一种NK细胞中表达IL-15的mRNA序列

技术领域

本发明属于细胞技术领域，涉及表达IL-15的mRNA序列，具体涉及NK细胞中表达IL-15的mRNA序列。

背景技术

自然杀伤细胞(Natural killer，NK)是主要的天然免疫成员，在防御疾病包括恶性肿瘤的第一防线中发挥重要作用。与获得性免疫系统的细胞(例如T细胞)相比，NK细胞无需预先刺激或致敏即可启动细胞毒活性，从而提供即时的自然反应。NK细胞对肿瘤的杀伤优势表现在直接溶解和分泌细胞因子两个方面，其杀伤肿瘤既可通过穿孔素又可通过FAS配基。NK细胞可以产生TNF-α、IFN-γ和IL-1，这些细胞因子在NK细胞抗癌反应以及调动T淋巴细胞中有十分重要地位。由于NK细胞具有快速的杀伤作用和广泛的靶细胞，提示NK细胞可以用于治疗恶性肿瘤。研究证明，过继转输体外活化、扩增自体或同种异体NK细胞对治疗多种白血病和实体瘤有效。

然而，NK细胞在人体内的寿命时间比较短，大概有半个月左右。IL-15因子在NK细胞中的表达可以延长NK细胞的存活时间，增强NK细胞的细胞毒活性。然而，IL-15的mRNA序列在NK细胞中表达不高。

目前，亟需一种在NK细胞中表达很好的IL-15mRNA序列。

发明内容

本发明的目的在于提供一种NK细胞中表达IL-15的mRNA序列，其使得IL-15蛋白在NK细胞中更有效的表达。

本发明提供的一种NK细胞，所述NK细胞中生成由IL-15的mRNA序列表达的蛋白。

进一步地，所述IL-15的mRNA序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6所示序列中的任一。

进一步地，所述IL-15基因的mRNA序列优选为如SEQ ID NO.6所示。

本发明提供的一种NK细胞的制备方法，所述制备方法包括步骤：得到纯化后的mRNA，培养NK细胞，将mRNA电转入NK细胞。

进一步地，所述IL-15的mRNA序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6所示序列中的任一，所述IL-15基因的mRNA序列优选为如SEQ ID NO.6所示。

进一步地，所述制备方法用于非治疗疾病目的。

本发明提供的任意所述NK细胞在延长NK细胞存活时间中的应用。

本发明的有益技术效果：

本发明通过优化IL-15信号肽序列以及IL-15mRNA 3'UTR的选择序列，即将IL-15mRNA的序列优化，因此能够在NK细胞中很好的表达；可以进一步延长NK细胞在人体内的寿命时间，增强NK细胞的细胞毒活性。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明PCR产物的电泳结果；其中，1：Marker、2：S-IL15-SV40-1、3：S-IL15-SV40-2、4：S-IL15-SV40-3、5：S-IL15-Hbb-1、6：S-IL15-Hbb-2、7：S-IL15-Hbb-3、8：S-IgG-SV40-1、9：S-IgG-SV40-2、10：S-IgG-SV40-3、11：S-IgG-Hbb-1、12：S-IgG-Hbb-2、13：S-IgG-Hbb-3；

图2为本发明PCR产物的电泳结果；其中，1：Marker、2：S-IL2-SV40-1、3：S-IL2-SV40-2、4：S-IL2-SV40-3、5：S-IL2-Hbb-1、6：S-IL2-Hbb-2、7：S-IL2-Hbb-3；

图3为本发明的DNA转录得到的mRNA加尾前的电泳图；其中，M：Marker、1：S-IL15-SV40、2：S-IL15-Hbb、3：S-IgG-SV40、4：S-IgG-Hbb、5：S-IL2-SV40、6：S-IL2-Hbb；

图4为本发明的DNA转录得到的mRNA加尾后的电泳图；其中，M：Marker、1：S-IL15-SV40、2：S-IL15-Hbb、3：S-IgG-SV40、4：S-IgG-Hbb、5：S-IL2-SV40、6：S-IL2-Hbb；

图5为本发明的SNK电转mRNA后上清液中IL-15的释放结果。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

LE Agarose购自Lonza，GelRed购自BIOTIUM，10×上样缓冲液购自Takara，Trans 2K DNA Marker R55Hbb code：BM101，无水乙醇，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；HiScribe

术语解释：自然杀伤细胞(Natural killer cells NK cells)，是人体天然免疫细胞中的重要组分，NK细胞可以通过表面TCR和相关的CD3分子的缺失，以及CD56的表达来鉴定，在宿主抗肿瘤免疫中具有重要作用。

本发明所使用的序列如下：

T7启动子序列

TAATACGACTCACTATAGG

Sequence 1：IG信号肽序列

atggactggacctggatcctgttcctggtggccgccgccacacgggtgcacagc

Sequence 2：IL-2信号肽序列

atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagt

Sequence 3：IL-15信号肽序列

ATGAGAATTTCGAAACCACATTTGAGAAGTATTTCCATCCAGTGCTACTTGTGTTTACTTCTAAACAGTCATTTTCTAACTGAAGCTGGCATTCATGTCTTCATTTTGGGCTGTTTCAGTGCAGGGCTTCCTAAAACAGAAGCC

Sequence 4：IL-15编码序列

AACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCCAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGAGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCCTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGAAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTSequence 5：3'UTR Hbb

GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAA

Sequence6：3’UTR SV40

CTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTT

引物序列如下：

下游引物(SV40-R)：AAAAAACCTCCCACATCTCCCCC

下游引物(Hbb-R)：TTGCAATGAAAATAAATGTT

采用本发明的方法，基因扩增的最终mRNA基因序列如下：

IL-15蛋白的mRNA序列如SEQ ID No.1所示。

UAAUACGACUCACUAUAGG

AUGAGAAUUUCGAAACCACAUUUGAGAAGUAUUUCCAUCCAGUGCUACUUGUGUUUACUUCUAAACAGUCAUUUUCUAACUGAAGCUGGCAUUCAUGUCUUCAUUUUGGGCUGUUUCAGUGCAGGGCUUCCUAAAACAGAAGCC

AACUGGGUGAAUGUAAUAAGUGAUUUGAAAAAAAUUGAAGAUCUUAUUCAAUCUAUGCAUAUUGAUGCUACUUUAUAUACGGAAAGUGAUGUUCACCCCAGUUGCAAAGUAACAGCAAUGAAGUGCUUUCUCUUGGAGUUACAAGUUAUUUCACUUGAGUCCGGAGAUGCAAGUAUUCAUGAUACAGUAGAAAAUCUGAUCAUCCUAGCAAACAACAGUUUGUCUUCUAAUGGGAAUGUAACAGAAUCUGGAUGCAAAGAAUGUGAGGAACUGGAGAAAAAAAAUAUUAAAGAAUUUUUGCAGAGUUUUGUACAUAUUGUCCAAAUGUUCAUCAACACUUCU

CUUCCCUUUAGUGAGGGUUAAUGCUUCGAGCAGACAUGAUAAGAUACAUUGAUGAGUUUGGACAAACCACAACUAGAAUGCAGUGAAAAAAAUGCUUUAUUUGUGAAAUUUGUGAUGCUAUUGCUUUAUUUGUAACCAUUAUAAGCUGCAAUAAACAAGUUAACAACAACAAUUGCAUUCAUUUUAUGUUUCAGGUUCAGGGGGAGAUGUGGGAGGUUUUUUAAAAAACCUCCCACAUCUCCCCC

IL-15蛋白的mRNA序列如SEQ ID No.2所示。

UAAUACGACUCACUAUAGG

AUGAGAAUUUCGAAACCACAUUUGAGAAGUAUUUCCAUCCAGUGCUACUUGUGUUUACUUCUAAACAGUCAUUUUCUAACUGAAGCUGGCAUUCAUGUCUUCAUUUUGGGCUGUUUCAGUGCAGGGCUUCCUAAAACAGAAGCC

AACUGGGUGAAUGUAAUAAGUGAUUUGAAAAAAAUUGAAGAUCUUAUUCAAUCUAUGCAUAUUGAUGCUACUUUAUAUACGGAAAGUGAUGUUCACCCCAGUUGCAAAGUAACAGCAAUGAAGUGCUUUCUCUUGGAGUUACAAGUUAUUUCACUUGAGUCCGGAGAUGCAAGUAUUCAUGAUACAGUAGAAAAUCUGAUCAUCCUAGCAAACAACAGUUUGUCUUCUAAUGGGAAUGUAACAGAAUCUGGAUGCAAAGAAUGUGAGGAACUGGAGAAAAAAAAUAUUAAAGAAUUUUUGCAGAGUUUUGUACAUAUUGUCCAAAUGUUCAUCAACACUUCU

GCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCAAUUGCAAUGAAAAUAAAUGUU

IL-15蛋白的mRNA序列如SEQ ID No.3所示。

UAAUACGACUCACUAUAGG

AUggacUggaccUggaUccUgUUccUggUggccgccgccacacgggUgcacagc

AACUGGGUGAAUGUAAUAAGUGAUUUGAAAAAAAUUGAAGAUCUUAUUCAAUCUAUGCAUAUUGAUGCUACUUUAUAUACGGAAAGUGAUGUUCACCCCAGUUGCAAAGUAACAGCAAUGAAGUGCUUUCUCUUGGAGUUACAAGUUAUUUCACUUGAGUCCGGAGAUGCAAGUAUUCAUGAUACAGUAGAAAAUCUGAUCAUCCUAGCAAACAACAGUUUGUCUUCUAAUGGGAAUGUAACAGAAUCUGGAUGCAAAGAAUGUGAGGAACUGGAGAAAAAAAAUAUUAAAGAAUUUUUGCAGAGUUUUGUACAUAUUGUCCAAAUGUUCAUCAACACUUCU

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IL-15蛋白的mRNA序列如SEQ ID No.4所示。

UAAUACGACUCACUAUAGGAUggacUggaccUggaUccUgUUccUggUggccgccgccacacgggUgcacagc

AACUGGGUGAAUGUAAUAAGUGAUUUGAAAAAAAUUGAAGAUCUUAUUCAAUCUAUGCAUAUUGAUGCUACUUUAUAUACGGAAAGUGAUGUUCACCCCAGUUGCAAAGUAACAGCAAUGAAGUGCUUUCUCUUGGAGUUACAAGUUAUUUCACUUGAGUCCGGAGAUGCAAGUAUUCAUGAUACAGUAGAAAAUCUGAUCAUCCUAGCAAACAACAGUUUGUCUUCUAAUGGGAAUGUAACAGAAUCUGGAUGCAAAGAAUGUGAGGAACUGGAGAAAAAAAAUAUUAAAGAAUUUUUGCAGAGUUUUGUACAUAUUGUCCAAAUGUUCAUCAACACUUCU

GCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCAAUUGCAAUGAAAAUAAAUGUU

IL-15蛋白的mRNA序列如SEQ ID No.5所示。

UAAUACGACUCACUAUAGG

AUgUacaggaUgcaacUccUgUcUUgcaUUgcacUaagUcUUgcacUUgUcacaaacagU

AACUGGGUGAAUGUAAUAAGUGAUUUGAAAAAAAUUGAAGAUCUUAUUCAAUCUAUGCAUAUUGAUGCUACUUUAUAUACGGAAAGUGAUGUUCACCCCAGUUGCAAAGUAACAGCAAUGAAGUGCUUUCUCUUGGAGUUACAAGUUAUUUCACUUGAGUCCGGAGAUGCAAGUAUUCAUGAUACAGUAGAAAAUCUGAUCAUCCUAGCAAACAACAGUUUGUCUUCUAAUGGGAAUGUAACAGAAUCUGGAUGCAAAGAAUGUGAGGAACUGGAGAAAAAAAAUAUUAAAGAAUUUUUGCAGAGUUUUGUACAUAUUGUCCAAAUGUUCAUCAACACUUCU

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编码IL-15蛋白的mRNA序列如SEQ ID No.6所示。

UAAUACGACUCACUAUAGG

AUgUacaggaUgcaacUccUgUcUUgcaUUgcacUaagUcUUgcacUUgUcacaaacagU

AACUGGGUGAAUGUAAUAAGUGAUUUGAAAAAAAUUGAAGAUCUUAUUCAAUCUAUGCAUAUUGAUGCUACUUUAUAUACGGAAAGUGAUGUUCACCCCAGUUGCAAAGUAACAGCAAUGAAGUGCUUUCUCUUGGAGUUACAAGUUAUUUCACUUGAGUCCGGAGAUGCAAGUAUUCAUGAUACAGUAGAAAAUCUGAUCAUCCUAGCAAACAACAGUUUGUCUUCUAAUGGGAAUGUAACAGAAUCUGGAUGCAAAGAAUGUGAGGAACUGGAGAAAAAAAAUAUUAAAGAAUUUUUGCAGAGUUUUGUACAUAUUGUCCAAAUGUUCAUCAACACUUCU

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实施例1

第一步：PCR扩增得到PCR产物

取多个PCR管，分别按下列体系加入，IL-15的基因各重复3次，上、下游引物、模板、基因名称见表1：

体系(50μL)：10μL去离子水、10μL 2mMdNTPs、25μL 2×Buffer、1.5μL 10nMR、1.5μL10 nMF、0.1μL10 ng/μL模板与1μL 1.0U/μLKOD FX Neo

表1扩增IL-15基因的名称、引物、模板

PCR扩增循环方法：95℃变性3min，98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸45s，共循环35次。最后一次循环结束后，再将反应管置68℃温育5min，以确保充分延伸。结束后，仪器温度降至12℃暂时贮存。

第二步：电泳检测PCR产物

称量2g琼脂糖溶解于200mL 1×TAE缓冲液中，加热，加入20μL荧光核算染色试剂GelRed，混匀倒胶；

待胶凝固后，将电泳梳子拔掉，把胶放入电泳槽中；

将PCR样品加入10×上样缓冲液上样，另外加入2K的Marker作为对照例，电泳条件为150V、0.45A与68W；

第三步：胶回收电泳产物

电泳完成后，切割胶，按照下列步骤进行胶回收：

将目的片段切割成1mm

将试剂盒中的柱子装回2mL管中，把完全融化的胶溶液加入到柱子中，每个柱子最多加700μL，12000rpm转速离心1min，弃废液，重复将剩余的胶溶液通过柱子；

每个柱子各加300μLXP2 Binding Buffer清洗柱子，使胶溶液挂到柱子上，12000rpm转速离心1min，弃废液；

每个柱子加700μL SPW Buffer，12000rpm转速离心1min，弃废液，重复洗两遍；

将洗完的柱子装回2mL管中，12000rpm转速空离2min，弃残液；

将柱子装回1.5mL EP管中，分别加入30μL Elution Buffer，室温静置2min，12000rpm转速离心1min，收集离心管中的DNA加入柱子中，12000rpm转速离心1min，测量得到的DNA浓度；

将测量浓度的胶板洗净擦干，第一加样孔加入2μL Elution Buffer，样品孔分别加入4个重复的2μL样品，测量双链DNA浓度，之后置于-20℃保存。

表2 IL-15PCR产物胶回收得到的浓度结果

第四步：DNA转录

按照下列体系加入转录的样品：

体系：10μL 2×ARCA/NTP、1μg模板(cop-GFP胶回收产物)、T7转录酶与去离子水，共计20μL，37℃反应16h，每管加入2μLDNase I，37℃反应15min；

将每管RNA取出1μL置PCR管中，置于-80℃保存，加入下列体系进行RNA加帽反应：

体系如下：19μLIDT、5μL10×PA Buffer、5μL Poly A酶与去离子水，计50μL，37℃反应30min。

第五步：mRNA纯化

将处理好的mRNA转移到1.5mL EP管中，每管加入50μL2×RNABinding Buffer，混匀；

加入等体积100μL无水乙醇，混匀；

将纯化柱加入到2mL管中，并将上述mRNA转移到纯化柱中，12000rpm转速离心30s，弃上清液；

加入400μL RNA Prep Buffer，12000rpm转速离心30s，弃上清液；

加入700μL RNA Wash Buffer，12000rpm转速离心30s，弃上清液；

加入400μL RNA Wash Buffer，12000rpm转速离心30s，弃上清液，然后12000rpm转速空离2min，转移到EP管中；

加入50μL Elution Buffer，12000rpm转速离心30s，收集mRNA，各取1μL置PCR管中进行电泳，剩余置-80℃保存；

将第四步与第五步得到的产品进行电泳测试，

表3 6种IL-15DNA转录得到的mRNA纯化后的浓度结果

如图1所示，名称分别为IL15-SV40、IL15-Hbb、IgG-SV40与IgG-Hbb的PCR产物的电泳结果为单一特异性扩增条带。

如图2所示，名称分别为IL2-SV40与IL2-Hbb的PCR产物的电泳结果为单一特异性扩增条带。

如图3所示，名称分别为IL15-SV40、IL15-Hbb、IgG-SV40、IgG-Hbb、IL2-SV40与IL2-Hbb的DNA转录得到的mRNA加尾前的电泳结果为单一特异性扩增条带。

如图4所示，名称分别为IL15-SV40、IL15-Hbb、IgG-SV40、IgG-Hbb、IL2-SV40与IL2-Hbb的DNA转录得到的mRNA加尾后的电泳结果为单一特异性扩增条带。

实施例2

NK细胞的培养：

采用NK细胞培养试剂盒(鼎成肽源生物技术有限公司，LY1201)，具体的操作步骤如下：

步骤一：细胞包被

取一支50mL无菌离心管，加入3mL无菌1×PBS，再加入200μLNK试剂A，轻轻吹打混匀，为配置好的包被液；

取一个无菌T25细胞培养瓶，将包被液加入T25细胞培养瓶中，充分水平轻轻晃动，使液体覆盖整个包被侧面。在4℃冰箱水平放置包被过夜。

步骤二：细胞接种

取一支50mL无菌离心管，加入10mL基础培养基，加入0.8mL血清替代物SR(血清替代物分装冻存)，加入200μLNK试剂B，轻轻吹打混匀，该培养基为接种培养基；

取一支PBMC，37℃水浴解冻后立即转移至50mL离心管中，加入10mL基础培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，取1×107cells至新的50mL离心管中，2000rpm×5min离心，吸弃上清；

用5mL接种培养基重悬细胞，计数，根据计数结果将细胞调整细胞密度为1×106cells/mL；

将包被22-24h的T25细胞培养瓶取出，平衡至室温，吸弃包被液，加入3mL PBS轻轻洗涤，吸弃洗液；重复一次；(注意用移液管加入PBS时不要吹到瓶的包被面)

将调整好细胞密度的PBMC吹打混匀，取6mL接种T25细胞培养瓶，标记D0，置37℃二氧化碳培养箱培养。

步骤三：细胞诱导培养

取一支50mL无菌离心管，加入20mL基础培养基，加入1.6mL血清替代物SR，加入200μLNK试剂C，轻轻吹打混匀，该培养基为诱导培养基；

细胞培养D3，补1mL诱导培养基；

细胞培养D5，补9mL诱导培养基。

步骤四：细胞扩增培养

取1L基础培养基，加入80mL血清替代物，然后加入400μL NK试剂D，配成细胞扩增培养基；

细胞培养D7开始每隔一天计数，并根据计数结果补扩增培养基，补液后细胞密度维持在(0.5-1.0)×106cells/mL，根据细胞培养体积转入瓶或转入细胞培养袋；

NK电转mRNA

分别取100mL，20211227H-NK-D17、20220105E-NK-D12和20220105E-NK-D15细胞(不同时间点获取的同一批次培养的NK细胞，分别记为20211227H-NK-D17、20220105E-NK-D12和20220105E-NK-D15)，细胞培养时间越长，细胞越稳定；1500rpm转速离心5min，然后分别用50mL PBS重悬，1500rpm转速离心5min，采用40mL PBS缓冲液重悬，取样计数；

采用opti-MEM培养基重悬，细胞密度为7.5×10

电转仪设置为500V/20ms，将mRNA解冻，每管细胞中分别加入2μg mRNA，吹打混匀立即加入冰浴的电转杯中进行电转，电转后的细胞加入含有2mL/1mLRPMI1640细胞培养基(含10％FBS)的12孔胶板中，对照例为空电转的NK组；

培养基中加入IL-2，使终浓度为200IU/mL，在37℃培养。

NK电转24h后分别取样计数细胞活率和密度，计数后的NK收集到1.5mL的EP管中，2000rpm转速离心5min，将上清液收集到1.5mL EP管中，检测IL-15的释放；

离心后的细胞沉淀用PBS重悬洗涤，之后弃掉上清液，置于-80℃保存。

表4 NK电转mRNA24h后上清液中IL-15的释放

图5为本发明的SNK电转mRNA后上清液中IL-15的释放结果，细胞分别为20211227H-NK-D17、20220105E-NK-D12和20220105E-NK-D15；其中，不同时间点获取的同一批次培养的NK细胞，分别记为20211227H-NK-D17、20220105E-NK-D12和20220105E-NK-D15，细胞培养时间越长，细胞越稳定。

由上可知，SNK电转不同的mRNA后收集细胞上清液，测量IL-15的释放，不同信号肽对表达量的影响分别是S-IL2>S-IgG>S-IL15，终止子3'UTR中Hbb组比SV40组高，总之，IL-15mRNA在NK细胞中表达最佳的信号肽为IL-2的信号肽序列，终止子3'UTR最佳的选择是Hbb序列。

通过mRNA电转修饰细胞优化mRNA的修饰序列，其可以提高目标因子在NK细胞中的表达，即可改善细胞的功能。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。