水稻Os11g0229500基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及分子生物学育种技术领域，尤其涉及水稻Os11g0229500基因及其编码蛋白与应用。

背景技术

我国水稻种植历史悠久，稻区种植面积辽阔。据国家水稻数据中心统计，自1984年以来，共审定937个品种，但是由于各地自然生态环境和水稻种质资源的明显差异，不同的品种只能种植于特定的维度区域，长期以来逐渐形成我国南籼北粳的稻作方式。粳稻品种普遍具米质较好、经济效应高的优点，缺点是抗病性差。南方籼稻却相反，具有抗病性强的特性，但米质较差，经济效应低。显然区域的限制阻碍了优质种质资源的交流和优质水稻品种的种植面积。而跨区域种植如北粳南移或者南稻北种，既能促进种质资源的交流，又能提高优良种植资源的种植面积，已成为育种工作者重要的研究方向。但在引种过程中，由于不同纬度日照长短的差异，导致同一品种在不同区域具有不同的抽穗期。这种抽穗期的延迟或者缩短直接影响了品种对特定生态地区光温资源的利用程度，进而影响水稻的产量和品质。因此，水稻抽穗期的调控是优良品种跨纬度种植的需要解决的重要课题之一。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供提升玉米广谱病虫害遗传抗性的靶基因及其应用。

本发明的第一方面提供调控水稻抽穗期的Os11g0229500基因，所述Os11g0229500基因的核苷酸序列包括或由以下序列组成：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或

2)由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经过添加、取代或缺失一个或几个碱基且能够编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明的第二方面提供上述的Os11g0229500基因编码的水稻粒型蛋白，所述蛋白的氨基酸序列包括或由以下序列组成：

a)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或

b)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中添加、缺失、替换一个或多个氨基酸且具有相同蛋白活性的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，Os11g0229500基因编码的水稻粒型蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，Os11g0229500基因编码的水稻粒型蛋白为在SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列中添加、缺失、替换一个或多个(例如可以为1-10个或更多，具体地，可以为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)氨基酸且具有相同蛋白活性的氨基酸序列。

本发明的第三方面提供上述的Os11g0229500基因、水稻粒型蛋白在水稻抽穗期调控育种上的应用。

在本发明的一种实施方式中，通过敲除或沉默水稻中所述的Os11g0229500基因促进水稻开花。

在本发明的一种实施方式中，通过超表达水稻中所述的Os11g0229500基因推迟水稻开花。

本发明的第四方面提供用于特异性敲除或沉默Os11g0229500基因的序列、重组敲除或沉默载体或转化体在培育短生育期的水稻品种中的应用。

在本发明的一种实施方式中，用于特异性敲除Os11g0229500基因的序列如SEQ IDNo.5所示。

本发明还提供用于检测敲除上述基因的转基因植物的引物，所述的引物对由JC-F和JC-R组成；其中所述的JC-F由SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列组成；所述的JC-R由SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列组成；即：

JC-F:5’-AAATTCCATCAAAAAGCAGA-3’(SEQ ID NO.3)；

JC-R:5’-ACAACCAAAAATAACATCGG-3’(SEQ ID NO.4)。

本发明的第五方面提供一种培育短生育期水稻品种的方法，通过将水稻中上述的Os11g0229500基因敲除或沉默实现。具体敲除方式可采用如CRISPR-Cas技术完成。

本发明的有益效果是：

本发明提供能够调控水稻抽穗期的Os11g0229500基因，通过对Os11g0229500基因进行敲除、沉默或超表达，以调控水稻提前或推迟开花，从而达到调控水稻抽穗期的目的，为优良种植资源的跨维度种植提供条件。同时，通过基因编辑敲除或沉默Os11g0229500基因，可培育得到短生育期的水稻品种。本发明提供的Os11g0229500基因对水稻的抽穗期调控效果明显，经基因编辑成功的株系，与野生型相比，其生育期缩短15到25天，可显著缩短水稻生育期。

附图说明

图1.水稻基因的序列分析及基因Os11g0229500编辑靶点设计。黑色方框表示外显子，黑色线条表示内含子。Cas9识别序列位于第一外显子的10bp处。

图2.Cas9介导的不同基因型的获得。WT为野生型序列，阿拉伯数字表示发生缺失或增加的碱基数(数字前面加“-”表碱基缺失，数字前面加“+”表碱基增加)，小写字母为添加碱基。

图3.CRISPR/Cas9基因编辑纯合突变体与野生型的抽穗期。WT为野生型对照植株，#1和#7为不同基因型突变植株。

图4.CRISPR/Cas9基因编辑纯合突变体与野生型的粒型考察。WT为野生型对照植株，#1和#7为不同基因型突变植株。

图5.CRISPR/Cas9基因编辑纯合突变体与野生型的主要农艺性状分析。WT为野生型对照植株，#1和#7为不同基因型突变植株。

具体实施方式

下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例均按照常规实验条件或按照厂商说明书建议的条件进行。除非另行定义，本发明中所使用的所有专业术语具有与本领域的技术人员通常理解的相同的含义。此外，任何与所记载内容相似或相同的方法及材料都可用于本发明方法中，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，按照常规方法或制造商建议的进行。所用的材料、试剂和耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1水稻基因的序列分析及基因编辑靶点设计

水稻基因Os11g0229500如序列SEQ ID No.1所示。序列分析显示，该基因含有7个外显子，分别为序列表中第1-592(第一外显子)、第692-722(第二外显子)、第812-1045(第三外显子)、第1278-1322(第四外显子)、第1498-1601(第五外显子)、第1728-1861(第六外显子)、第2256-2366(第七外显子)、第3117-3404(第八外显子)。

本发明实施例所采用实验品种为闽恢3301材料，在基因Os11g0229500的第一外显子2-25bp处设计一个Cas9识别位点，如图一所示。识别靶序列(sgRNA)分别为：GGAGTTGGATCTGAACAACGTGG。

实施例2打靶载体构建及水稻遗传转化

本实施例采用的基因编辑技术为第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9，所使用的载体为人工合成重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA(环形载体)，骨架载体pCXUN-Cas9为市面上订购的常见线性载体，本实施例的购自北京唯尚立德生物材料科技有限公司，Cas9蛋白序列全长4206个碱基对，编码1401个氨基酸。其表达由Ubiquitin启动子驱动，gRNA由U6启动子驱动。gRNA片段由引物合成公司合成后通过DNA连接酶连接在U6启动子之后形成重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA(环形载体)。

将载体pCXUN-Cas9-gRNA转化粳稻、籼稻和糯稻的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法实现遗传转化，并经抗性愈伤的筛选、分化和生根创制新的红米品种，以下秀水134和冈优8515为例进行介绍，具体步骤如下：

1、将成熟的水稻种子脱壳并消毒后接种于诱导培养基(NB培养基+2,4-D2mg/L，pH5.8)中，28℃暗培养7天，切除胚根继续培养7天后，将胚性愈伤转移到新的诱导培养基中，每隔15天继代一次。继代三次后的自然分散、颜色鲜黄、直径约为3mm的颗粒状愈伤可用于农杆菌转化。

2、取少量重组农杆菌菌液划线于YEB固体培养基(含有卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L，pH5.8)上，28℃暗培养48h进行活化；取活化平板上的单菌落转接划菌，28℃暗培养培养两天，用AAM培养基(含有100μM/L乙酰丁香酮，pH5.2)洗菌及重悬菌体，调整菌液浓度至OD600nm＝1.5-2.0，静置1h，得到农杆菌悬浮液。

3、将步骤1得到的胚性愈伤浸泡于步骤2的农杆菌悬浮液中，静置30min后于无菌滤纸上晾干愈伤，并接种于共培养基(NB培养基+2,4-D 2mg/L+乙酰丁香酮100μM/L，pH5.8)中，25℃暗培养3d。

4、挑取步骤3共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。最后一次用含250mg/L羧苄青霉素的无菌水静置1h，然后置于无菌滤纸上晾干愈伤组织，接种于筛选培养基(NB培养基+2,4-D 2mg/L+羧苄青霉素250mg/L+hygromycin 50mg/L，pH5.8)中，28℃暗培养，每两周转接1次，约需三周即可见瘤状鲜黄色抗性愈伤从褐化干瘪的愈伤中长出。

5、将步骤4获得的抗性愈伤转移至分化培养基(NB培养基+2,4-D 2mg/L+KT 10mg/L+NAA 0.4mg/L，pH5.8)上，2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随后根也长出。将幼苗移至生根培养基(1/2MS培养基，pH5.8)上，待幼苗生根长成后，洗净根上的培养基，移栽实验基地。

实施例3基因编辑体的基因型检测及表型考察

提取转化植株基因组DNA，用引物CZT-F(5'GGGAGATCCAGCTAGAGGTC 3')和CZT-R(5'GGAAGGAGGAAGACAAGG3')进行PCR扩增鉴定转基因植株。进一步用目的基因的引物970-F:5'AAATTCCATCAAAAAGCAGA3'和970-R:5'ACAACCAAAAATAACATCGG3'PCR扩增上述鉴定的转基因植株基因组DNA，获得带有靶序列的基因片段，并送往公司测序。对测序结果进行分析，发现基因有4种基因型如图2所示，其中包含了双等位修饰和纯合突变三种类型的编辑方式。进一步在福州田间种植观察到突变植株#1和#7的抽穗期，相比野生型抽穗期提前了15天(参见图3)。观察了突变株系的粒型变化，并没有明显的差异(参见图4)。而在其他产量相关性状如分蘖数千粒重和单株产量差异不显著(参见图5)。

本发明所述蛋白包含编码一个AP2/EREBP家族转录因子。其编码蛋白定位于细胞核中。与野生型相比，突变蛋白在长日照和短日照条件下分别提早开花15和25天。突变体中主效光周期基因的表达分析表明，Ehd1基因及其下游调控基因Hd3a和FRT的表达在突变体中明显升高，说明该基因是一个开花抑制因子。可见，通过增强或减弱该基因可以用来解决水稻跨区域育种带来的抽穗期不合适问题，对优良籼稻资源的适应性、品种多样性和水稻种质资源交流和互补方面有重要的作用。

本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得基因突变体，与TALEN和ZFN技术相比，操作过程简单方便，节约成本，一般实验室都可操作。本发明获得的早花水稻品种经过后代自交分离，可筛选去除转基因外源片段，与转基因育种相比具有更广阔的应用前景，与常规的杂交育种相比，大大节约了时间成本，是一种新的获得早花品系的分子育种方法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。