一种检测番茄品种纯度的KASP标记引物组及其试剂盒和应用
文献发布时间:2024-04-18 19:54:45
技术领域
本发明属于生物技术领域,尤其涉及一种检测番茄品种纯度的KASP标记引物组及其试剂盒和应用。
背景技术
番茄(Solanum lycopersicom),原产于南美洲,属于茄科草本植物。番茄果实富含多种营养元素,具有抗氧化能力,能够预防多种疾病。番茄在栽培环节,难以达到严格隔离和单品种成片种植要求,容易受到外来花粉的污染,导致种子纯度下降,种子质量难以控制,给生产带来重大损失。种子纯度定义为本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率。目前市场上广泛用的种子均为杂交种,根据国家制定的《农作物种子质量标准》(GB16715.3.2010)的规定,番茄杂交种的纯度不低于96%。所以番茄种子在上市之前进行纯度鉴定是质量控制的要求。
现在番茄品种纯度鉴定主要依赖于传统的田间小区种植鉴定方法(Grow-outTest)和SSR(Simple Sequence Repeat,简单重复序列)标记法。田间种植鉴定把品种种植于田间测试小区,通过观察植株不同生长时期(苗期、生长、花期、成熟期以及种子)的植物学形态特征(如植株的高矮及大小、分蘖、叶色、叶形、种子大小、种皮颜色等)和生物学特性(如植株的生育期、光周期、抗病性、抗旱性、种子落粒性等)的不同来鉴定该番茄品种的纯度。此方法取决于对植物在田间的形态特征和生物学特性的视觉识别,判断标准往往很难精确量化,主观性强,检测灵敏度和分辨力低;易受环境和栽培条件影响,准确性和稳定性差;耗时长、时效性差;需投入大量人力、物力,成本高。
DNA分子标记是直接反应DNA差异(多态性)的一种遗传标记,主要包括SSR(SimpleSequence Repeat,简单重复序列)和SNP(Single Nucleotide Polymorphism,单核苷酸多态性)等。SSR目前已经成为纯度和品种真实性检测的主要方法之一,在多种作物如水稻,番茄、大豆等都有SSR的国标,目前SSR大面积使用有它的优势,包括具有实验室操作简单,成本低,重复性较好,结果真实可靠等。比较起SSR标记法,SNP标记法技术更简单,易于自动化,检测通量高,速度快;单位数据点检测成本低;不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证,数据具有普适的可比性;是快速、简便、灵敏、准确、稳定、低成本鉴定品种纯度的最常用方法。但是目前基于SNP标记的番茄纯度检测方法鲜见报道。现在用于番茄纯度检测的SSR标记法所用的SSR标记数目很少,而且用于筛选这些SSR标记的番茄材料少,遗传多样性窄,这些筛选的SSR标记只在特定材料中具有高多态性,只能用于特定品种的纯度检测,不能用于不同遗传来源的番茄品种(系)纯度的普适性精准检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,克服以上背景技术中提到的不足和缺陷,提供一种快速、高效、低成本、精准度高、普适性高的检测番茄品种纯度的KASP标记引物组及其应用,并提供检测番茄品种纯度的方法、筛选检测番茄品种纯度的SNP标记的方法以及检测番茄品种纯度的试剂盒。本发明是基于Douglas Array Tape平台的KASP(KompetitiveAllele Specific PCR,竞争性等位基因特异性PCR)检测技术,检测方法简单、自动化程度高、通量高、速度快,试剂用量少,检测成本低。
为解决上述技术问题,本发明提出的技术方案如下:
第一方面,本发明提供一种检测番茄品种纯度的KASP标记引物组,所述KASP标记引物组用于分别扩增如下的SNP位点组:
SNP位点LY001:位于番茄参考基因组第1染色体第534265581位核苷酸,该位点的核苷酸碱基为G或A;
SNP位点LY002:位于番茄参考基因组第2染色体第643102010位核苷酸,该位点的核苷酸碱基为A或C;
SNP位点LY003:位于番茄参考基因组第3染色体第3958512位核苷酸,该位点的核苷酸碱基为G或A;
SNP位点LY004:位于番茄参考基因组第4染色体第16865489位核苷酸,该位点的核苷酸碱基为C或T;
SNP位点LY005:位于番茄参考基因组第5染色体第12076633位核苷酸,该位点的核苷酸碱基为T或G;
SNP位点LY006:位于番茄参考基因组第6染色体第69251621位核苷酸,该位点的核苷酸碱基为A或G;
SNP位点LY007:位于番茄参考基因组第7染色体第61219689位核苷酸,该位点的核苷酸碱基为A或C;
SNP位点LY008:位于番茄参考基因组第8染色体第749024987位核苷酸,该位点的核苷酸碱基为G或A;
SNP位点LY009:位于番茄参考基因组第9染色体第578414376位核苷酸,该位点的核苷酸碱基为T或C;
SNP位点LY010:位于番茄参考基因组第10染色体第715512695位核苷酸,该位点的核苷酸碱基为T或C;
SNP位点LY011:位于番茄参考基因组第11染色体第159349087位核苷酸,该位点的核苷酸碱基为G或A;
SNP位点LY012:位于番茄参考基因组第12染色体第456087457位核苷酸,该位点的核苷酸碱基为C或T;
其中,所述番茄参考基因组为番茄S_lycopersicum genome参考基因组;每个SNP位点的扩增引物包括等位基因特异性引物X、Y以及通用引物C,每个特异性引物X、Y均连接有荧光基团,且X连接的荧光基团与Y连接的荧光基团不同。
上述的KASP标记引物组,优选的,所述KASP标记引物组的核苷酸序列如下:
(1)SNP位点LY001的扩增引物(如SEQ ID NO:1~3所示):
LY001-X:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAATTGGTGTTTTTCTGCAT CTCC;
LY001-Y:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGAATTGGTGTTTTTCTG CATCTCT;
LY001-C:AGAACTTTGAAGTGGTGAATCATGC;
(2)SNP位点LY002的扩增引物(如SEQ ID NO:4~6所示):
LY002-X:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGAGTTTGCTCAGTTATTCA GGACTC;
LY002-Y:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGAGTTTGCTCAGTTATTC AGGACTT;
LY002-C:AAGCTCGTGCAGGTCAATGTG;
(3)SNP位点LY003的扩增引物(如SEQ ID NO:7~9所示):
LY003-X:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAACCCCACCAATAGTCATTC CAG;
LY003-Y:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAACCCCACCAATAGTCATT CCAC;
LY003-C:CCAAATCCACAGCTTTTTAGCTTCT;
(4)SNP位点LY004的扩增引物(如SEQ ID NO:10~12所示):
LY004-X:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTGCCAGATTTACGGTTCT ATA;
LY004-Y:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTGCCAGATTTACGGTTC TATG;
LY004-C:CCCTCACTAAAATCCTTCACCATGT;
(5)SNP位点LY005的扩增引物(如SEQ ID NO:13~14所示):
LY005-X:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGAGCAATCACTGCAACC ACTAATA;
LY005-Y:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGAGCAATCACTGCAACCA CTAATC;
LY005-C:TGATTCTTGATCTGGCATAACACTG;
(6)SNP位点LY006的扩增引物(如SEQ ID NO:15~18所示):
LY006-X:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGAAGAGGAAGGAAGAGA TACAACAGAA;
LY006-Y:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGAAGAGGAAGGAAGA GATACAACAGAG;
LY006-C:GCTATCATACGATCAGAGCATCAGAC;
(7)SNP位点LY007的扩增引物(如SEQ ID NO:19~21所示):
LY007-X:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATTTGCTCGACAATGGC A;
LY007-Y:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATTTGCTCGACAATGGC G;
LY007-C:AGATCTTGGCTTGTTGGATCAGA;
(8)SNP位点LY008的扩增引物(如SEQ ID NO:22~24所示):
LY008-X:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGCTTCACCAGAAAGGCAT GT;
LY008-Y:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGCTTCACCAGAAAGGCAT GC;
LY008-C:ATGTAATCACCAACTTCCAAGGTCA;
(9)SNP位点LY009的扩增引物(如SEQ ID NO:25~27所示):
LY009-X:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTTTCCCTAATTTCTGCTA TGCCT;
LY009-Y:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTTTCCCTAATTTCTGCTAT GCCC;
LY009-C:CCTTCTCAAGCTCTGCAAGTGTAAA;
(10)SNP位点LY010的扩增引物(如SEQ ID NO:28~30所示):
LY010-X:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGATTTAAAAGGCGAAAACG ACG;
LY010-Y:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGATTTAAAAGGCGAAAAC GACA;
LY010-C:TCTCCAGAACAAAACCAACAACTTC;
(11)SNP位点LY011的扩增引物(如SEQ ID NO:31~33所示):
LY011-X:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTCAAGAAGTGAGCTTAA ACGATAAC;
LY011-Y:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCAAGAAGTGAGCTT AAACGATAAT;
LY011-C:GATCAATTTTGCCCTTCACTTCTTC;
(12)SNP位点LY012的扩增引物(如SEQ ID NO:34~36所示):
LY012-X:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCAGGCAAACCAGAGAGA GGG;
LY012-Y:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTCAGGCAAACCAGAGAG AGGA;
LY012-C:CTAAATCATCCTTCACATCCTGCAA。
更优选的,每个特异性引物X均连接有FAM荧光基团,每个特异性引物Y均连接有HEX或VIC荧光基团。
第二方面,本发明提供一种检测番茄品种纯度的试剂盒,包含所述的KAS P标记引物组。
上述的试剂盒,优选的,每个引物组的特异性引物X、特异性引物Y、通用引物C在PCR反应体系中浓度之比为2:2:5,具体用量及浓度可参考实施例1表3的PCR扩增体系。
优选的,所述试剂盒中还包含2×KASP Master Mix和超纯水。
第三方面,本发明提供一种所述的KASP标记引物组或所述试剂盒在检测番茄品种纯度中的应用,也是提供一种检测番茄品种纯度的方法,包括以下步骤:
(1)提取番茄待测样品的总DNA;
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板,利用所述的KASP标记引物组进行PCR扩增,然后进行荧光信号扫描、基因型分型;如果样品中只检测到特异性引物X的荧光,则该样品的基因型为纯合等位基因X;如果只检测到特异性引物Y的荧光,则该样品的基因型为纯合等位基因Y;如果同时检测到特异性引物X和Y荧光,则该样品的基因型为杂合;
(3)根据基因型分型结果进行数据分析,得出番茄待测样品的品种纯度。
上述的方法,优选的,所述方法采用Douglas Scientific的Array Tape系统进行;Array Tape基因型分型平台包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增的SOELLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS。
优选的,PCR扩增体系包括:100μM Primer_C、100μM Primer_X、100μM Primer_Y、2×KASP Master Mix、番茄待测样品的DNA、超纯水;用SOELLEX进行PCR扩增,扩增条件如下:94℃15分钟;94℃20秒,65℃-57℃60秒,10个循环;94℃20秒,57℃60秒,33个循环。
第四方面,本发明提供一种筛选检测番茄品种纯度的SNP标记的方法,包括以下步骤:
步骤S1、收集番茄特异性SNP位点;
步骤S2、对收集到的SNP位点,在已有的番茄参考基因组S_lycopersicum genome上进行位点核对、截取设计序列区间并进行引物设计,对设计的引物进行特异性核查,选出若干SNP位点及设计的引物;
步骤S3、对选出的SNP位点进行合成,并采用现有的番茄材料进行基因分型验证,得到番茄的功能标记连锁标记及资源原始数据;
步骤4、分析所述的功能标记连锁标记及资源原始数据,选出一套标记最少、均匀分布于12条染色体、并能够区分所有番茄材料的标记组合。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明筛选出一套(1SNP/染色体)共12个SNP标记及针对其设计的KASP标记引物组,用于番茄品种纯度的精准鉴定,这12个标记分型质量高、单拷贝、高多态性(在144份现有番茄品种中的PIC值平均高于>=0.33)、样本数据检出率>98%,可用于来源不同的番茄品种(系)纯度的精准检测,具有广泛的应用普适性。
(2)本发明提供了一种筛选SNP标记的方法,筛选出的SNP标记及其KASP标记引物组可用于来源不同的番茄品种(系)纯度的精准检测,具有广泛的应用普适性。
(3)本发明提供了一种基于Douglas Array Tape平台的KASP(KompetitiveAllele Specific PCR,竞争性等位基因特异性PCR)标记检测方法,用于番茄的纯度检测;该检测方法自动化程度高,可达90%,极大减少了实验室的人力及人为错误;检测通量高、速度快,8小时可获得122,880个数据点,是传统的96孔板SNP基因分型方法的10倍;检测反试剂用量少(仅0.8μL/反应),检测成本低,与传统的96孔板SNP基因分型方法相比,试剂耗材成本降低70%-90%。且检测方法简单、快捷,适用于不同的检测仪器设备。
(4)本发明提供的番茄纯度检测方法基于SNP标记法,具有SNP标记法的所有固有优点;标记为共显性标记,特异性、灵敏度和分辨力高;标记不受环境条件影响,能够使用种子或任何类型的植物组织,检测结果准确、重复性和稳定性好;不同检测实验室和不同的数据结果可以相互比较验证,数据具有普适的可比性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的研发技术流程;
图2是KASP标记番茄多样性材料中的基因型分型示意图(图中的红色簇表示样品在这个KASP标记位点含有纯合X等位基因,蓝色簇表示样品在这个KASP标记位点含有纯合Y等位基因型,紫色簇表示样品在这个KASP标记位点含有X和Y杂合等位基因型)。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述,但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义,下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的,并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明,本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1:
本实施例基于SNP(Single Nucleotide Polymorphism,单核苷酸多态性)标记法,提供了一种筛选高质量、高多态性以及普适性SNP标记的方法,并用此方法筛选出一套SNP标记和用于番茄品种纯度检测的KASP标记引物组。研发技术流程如图1所示,具体如下:
1、番茄特异性SNP位点的搜集
利用illumina份番茄7.7K芯片以及现有番茄研发成果,查看主要的有关番茄的基因所在区域所涉及的SNP位点进行筛选,最后得到超过8000个SNP位点。
2、番茄SNP位点的设计,筛选及核查
对收集到的8000个SNP的位点,在已有的番茄参考基因组(S_lycopersicumgenome)上进行位点核对截取设计序列区间并进行引物设计,同时对设计的引物进行特异性核查,最后精选出323个SNP位点设计的引物。
3、323个标记的合成及验证
将得到的323个特异性最好的标记位点进行合成,并且选取192份番茄各类资源进行基因分型验证,得到一套番茄的功能标记连锁标记及资源原始数据。
4、12个标记的样品检测、验证及生产应用
通过323个SNP标记构建的核心资源数据库,利用自主构建的生物数据分析软件进行分析,目标为选出一套标记最少,均匀分布于12条染色体,并能够区分所有材料的标记组合,最终挑选出12个用于番茄品种纯度检测的SNP标记:(1个SNP标记/染色体)高质量、单拷贝、高多态性(192份番茄材料中的PIC值都高于>=0.33)、数据检出率>98%的SNP标记,用于各种不同遗传来源的番茄品种(系)纯度的精准检测。该12个用于番茄品种纯度检测的SNP标记见表1。
表1.12个用于番茄品种纯度检测的SNP位点的信息表
5、12个用于番茄品种纯度检测的KASP标记的序列信息
每个KASP标记由三条引物组成,包括两条等位基因特异性引物X(Allele-Specific Primer X;Primer_X)和Y(Allele-Specific Primer Y;Primer_Y)以及一条通用引物C(Common Primer;Primer_C)。两条等位基因特异性引物分别连接FAM和HEX(或VIC)荧光基团。如果样品中只检测到FAM荧光,则该样品的基因型为纯合等位基因X(Allele_X);如果只检测到HEX荧光,则该样品的基因型为纯合等位基因Y(Allele_Y);如果同时检测到FAM和HEX荧光,则该样品的基因型为杂合(同时带有等位基因X和Y)。12个用于番茄品种纯度检测的KASP标记的等位基因型和引物序列见表2,各引物序列依次如SEQ ID NO:1~36所示。
表2.12个用于番茄品种纯度检测的KASP标记的等位基因型(Allele_X、Allele_Y)和引物序列
实施例2:
实施例1的KASP标记引物组在检测番茄品种纯度中的应用(即检测番茄品种纯度的方法),具体操作如下:
1、提取番茄待测样品的总DNA。
1)将番茄种子样品单粒加入1.3ml的96孔板中,加入2粒4mm钢珠盖上密封的硅胶盖;
2)在组织研磨仪器上1400转/分进行高速研磨;
3)去掉硅胶盖,在1.3ml的96孔板中加入500μL DNA提取裂解液,并热封膜密封;
4)在水浴锅温浴1小时,拿出3600转/分离心10min;
5)采用半自动移液器转移上清400μL放入新的2ml96孔板;
6)加入等体积磁珠提取液进行磁珠吸附;
7)用磁力棒进行磁珠吸附,并转移到新的装有洗液的96孔板清洗(重复一次);
8)用洗脱液在65度预热情况下溶解磁珠上DNA5分钟;
9)用磁力棒吸取溶解完的磁珠,完成DNA提取;
10)对样品进行OD值质控,合格后备用。
2、用Douglas Scientific的Array Tape系统进行KASP标记的验证和检测;ArrayTape基因型分型平台包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增的SOELLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS;
1)将提取合格的DNA样品用移液站从96孔板转移至384的工作板上;
2)用NEXAR1进行DNA模板分板,每个膜加入0.8μL DNA,并进行烘干处理;
3)用NEXAR2进行体系构建,将12个引物反应体系(含引物和master mix以及水)配置在专用的96孔板中,用高精度钢珠吸取后喷在对应膜孔位置,每个孔位喷0.8μL,并进行压力封膜;
4)用SOELLEX进行水浴PCR;
5)完成PCR后,用ARAYA进行膜的扫描;
6)扫描完成,电脑登录INTELLICS网页进行数据的质控和导出分析。
PCR扩增体系:用NEXAR进行PCR扩增体系的自动组装,PCR扩增体系如下表3所示;
表3.KASP标记基因型分型的PCR扩增体系
PCR扩增:PCR用SOELLEX进行PCR扩增,扩增条件如下:94℃15分钟;94℃20秒,65℃-57℃(每个循环退火温度降低0.8℃)60秒,10个循环;94℃20秒,57℃60秒,33个循环。
3、信号扫描和基因型分型:PCR反应完成后用ARAYA进行反应体系荧光信号扫描;然后用INTELLICS进行基因型分型和数据分析。在KASP标记基因型分型检测中,样品的基因型分成3簇,分别为X簇、Y簇以及杂合基因型簇(见图2)。其中X簇表示样品在这个KASP标记位点含有纯合X等位基因(分型图中标为红色,位于图形左上角),Y簇表示样品在这个KASP标记位点含有纯合Y等位基因型(分型图中标为蓝色,位于图形右下角),杂合基因型簇表示样品在这个KASP标记位点含有X和Y杂合等位基因型(分型图中标为紫色)。典型的KASP标记基因型分型图见图2。
12个用于番茄品种纯度检测的KASP标记的基因型分型质量验证:用21个市场上的番茄品种用12个KASP标记进行验证。经验证,每个KASP标记的二个纯合和杂合簇分型好、紧凑,位点为单拷贝且检出率都高于98%,12个KASP标记的基因型分型质量完全能满足番茄品种纯度的精准检测。典型的KASP标记基因型分型图见图2。
基于Douglas Array Tape平台的KASP标记检测优点:基于Douglas Array Tape平台的KASP标记自动化程度达90%,极大减少了实验室的人力及人为错误。检测通量高,8小时可获得122,880个数据点,是传统的96孔板SNP基因分型方法的10倍。检测反应体积低少(仅0.8μL/反应),与传统的96孔板SNP基因分型方法相比,试剂耗材成本降低70%-90%。
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