一株高产奥利万星直接前体的工程菌及其应用

技术领域

本发明属于药物生物技术领域，涉及一株高产奥利万星直接前体的工程菌及其应用。

背景技术

2014年，美国FDA批准Medicines公司开发的奥利万星(Oritavancin)上市，商品名为Orbactiv，它是万古霉素后的新一代糖肽类抗生素。

奥利万星用于治疗急性细菌性皮肤和皮肤结构感染(ABSSSIs)，是首个和唯一的单剂量治疗方案的抗生素。它通过阻断肽聚糖生物合成的转糖基化发挥杀菌作用，从而抑制细菌细胞壁的形成，导致细菌细胞死亡。此外，奥利万星对万古霉素不敏感的葡萄球菌和肠球菌均具有较强的抗菌活性，因此其应用可以有效地减少耐药性的发展。

东方拟无枝酸菌是奥利万星直接前体Chloroeremomycin(又名A82846B)的生产菌，目前发酵单位较低。因此利用合成生物技术理性重构其合成途径以提高Chloroeremomycin的发酵水平，对奥利万星产业化具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的提供一株高产奥利万星直接前体的工程菌，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为：东方拟无枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)AO-B，保藏号：CGMCC NO.29179，保藏日：2023.11.30。

本发明的工程菌通过以下方法构建：

步骤(1)：购置特异性引物以东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)，保藏编号为CGMCC NO.21140，分类命名:东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)，基因组为模板扩增Chloroeremomycin合成代谢潜在竞争途径基因簇4的核心基因orf5(SEQ IDNO.13)的上下游同源臂SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，并回收：

SEQ ID NO.1上游引物SEQ ID NO.3ctagagtcgacctgcagccccgtgagctggccgaaaccga

SEQ ID NO.1下游引物SEQ ID NO.4cgatggcgaccgtggccgcaggacgaagtcgccgagcg

SEQ ID NO.2上游引物SEQ ID NO.5gcggccacggtcgccatcggggt

SEQ ID NO.2下游引物SEQ ID NO.6ctcttccacctgctgaaagcttcggcgtctccgccttcttcgt

步骤(2)：步骤(1)中回收的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2片段用无缝克隆的手段插入pSET153-aadA-neo(SEQ ID NO.7)HindIII酶切位点得到质粒pSET153-aadA-neo-ECO0501，并验证；

步骤(3)：步骤(2)中获得的质粒通过化转导入大肠杆菌E.coil ET12567/pUZ8002中；

步骤(4)：通过接合转移将步骤(2)中的质粒转入Amycolatopsis orientalisCGMCC21140中，筛选单间交换和双交换菌株，同源交换敲除orf5基因，得到Amycolatopsisorientalis AO-A；

步骤(5)：以Amycolatopsis orientalis CGMCC21140基因组为模板扩增Chloroeremomycin糖基转移酶基因evaE片段(SEQ ID NO.8)，并回收：

SEQ ID NO.8上游引物SEQ ID NO.9gggatacgcggtaccatgaagctgatcaccgtgctc

SEQ ID NO.8下游引物SEQ ID NO.10catcttgttcaatcatcatatgtcatgcgcgagcctttcc

步骤(6)：步骤(5)中回收片段和启动子一起插入表达载体pIJ8660-aadA-neo(SEQID NO.11)上得到质粒pIJ8660-aadA-neo-evaE，启动子系合成片段，为来自Eggrethellalenta DSM2243的高效启动子P

步骤(7)：步骤(6)中获得的质粒通过化转导入大肠杆菌E.coil ET12567/pUZ8002中，获得大肠杆菌E.coil ET12567/pUZ8002/pIJ8660-aadA-neo-evaE；

步骤(8)：通过大肠杆菌E.coil ET12567/pUZ8002/pIJ8660-aadA-neo-evaE进行接合转移将步骤(6)中的质粒转入Amycolatopsis orientalis AO-A中，得到Amycolatopsis orientalis AO-B；

步骤(9)：通过发酵并高效液相色谱检测，Amycolatopsis orientalis AO-B菌株Chloroeremomycin发酵产量是CGMCC NO.21140的2.3倍，达322mg/L。

步骤(10)：培养基成分优化(采用Plackett-Burman设计筛选葡萄糖、蛋白胨、麦芽糖糊精、NaCl、KCl、MgSO

本发明的另一个目的是提供所述工程菌在发酵制备奥利万星直接前体(Chloroeremomycin)中的应用。本发明所述工程菌为东方拟无枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)，保藏号为CGMCC NO.21140，将潜在的竞争途径即ECO0501的核心基因4-胍丁基合成酶基因orf5删除，并将奥利万星直接前体Chloroeremomycin糖基转移酶evaE高表达，发酵优化后获得Chloroeremomycin高产菌东方拟无枝酸菌Amycolatopsis orientalisAO-B(保藏号：CGMCC NO.29179，保藏日：2023.11.30)。这株菌在种子培养基中30℃培养72h，再接到GPM培养基中，30℃培养168h取样，发酵液中Chloroeremomycin可达到出发菌株的3.1倍，达428mg/L。

本发明的优点是：(1)本发明基于代谢工程手段通过潜在竞争途径解除(敲除orf5)限速合成酶基因高表达(evaE)和发酵工艺优化(采用Plackett-Burman设计筛选葡萄糖、蛋白胨、麦芽糖糊精、NaCl、KCl、MgSO

(2)本发明所构建的高产奥利万星直接前体Chloroeremomycin基因工程菌在本发明所述发酵条件下产量是出发菌株的3.1倍，达428mg/L，大大降低了奥利万星直接前体Chloroeremomycin的生产成本，在奥利万星直接前体Chloroeremomycin工业化生产中有重要的应用价值。

附图说明

图1是敲除质粒pSET153-aadA-neo-ECO0501图谱。

图2是表达质粒pIJ8660-aadA-neo-evaE图谱。

图3本发明最终工程菌东方拟无枝酸菌Amycolatopsis orientalis AO-B发酵工艺优化前后与出发菌株Amycolatopsis orientalis(保藏号：CGMCC NO.21140)Chloroeremomycin发酵产量柱状图。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例中所使用的培养基：

YMG固体培养基：酵母提取物4.0g、麦芽提取物10.0g、葡萄糖4.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000mL，pH 7.3。

LB液体培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10g,琼脂20.0g、蒸馏水1000mL，pH 7.3。

2×YT液体培养基：蛋白胨16.0g，酵母提取物10.0g，NaCl 5g,琼脂20.0g、蒸馏水1000mL，pH 7.3。

MS固体培养基：甘露醇20g，黄豆粉20g，琼脂糖20g，蒸馏水1000mL pH7.3。

种子培养基：蛋白胨20g,NaCl 5g,葡萄糖2.5g,K

发酵培养基：蛋白胨5g，葡萄糖20g，NaCl 1g，KCl 0.5g,MgSO

GPM培养基(葡萄糖-蛋白胨-麦芽糊精培养基)；葡萄糖22g，蛋白胨6g，麦芽糊精12g，NaCl 1g,KCl 0.5g,MgSO

实施例1：Chloroeremomycin高产菌的构建方法

步骤(1)，敲除载体pSET153-aadA-neo-ECO0501的构建

本实施例构建的潜在竞争途径基因簇核心基因orf5敲除载体名称为pSET153-aadA-neo-ECO0501，该载体含有ECO0501基因簇核心基因orf5上下游同源臂，如图1所示，如序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.7所示。

pSET153-aadA-neo-ECO0501的构建方法如下：

设计特异性引物以Amycolatopsi sorientalis CGMCC21140基因组为模板扩增SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，序列并回收：

SEQ ID NO.1上游引物SEQ ID NO.3ctagagtcgacctgcagccccgtgagctggccgaaaccga

SEQ ID NO.1下游引物SEQ ID NO.4cgatggcgaccgtggccgcaggacgaagtcgccgagcg

SEQ ID NO.2上游引物SEQ ID NO.5gcggccacggtcgccatcggggt

SEQ ID NO.2下游引物SEQ ID NO.6ctcttccacctgctgaaagcttcggcgtctccgccttcttcgt

将步骤(1)中回收的的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2片段与经过HindIII酶切的穿梭质粒载体pSET153-aadA-neo连接，得到重组表达载体pSET153-aadA-neo-ECO0501，质粒图谱为图1。

步骤(2)，将pSET153-aadA-neo-ECO0501表达载体导入出发菌Amycolatopsisorientalis CGMCC21140得到基因工程菌Amycolatopsi sorientalis AO-A，具体方法如下。

通过42℃热激90s将pSET153-aadA-neo-ECO0501载体转化进入去甲基化大肠杆菌E.coil ET1256/pUZ8002。

将目的质粒pSET153-aadA-neo-ECO0501转化入E.coli ET12567/pUZ8002涂布含有相应抗生素(壮观霉素，卡那霉素，氯霉素)的LB平板上，挑取单克隆到5mL LB中，37℃，220rpm培养过夜。然后以2％的比例转接到含有相应抗生素的15mL LB中(扩大培养)，培养至OD

实施例2：Amycolatopsi sorientalis AO-B的构建方法

步骤(1)，表达载体pIJ8660-aadA-neo-evaE的构建

本实施例构建的Chloroeremomycin生物合成限速酶糖基转移酶的表达载体名称为pIJ8660-aadA-neo-evaE，该载体含有Chloroeremomycin生物合成糖基转移酶基因evaE，序列如SEQ ID NO.8所示。

pIJ8660-aadA-neo-evaE的构建方法如下：

设计特异性引物以Amycolatopsi sorientalis CGMCC21140基因组为模板扩增SEQ ID NO.8序列并回收：

SEQ ID NO.8上游引物SEQ ID NO.9gggatacgcggtaccatgaagctgatcaccgtgctc

SEQ ID NO.8下游引物SEQ ID NO.10catcttgttcaatcatcatatgtcatgcgcgagcctttcc

将步骤(2)中回收的的SEQ ID NO.8片段和人工合成的来自Eggrethella lentaDSM2243的高效启动子P

步骤(3)将pIJ8660-aadA-neo-evaE表达载体导入Amycolatopsi sorientalisAO-A得到Amycolatopsi sorientalis AO-B基因工程菌具体方法如下。

通过42℃热激90s将pIJ8660-aadA-neo-evaE载体转化进入去甲基化大肠杆菌E.coil ET1256/pUZ8002。

将目的质粒pIJ8660-aadA-neo-evaE转化入E.coliET12567/pUZ8002涂布含有相应抗生素(壮观霉素，卡那霉素，氯霉素)的LB平板上，挑取单克隆到5mL LB中，37℃，220rpm培养过夜。然后以2％的比例转接到含有相应抗生素的15mL LB中(扩大培养)，培养至OD

实施例3：出发菌Amycolatopsi sorientalis CGMCC21140和基因工程菌Amycolatopsi sorientalis AO-B Chloroeremomycin发酵验证

将产Chloroeremomycin出发菌和基因工程菌在YMG固体培养基上培养5d。刮取1cm×1cm左右的菌块，接种到种子培养基中，30℃培养48h，转速220rpm；将种子培养基中的菌丝体接种至发酵培养基中接种量8％，30℃培养168h，在培养24、48、72、96、120、144、168h分别取样测定Chloroeremomycin产量。

实施例4：基因工程菌Amycolatopsi sorientalis AO-B发酵工艺优化

采用Plackett-Burman设计筛选葡萄糖、蛋白胨、麦芽糖糊精、NaCl、KCl、MgSO

实施例5：出发菌株Amycolatopsi sorientalis(保藏号：CGMCC NO.21140)用未优化发酵条件和培养基，同时最终东方拟无枝酸菌Amycolatopsis orientalis AO-B(保藏号：CGMCC NO.29179，保藏日：2023.11.30)用优化后发酵条件和培养基条件进行发酵实验，发酵液Chloroeremomycin产量对比。

将产Chloroeremomycin出发菌和基因工程菌在YMG固体培养基上培养5d。刮取1cm×1cm左右的菌块，接种到种子培养基中，将出发菌株和最终工程菌30℃分别培养48h和72h，转速220rpm；将出发菌株和最终工程菌种子培养基中的菌丝体分别接种至发酵培养基和GPM中，30℃培养168h，在培养24、48、72、96、120、144、168h分别取样测定Chloroeremomycin产量。

实施例6：Chloroeremomycin产量检测：

步骤(1)，HPLC条件：色谱柱：C18柱子(Aglient，Eclipse Plus XDB，5μm，4.6mm*250mm)；检测波长：280nm；流速：1.00mL/min；进样量：20μL；实验流动相：流动相A相为水含0.1％甲酸，流动相B相为100％乙腈；HPLC程序：0-15min，B相5％-15％；15-20min，B相15％-100％；20-23min，B相100％；23-30min，B相5％。

步骤(2)，Chloroeremomycin产量分析：将通过发酵获得的1ml发酵液加入1mL甲醇，充分振荡后，12000rpm/min离心10min沉降菌丝体及固形物，上清液用0.45μm的无菌微孔滤膜过滤，收集滤液，所得的样品用于HPLC检测。图3为产Chloroeremomycin出发菌和高产Chloroeremomycin生产菌工程菌Amycolatopsi sorientalis AO-B(保藏号：CGMCCNO.29179，保藏日：2023.11.30)合成Chloroeremomycin产量变化曲线。

步骤(3)，基因工程菌东方拟无枝酸菌Amycolatopsi sorientalis AO-B(保藏号：CGMCC NO.29179，保藏日：2023.11.30)高产Chloroeremomycin，产量是出发菌株的3.1倍，高达428mg/L，而奥利万星能够很好治疗由革兰氏阳性细菌引起的皮肤感染，因此本发明所述的构建高产Chloroeremomycin菌方法具有重要应用价值。