一种ZIF-8涂层改性的锌基底植入物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种制备金属锌表面涂层的方法及其在生物医学工程中的应用，具体涉及一种ZIF-8涂层改性的锌基底植入物及其制备方法。

背景技术

根据世界卫生组织预测，2030年在全球范围内死于心血管疾病的人数将达到2200万人。其中，由心血管狭窄或阻塞而引发的冠心病，具有极高发病率与死亡率。相比药物治疗和外科手术，支架植入术的成功率高、创伤小因而表现出明显优势，已成为一种临床上普遍采用的治疗方法。植入过程中，压缩在球囊上的血管支架将通过球囊导管系统输送到血管病变段，之后随球囊扩张而撑开，此时金属支架产生了塑性形变，在球囊收缩回收后持续提供径向支撑力，保持血管的畅通。近年来，随着我国人口老龄化不断加剧，并且心血管疾病又逐渐呈现年轻化的趋势，血管支架的需求日益增加。2020年底，我国正式将冠脉支架纳入医保，集采后的支架单价降低至几百元，大幅减轻了广大患者的负担。

目前临床上应用的血管支架由耐腐蚀的惰性医用金属制造而成，如316L不锈钢、钴基合金、镍钛合金等。这种永久性的支架在植入后将长期存在于患者体内，容易导致血管慢性炎症、晚期血栓、支架内再狭窄等不良事件，威胁患者的生命健康。理想的解决方案是开发一种生物可降解支架，在植入早期为病变血管提供充分的支撑作用，待病变血管恢复正常功能后，支架材料逐渐地降解并被人体吸收或清除，必要时可再进行二次植入。由于具有良好的生物相容性、力学性能和加工优势，以镁、锌及其合金为代表的可降解金属被广泛应用于可降解血管支架的制造领域。锌是人体所必需的微量元素之一，对细胞生长和分化、免疫系统以及神经系统都起着重要的调节作用。此外，相比于镁合金，锌合金因拥有更适中的低降解速率而更适于用作支架的材料。但过快释放的锌离子不利于细胞的粘附、生长及增殖，甚至导致细胞的死亡。因此，如何调控可降解金属的降解速率和降解行为，使其降解过程与周围受损血管组织的修复过程相匹配，成为限制可降解支架临床应用的一个关键问题。

金属有机框架(Metal-Organic Frameworks，MOFs)是一种以金属原子或团簇为中心，有机化合物为配体通过配位键自组装形成的多孔状纳米材料。作为最著名的MOFs之一，沸石咪唑酯骨架材料(Zeolitic Imidazolate Frame-8，ZIF-8)由锌(II)盐和2-甲基咪唑组成，其具有高比表面积、规整的晶体结构等优点。ZIF-8可以被看作一种非常有效的缓蚀剂，作为有机涂层的纳米填料有效增强其耐蚀性能。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提出一种利用ZIF-8涂层改性锌基底植入物的方法及其制备方法和应用，通过制备ZIF-8涂层，实现对锌基底植入物的改性，以延缓其在体内降解。该发明的目标是通过ZIF-8涂层的保护作用，有效调节金属锌的降解速率，提高其细胞相容性，使其能够与周围受损血管组织的修复过程相匹配。

一种ZIF-8涂层改性的锌基底植入物的制备方法，包括：

步骤一：将锌基底植入物浸泡在有机溶剂中进行超声清洗，去除锌基底植入物表面的有机物质；

步骤二：然后将锌基底植入物在稀盐酸溶液中浸泡，待其表面产生气泡，此时，锌基底植入物上产生锌离子；

步骤三：将锌基底植入物浸泡在2-甲基咪唑甲醇溶液中，使锌基底植入物上面的锌离子与2-甲基咪唑水溶液充分反应；

步骤四：向反应溶液中加入和2-甲基咪唑水溶液同体积的六水合硝酸锌甲醇溶液，使溶液置于37℃环境中反应，使锌基底植入物上产生预设厚度的ZIF-8涂层；

其中，所述2-甲基咪唑与六水合硝酸锌的摩尔比为1:7。

步骤五：将带有预设厚度的ZIF-8涂层的锌基底植入物浸入甲醇中超声清洗，干燥，得到ZIF-8涂层改性的锌基底植入物。

进一步地，所述有机溶剂为无水乙醇或丙酮。

进一步地，所述稀盐酸溶液的质量浓度为0.005％-0.01％。

进一步地，所述2-甲基咪唑甲醇溶液的浓度为0.5mM。

进一步地，所述步骤四中使锌基底植入物上产生预设厚度的ZIF-8涂层的反应时间为72小时。

进一步地，所述锌基底植入物为锌导丝。

一种由上述方法制备得到的ZIF-8涂层改性的锌基底植入物。

一种由ZIF-8涂层改性的锌基底植入物制成的植入性锌基血管支架。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明制备方法可以在锌基底植入物上产生预设厚度的ZIF-8涂层，增加了材料的可控性和灵活性，为特定应用提供了更为精确的材料。

(2)ZIF-8涂层可以作为一种保护层，保护锌基底植入物不受到过快的降解和腐蚀，从而提高植入物的稳定性和使用寿命。

(3)通过在锌基底植入物上形成ZIF-8涂层，可以有效降低锌在体内的降解速度，从而增强其与人体组织的相容性，减少潜在的炎症或不良反应。

(4)该方法提及了使用锌导丝作为基底，但理论上它可以扩展到其他类型的锌基植入物，从而具有更广泛的应用潜力。

(5)该技术可以用于制备植入性锌基血管支架，这种新型支架可能具有更好的生物相容性和更佳的治疗效果，为临床应用提供了一个新的选择。

附图说明

图1为金属有机框架(ZIF-8)纳米颗粒的形貌表征；其中，左图为ZIF-8纳米颗粒的扫描电镜(SEM)图；中图为ZIF-8纳米颗粒的透射电镜(TEM)图；右图为ZIF-8纳米颗粒的粒径分析结果。

图2为ZIF-8涂层改性的锌片的形貌表征；其中，图a、b为ZIF-8涂层表面的扫描电镜(SEM)图；图c、d为ZIF-8涂层截面的扫描电镜(SEM)图。

图3为ZIF-8涂层改性的锌片的组成成分表征；其中，图a为ZIF-8涂层的能量色散X射线光谱(EDS)图；图b为ZIF-8涂层的傅里叶红外(FT-IR)图；图c为ZIF-8涂层的x射线衍射(XRD)图。

图4为ZIF-8涂层改性的锌片经过三次反复弯折后的SEM图片。

图5为纯锌片(上图，Bare Zn)和ZIF-8涂层改性的锌片(下图，ZIF-8coating)浸泡于Hanks平衡盐溶液前后的SEM图片。

图6为纯锌片(Bare Zn)和ZIF-8涂层改性的锌片(ZIF-8coating)浸泡于Hanks平衡盐溶液后的溶液pH和锌离子浓度变化；其中图a为溶液pH变化；图b为溶液中锌离子浓度检测结果。

图7为ZIF-8涂层改性的锌片(ZIF-8coating)浸泡于Hanks平衡盐溶液72小时后，浸出液的溶血测试。

图8为脐静脉内皮细胞(HUVEC)在纯锌片(Bare Zn)和ZIF-8涂层改性的锌片(ZIF-8coating)上培养48小时后的细胞SEM图片。

图9为纯锌片(Bare Zn)和ZIF-8涂层改性的锌片(ZIF-8coating)浸泡于Hanks平衡盐溶液72小时后，浸出液的细胞毒性检测结果图。

图10为纯锌导丝(Bare Zn)和ZIF-8涂层改性的锌导丝(ZIF-8coating)植入大鼠腹主动脉1个月后的micro-CT图。

图11为纯锌导丝(Bare Zn)和ZIF-8涂层改性的锌导丝(ZIF-8coating)植入大鼠腹主动脉1个月后的血管组织切片HE染色图。

具体实施方式

下面根据附图和优选实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明白，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

1.物理化学性能检测

首先，将厚度为2mm的锌片裁剪成10mm*15mm的尺寸，然后进行以下步骤：3M(1500目)砂纸打磨1分钟，然后将其浸泡在无水乙醇中超声清洗5分钟，去除锌片表面的有机物质，然后将锌片在0.01M的稀盐酸溶液中浸泡1分钟，待其表面产生气泡，此时，锌片上产生锌离子；将锌片浸泡在浓度为0.5mM的2-甲基咪唑甲醇溶液中平衡60分钟，使锌基底上面的锌离子与2-甲基咪唑充分反应；向反应溶液中加入和2-甲基咪唑甲醇溶液同体积的浓度为3.5mM的六水合硝酸锌甲醇溶液，静置于室温60分钟，最后将溶液置于37℃环境中反应72小时，使锌片上产生预设厚度的ZIF-8涂层；将带有预设厚度的ZIF-8涂层的锌片浸入甲醇中超声清洗，干燥，得到ZIF-8涂层改性的锌片。分别对溶液中的ZIF-8纳米颗粒和ZIF-8涂层修饰后的锌片进行物理化学检测。

(1)ZIF-8纳米颗粒表征：通过透射电子显微镜(Transmission electronmicroscopy,TEM)和扫描电子显微镜(SEM)来观察ZIF-8材料形貌；运用动态光散射仪(Dynamic light scattering,DLS)检测ZIF-8纳米颗粒的粒径及Zeta电位。

(2)ZIF-8涂层表征：使用SEM观察ZIF-8涂层改性的锌基底表面形貌，并通过配套的能量色散X射线光谱仪(EDS)分析样品表面的元素组成与分布；利用能谱仪(Energydispersive spectrometer,EDS)分析纳米颗粒的成分组成；利用X射线衍射仪(X-raydiffraction,XRD)、傅立叶变换红外光谱仪(Fourier transforminfrared spectroscopy,FT-IR)分析ZIF-8涂层的化学组成和结构；采用光学视频接触角分析仪表征纯锌基底及ZIF-8涂层改性的锌片表面的水接触角。

实验结果如下：通过对溶液中收集到的纳米颗粒进行形貌表征发现，该体系下合成的ZIF纳米颗粒分散性较好，呈现为规则的十二面体结构颗粒(如图1的左图和中图)，粒径约在500nm左右(如图1的右图)；复合ZIF-8结构的形貌特征，如图1中的左图所示；运用DLS检测ZIF-8纳米颗粒的Zeta电位为14.37±0.94mV，证明其具有良好的分散性且呈电正性。

利用扫描电镜对ZIF-8涂层改性的锌基底进行形貌表征，如图2中的a和b所示的涂层表面形貌所示，ZIF-8涂层改性的锌基底表面平整光滑；如图2中的c和d所示的涂层截面形貌所示，ZIF-8涂层厚度大约为400nm。利用能谱仪(EDS)分析纳米颗粒的成分分析发现，ZIF-8涂层由C、N、O和Zn组成(图3a)；分别对纯锌基底(Bare Zn)和ZIF-8涂层改性的锌基底(ZIF-8coating)进行傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析，ZIF-8coating的谱图显示出ZIF-8的特征吸收峰：在421cm

2.涂层稳定性检测

(1)为了研究涂层的牢固度，我们将ZIF-8涂层改性的锌片样品反复弯折3次，利用SEM观察涂层的表面形貌。

(2)为了研究纯锌片及ZIF-8涂层改性的锌片的降解行为和降解速率，将相同大小的纯锌片及ZIF-8涂层改性的锌片样品分别浸入20mL平衡盐溶液(Hanks，pH 6.7)中，然后保持37±0.5℃浸泡。利用扫描电镜对纯锌片及ZIF-8涂层改性的锌片进行形貌观察，并使用ICP-MS测定浸提液中的Zn

实验结果如下：如图4所示，ZIF-8涂层改性的锌片样品反复弯折3次后，涂层未发生断裂和脱落，说明ZIF-8涂层具有非常好的牢固度。

为了研究ZIF-8涂层在体外的长效防腐蚀性能，将纯锌片及ZIF-8涂层改性的锌片样品浸泡在Hanks中进行了静态浸泡实验。图5展示了纯锌片(Bare Zn)和ZIF-8涂层改性的锌片(ZIF-8coating)浸泡前后的表面形貌。由图可见，浸泡72小时天后，纯锌片表面被絮状的腐蚀产物覆盖，出现了泡沫结构，表明其被腐蚀；而ZIF-8coating表面未见明显的腐蚀破坏并保持整体完整，仅有少量的腐蚀产物附着。

由于在浸泡过程中，锌腐蚀产生的两种离子，OH

3.溶血试验

根据ISO 10993-4标准，使用抗凝兔血(含2.5wt％柠檬酸钠)进行溶血实验，检测ZIF-8涂层改性的锌片的血液相容性。首先将5mL的生理盐水和4mL抗凝猪兔血混合配置了稀释血液。随后将ZIF-8涂层改性的锌片样品放置于15mL离心管中，每个离心管不同体积的生理盐水(样品表面积/生理盐水体积为3:1)，不含样品的生理盐水和超纯水分别作为阴性/阳性对照。将上述离心管置于37℃恒温水浴槽内0.5h，之后每个离心管内加入0.2mL稀释血液并充分混匀，37℃水浴条件下继续浸泡。最后，以3000rpm离心5min，并用酶标仪测量上清液在吸光度，测试波长为540nm。通过以下公式计算每个样品的溶血率(HR)：

式中，Ai是样品的吸光度(％)，An是阴性对照组的吸光度(％)，Ap是阳性对照组的吸光度(％)

实验结果如下：如图7ZIF-8涂层改性的锌片溶血率实验结果所示，溶血率均低于5％，根据标准材料溶血性能评估的标准实施规程(ASTM F756-08)，未见对红细胞造成明显的破坏性影响，满足生物材料对溶血率百分比的要求。

4.细胞相容性测试

生物材料用之于血管支架会植入到血管内必将与内皮细胞相接处，因此我们选取人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究对象，评估HUVEC细胞对浸提液的耐受性，对指导选择支架用生物材料有一定参考意义。实验中使用的培养基为含有10％胎牛血清(FBS)和1％双抗(青霉素-链霉素)的DMEM培养基；在含有5％ CO

(1)直接法：纯锌片及ZIF-8涂层改性的锌片样品通过双面紫外光辐照灭菌30min，并分别放置在24孔细胞培养板中。然后将1mL含有6.0×10

(2)间接法：将体外浸泡实验中收集到的浸提液过滤灭菌，并用于间接评估纯锌片及ZIF-8涂层改性的锌片样品的细胞毒性。具体地，首先在96孔细胞培养板中，每孔加入100μL的HUVEC细胞悬浮液(每毫升1×10

实验结果如下：血管植入材料表面的细胞相容性是影响支架表面内皮化进程的重要因素之一。由于金属锌的快速腐蚀，释放出的过量OH

为了评价不同样品降解产物的细胞毒性，将浸泡实验中收集的浸提液与培养基混合，配置成各种浓度的稀释浸提液，然后将HUVEC细胞在其中培养24h后，通过CCk-8法分析细胞活力，实验过程中以培养基作为阴性对照组。如图9所示，纯锌片及ZIF-8涂层改性的锌片的浸提液在低浓度时都表现出一定的促增殖的效果；在高浓度时，纯锌片提取液表现出较强的细胞毒性，ZIF-8涂层改性的锌片浸提液未表现出细胞毒性，这是因为ZIF-8涂层延缓了金属锌片的降解速度，使涂层样品浸提液的pH变化较小，释放出的Zn

5.体内降解分析

通过动物实验研究了纯锌基底及ZIF-8涂层改性的锌基底在动物体内的降解情况，同时表征了纯锌基底及ZIF-8涂层改性的锌基底样品植入后的血管修复情况。植入物为长10mm，直径0.1mm的纯锌导丝和ZIF-8涂层改性的锌导丝。根据ISO 10993-6-2016标准，将上述两种导丝植入SD大鼠皮下进行实验。

皮下植入手术：所有动物实验步骤均经浙江大学实验动物管理和动物福利伦理委员会批准。实验随机选取了6只体重约200-275g的雄性SD大鼠。手术前将健康大鼠在环境适宜的动物实验房饲养1周，然后随机分为两组，每组3只。麻醉大鼠后(大鼠翻正反射消失确定为麻醉成功)，将大鼠门齿及四肢分别固定于手术台上，使大鼠呈俯卧位。剃须消毒后，在每只大鼠背部做两个切口，将经双面紫外线消毒的样品置于大鼠背部的皮下组织，随后缝合切口。饲养12周后，处死大鼠，切除植入物及周围1cm左右的组织。取出的植入物用10％甲醛溶液固定，然后用梯度乙醇脱水备用。

体内降解试验：为了评估镁植入物的体内降解情况，首先通过Micro-CT对取出的植入物进行扫描。

HE病理检测：将表面含有周围组织的植入物，用10％甲醛溶液固定，并在石蜡包埋前用梯度乙醇脱水。随后进行组织切片(厚度约5μm)，经脱蜡、复水步骤后，用苏木素和伊红染色，乙醇溶液清洗后，采用中性树脂封片，倒置显微镜下观察拍照。

实验结果如下：如图10所示，在植入4周后，在micro-CT的2D重建图中观察到纯锌导丝表现出严重的腐蚀(腐蚀部位为深色部分)。相比之下，ZIF-8涂层改性的锌导丝样品中的锌基底腐蚀较轻，这充分证明了ZIF-8涂层在体内具有长效防腐蚀性能。

纯锌导丝和ZIF-8涂层改性的锌导丝植入物周围组织H&E染色切片的显微镜图片如图11所示。所有与植入物表面紧密结合的组织都出现了成纤维细胞的明显增殖。在纯锌导丝植入物周围组织中观察到许多红细胞和严重的炎症细胞浸润现象，还观察到由于腐蚀产生的氢气泡破裂造成的组织损伤。在ZIF-8涂层改性后，ZIF-8涂层改性的锌导丝植入物周围组织仅显示出轻微的炎症反应和较少的红细胞，没有发现因氢气泡而造成的组织损伤。这是由于ZIF-8涂层具有最佳的长效防腐蚀性能，有效减低了金属锌的腐蚀产物对周围组织产生的毒性和破坏，最终有效减轻了ZIF-8涂层改性金属锌导丝周围组织的炎症反应。

通过上述的ZIF-8涂层改性金属锌导丝和锌片的试验结果，充分证明了采用ZIF-8涂层改性的锌基底制成的植入性锌基血管支架能够具备相同的有益效果，改性后的涂层能够有效地调控植入性锌基血管支架上金属锌的降解速率，使其能够与周围受损血管组织的修复过程相匹配，进一步提高了修复效果。

本领域普通技术人员可以理解，以上所述仅为发明的优选实例而已，并不用于限制发明，尽管参照前述实例对发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实例记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在发明的精神和原则之内，所做的修改、等同替换等均应包含在发明的保护范围之内。