaccggccaccgcatggcctgggacatgatgatgaactggtcccccaccgccgccctggtggtggcccagctgctgcgcatcccccaggccatcgtggacatgatcgccggcgcccactggggcgtgctggccggcatcgcctacttctccatggtgggcaactgggccaaggtgctggtggtgctgctgctgttcgccggcgtggacgccaacaccgtgctgatcggcgagcgcgccgcccgcgccgcctcctccttcaccgccttcctgaaccccggcgccaagcagaacatccagctgatcaacaccaacggctcctggcacctgaaccgcaccgccctgaactgcaacgactccctggacaccggctggctggccggcctgttctaccaccacaagttcaactcctccggctgccccgagcgcatggcctcctgccgccccctgaccgactacgaccagggctggggccccatctcccacgccaacggctccggccccgaccagcgcccctactgctggcactaccccccccgcccctgcggcatcgtgcccgccaagaccgtgtgcggccccgtgtactgcttcaccccctcccccgtggtggtgggcaccaccgaccgcgccggcgcccccgcctacaactggggcgagaacaacaccgacgtgttcgtgctgaacaacacccgcccccccctgggcaactggttcggctgcacctggatgaactccaccggcttcaccaaggcctgcggcgcccccccctgcgccatcggcggcgtgggcaacaagaccctgtactgccccaccgactgcttccgcaagcaccccgaggccacctactcccgctgcggctccggcccctggatcaccccccgctgcctggtgcactacccctaccgcctgtggcactacccctgcaccatcaactacaccgtgttcaagatccgcatgtacgtgggcggcgtggagcaccgcctggaggccgcctgcaactggacccgcggcgagcggtgcgacctggaggaccgcgaccgctccgagctgtcccccctgctgctgtccaccacccagtggcaggtgctgccctgctccttcaccaccctgcccgccctgtccaccggcctgatccacctgcaccagaacatcgtggacgtgcagtacctgtacggcgtgggctcctccatcgcctcctgggccatcaagtgggactacgtggtgctgctgttcctgctgctggccgacgcccgcgtgtgctcctgcctgtggatgatgctgctgatctcccaggtggaggccgccctggagaacctggtggtgctgaacgccgcctccctggccggcacccacggcctggtgtccttcctggtgttcttctgcttcgcctggtacctgaagggcaagtgggtgcccggcgccgtgtacgccatctacggcgtgtggcccctgctgctgctgctgctggccctgccccagcgcgcctacgcctaa

HCV E CE1E2p7(SEQ ID NO:6)

atgtccaccaaccccaagccccagcgcaagaccaagcgcaacaccaaccgccgcccccaggacgtgaagttccccggcggcggccagatcgtgggcggcgtgtacctgctgccccgccgcggcccccgcctgggcgtgcgcgccacccgcaagacctccgagcggtcccagccccgcggccgccgccagcccatccccaaggcccgccgccccgagggccgcacctgggcccagcccggctacccctggcccctgtacggcaacgagggctgcggctgggccggctggctgctgtccccccgcggctcccgcccctcctggggccccaccgacccccgccgccgctcccgcaacctgggcaaggtgatcgacaccctgacctgcggcttcgccgacctgatgggctacatccccctggtgggcgcccccctgggcggcgccgcccgcgccctggcccacggcgtgcgcgtgctggaggacggcgtgaactacgccaccggcaacctgcccggctgctccttctccatcttcctgctggccctgctgtcctgcctgaccgtgcccgcctccgcctaccaggtgcgcaactccaccggcatctaccacgtgaccaacgactgccccaactcctccatcgtgtacgaggccgacaacgccatcctgcacacccccggctgcgtgccctgcgtgcgcgagggcaacgtgtccaagtgctgggtggccatgacccccaccgtggccacccgcgacggcaagctgcccaccacccagctgcgccgccacatcgacctgctggtgggctccgccaccctgtgctccgccctgtacgtgggcgacctgtgcggctccgtgttcctggtgggccagctgttcaccttctccccccgccgccactggaccacccaggagtgcaactgctccatctaccccggccacatcaccggccaccgcatggcctgggacatgatgatgaactggtcccccaccgccgccctggtggtggcccagctgctgcgcatcccccaggccatcgtggacatgatcgccggcgcccactggggcgtgctggccggcatcgcctacttctccatggtgggcaactgggccaaggtgctggtggtgctgctgctgttcgccggcgtggacgccaacaccgtgctgatcggcgaccgcgccgcccgcgccgcctcctccttcaccgccttcctgaaccccggcgccaagcagaacatccagctgatcaacaccaacggctcctggcacctgaaccgcaccgccctgaactgcaacgactccctggacaccggctggctggccggcctgttctactaccacaagttcaactcctccggctgccccgagcgcatggcctcctgccgccccctgaccgactacgaccagggctggggccccatctcccacgccaacggctccggccccgaccagcgcccctactgctggcactaccccccccgcccctgcggcatcgtgtccgccaagaccgtgtgcggccccgtgtactgcttcaccccctcccccgtggtggtgggcaccaccgaccgcgccggcgcccccgcctacaactggggcgagaacaacaccgacgtgttcgtgctgaacaacacccgcccccccctgggcaactggttcggctgcacctggatgaactccaccggcttcaccaaggcctgcggcgcccccccctgcgccatcggcggcgtgggcaacaagaccctgtactgccccaccgactgcttccgcaagcaccccgaggccacctactcccgctgcggctccggcccctggatcaccccccgctgcctggtgcactacccctaccgcctgtggcactacccctgcaccatcaactacaccgtgttcaagatccgcatgtacgtgggcggcgtggagcaccgcctggaggccgcctgcaactggacccgcggcgagcggtgcgacctggaggaccgcgaccgctccgagctgtcccccctgctgctgtccaccacccagtggcaggtgctgccctgctccttcaccaccctgcccgccctgtccaccggcctgatccacctgcaccagaacatcgtggacgtgcagtacctgtacggcgtgggctcctccatcgcctcctgggccatcaagtgggactacgtggtgctgctgttcctgctgctggccgacgcccgcgtgtgctcctgcctgtggatgatgctgctgatctcccaggtggaggccgccctggagaacctggtggtgctgaacgccgcctccctggccggcacccacggcctggtgtccttcctggtgttcttctgcttcgcctggtacctgaagggcaagtgggtgcccggcgccgtgtacgccatctacggcgtgtggcccctgctgctgctgctgctggccctgccccagcgcgcctacgcctaa

HCV F CE1E2p7(SEQ ID NO:7)

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HCV G CE1E2p7(SEQ ID NO:8)

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本文引用的每一项专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用其全部内容并入本文。虽然已经参考特定实施方式公开了本发明，但是很明显，在不脱离本发明的真正精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计本发明的其他实施方式和变化。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等同变化。