寡核苷酸包装到病毒样颗粒中

本发明涉及用于生产包含以下的组合物的方法：(i)RNA噬菌体的病毒样颗粒，和(ii)聚集寡核苷酸，其中所述聚集的寡核苷酸包装到病毒样颗粒中。本发明另外提供用于生产包含适合用于之前的前述方法中的聚集的寡核苷酸的核苷酸组合物的方法。此外，本发明另外提供包含聚集的寡核苷酸的核苷酸组合物。此外，本发明另外提供包含以下的组合物：(i)RNA噬菌体的病毒样颗粒，和(ii)聚集的寡核苷酸，其中所述聚集的寡核苷酸包装到所述病毒样颗粒中。

背景技术

建议用寡核苷酸，特别是富含鸟嘌呤(G)的寡核苷酸包装的RNA噬菌体的病毒样颗粒作为免疫系统的有效刺激剂。这类病毒样颗粒和其中包装的寡核苷酸及其生产方法已描述于例如WO2003/024481、WO2004/000351、WO2004/084940、WO2004/007538、WO2007/068747和WO2007/144150中，其全部公开内容以引用的方式并入本文中。通常，方法基于RNA噬菌体的重组病毒样颗粒的拆卸，所述病毒样颗粒的外壳蛋白的纯化，以及在存在导致用寡核苷酸包装的病毒样颗粒的寡核苷酸的情况下所述外壳蛋白重组。用于生产RNA噬菌体的重组病毒样颗粒的高效并且可扩展方法另外公开于例如WO2005/117963、WO2006/125821和WO2007/039552中，所述专利以全文引用的方式并入本文中。

寡核苷酸合成的方法已经有三十多年的进行史了，其最常用的方法是通过亚磷酰胺化学合成(Beaucage等人,《核酸化学的现行协议(Curr Protoc Nucleic Acid Chem)》3.3.1-3.3.20(2000)，所述专利的全部公开内容以引用的方式并入本文中)。亚磷酰胺合成已有许多重大改进，以减少合成时间并产生更高的产物收率。富含鸟嘌呤(G)的寡核苷酸的合成，特别是具有连续鸟嘌呤残基的寡核苷酸的合成，要实现大制造规模(特别是在高纯度和高产率下)始终更具挑战性，这可能是由于在偶联步骤中通过活化的亚磷酰胺的5'-羟基的差的可及性。特别地，与载体结合的受保护的富含G的低聚物可形成二级结构，并在一定长度后具有溶解性问题，导致杂质和合成失败，最主要地导致导致寡核苷酸序列具有所需的更少数量的G残基或甚至更高数量的G残基。因此，可商购的富含鸟嘌呤(G)的寡核苷酸的纯度已从对亚磷酰胺合成进行的所述改进中显著受益。因此，尽管在10-20年前有时接受所述富含鸟嘌呤(G)的寡核苷酸的60％-80％的纯度，但是如今，在与非富含鸟嘌呤(G)的寡核苷酸类似的方法中，其纯度高达93％、95％或甚至高达97％或99％是大体上可行的。此外，如果所述富含(G)的寡核苷酸为制药药物的一部分，那么需要并要求这类更高纯度的富含(G)的寡核苷酸用于监管批准。

富含G的寡核苷酸，特别是在5'和3'端具有poly(G)并且另外包含未甲基化的CG二核苷酸基序和中央回文的寡核苷酸，倾向于经由其聚(G)基序的G-四分体形成自组装成更高阶的二级和三级结构(Kerkmann,M.等人《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,(2005)280(9),8086-93，Bochman,ML等人《自然综述遗传学(Nat Rev Genet.)》,(2012)13(11):770-780；其全部公开内容以引用的方式并入本文中)。这些G-四链体可经由分子间或分子内途径形成并且为非常稳定的二级结构。结果，这些四链体的大小、形状和构象可根据反应途径而变化很大。

WO2007/144150描述用于生产组合物的方法，所述组合物包含包装到RNA噬菌体的病毒样颗粒中的富含鸟嘌呤(G)的寡核苷酸，其中RNA噬菌体的外壳蛋白的自组装在存在寡核苷酸聚集体的情况下执行，所述寡核苷酸聚集体已通过解聚集/聚集过程获得。寡核苷酸的聚集状态的特征在于在尺寸排阻HPLC中使用所述RNA噬菌体的衣壳作为标准品的相对峰开始时间(PST)，并且已发现PST为50％到110％，优选地80％到95％为最佳。已经表明，这类PST对应于表观分子量在所述RNA噬菌体的衣壳的表观分子量范围内或稍低于其的寡核苷酸聚集体。尽管相对于用于生产包含包装到RNA噬菌体的病毒样颗粒中的富含鸟嘌呤(G)的寡核苷酸的组合物的已知方法有所改进，但是本发明人已识别WO2007/144150的此现有技术方法的主要缺点。

发明内容

特别地，本发明人已经发现，根据WO2007/144150的现有技术方法制备的并且符合如WO2007/144150中定义的大小分布的聚集的寡核苷酸相对于形成的聚集寡核苷酸的具体大小和构象(如通过动态光散射(DLS)确定)示出明显的不一致和较大的变化。此外，相对于形成的聚集的寡核苷酸的具体大小和构象的所述不一致另外导致用所述聚集的寡核苷酸包装的病毒样颗粒中的显著不一致，不仅导致形成期望球形包装的VLP，而且导致形成畸形的棒状聚集体或更高阶的聚集体。此外，用所述高度多分散的聚集的寡核苷酸包装的所述所得VLP不仅显示出较低的纯度，而且还显示出增加的不稳定性。

重要的是，另外发现WO2007/144150的现有技术的解聚集/聚集方法高度依赖于用于所述解聚集/聚集步骤的寡核苷酸的初始纯度。特别地，已发现，在WO2007/144150的解聚集/聚集方法中使用的寡核苷酸的初始纯度对寡核苷酸的聚集，即，聚集速率，和因此G-四链体形成具有影响，以形成聚集的寡核苷酸的定义的期望大小和构象。通常，在WO2007/144150的解聚集/聚集方法中使用的寡核苷酸的纯度越高，发生的聚集越快并且越不受控制和混乱，导致期望大小窗口外的通常非常大的聚集寡核苷酸的量增加。因此，并且由于不能适当地包装所得聚集的寡核苷酸，所以最终的寡核苷酸包装的VLP具有降低的纯度，需要进行强烈并且昂贵的纯化，并且稳定性降低，如通过SEC色谱图随时间的变化所证明。具体来说，随时间的推移，观察到低分子量峰增加，这表明VLP中的一些不稳定并且分别释放最初包装的DNA和寡核苷酸，

基于发明人的发现，特别是基于对WO2007/144150的解聚集/聚集方法的最初使用的寡核苷酸的纯度的高度依赖性，似乎WO2007/144150的方法，特别是WO2007/144150的解聚集/聚集方法已经针对低纯度的富含G的寡核苷酸开发并优化。如所指示，如今不仅遍在可获得高纯度的富含G的寡核苷酸，而且，此外，其用于制药药物的使用是监管批准的前提。此外，WO2007/144150的现有技术方法除其不一致和根据最初使用的寡核苷酸的纯度相对于形成的聚集的寡核苷酸的具体大小和构象的大变化之外的另一个主要缺点是由于不受控制且混乱的聚集，在所定义的大小范围中实现聚集的寡核苷酸的制备的在此相关联的非常窄的时间窗口。

因此并且由于这些发生的不一致和变化以及对最初使用的寡核苷酸的纯度的强依赖性，WO2007/144150的方法不适合大规模制造，特别是不适合GMP制造，尤其其中批次间一致性至关重要的临床试验材料。

因此，本发明提供用于生产包含聚集的寡核苷酸的核苷酸组合物的方法，和用于生产包含RNA噬菌体的病毒样颗粒和包装在所述病毒样颗粒中的聚集的寡核苷酸的组合物的方法，由此避免或减少先有技术方法的缺点。

因此，在第一方面，本发明提供用于生产包含聚集的寡核苷酸的核苷酸组合物的方法，所述方法包含以下步骤：

(a)提供寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个聚G段；

(b)使所述寡核苷酸变性，其中所述变性包含以下步骤

(i)在温度I下温育包含所述寡核苷酸和离液剂的水溶液I直到所述寡核苷酸的平均直径为1nm或更小，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定，并且其中所述温度I为75℃到99℃，并且其中优选地，所述离液剂为脲；

(c)聚集所述寡核苷酸，其中所述聚集包含以下步骤

(i)在温度II下温育包含在步骤(b)中获得的所述平均直径为1nm或更小的所述寡核苷酸、离液剂和阳离子的水溶液，以形成所述聚集的寡核苷酸，其中执行所述温育直到所述形成的聚集的寡核苷酸的平均直径为6-16nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定，并且其中所述温度II为75℃到99℃，并且其中优选地，所述离液剂为脲；

(ii)将所述溶液的温度II调节到温度III，其中所述温度III低于40℃，优选地低于30℃；

其中所述步骤优选地以给定顺序执行。

有利地，本发明方法允许控制形成的聚集的寡核苷酸的大小，并且以此，控制聚集的寡核苷酸的构象，并且因此其一致形成高纯度、稳定并且良好形成，即通常仅仅球形的用寡核苷酸包装的VLP。

因此，本发明方法允许通过其直径在6-16nm，优选地7-14nm，进一步优选地8-14nm，再进一步优选地9-14nm，再进一步优选地10-14nm，再进一步优选地11-13nm之间，由此11、12或13nm，并且最优选地12nm控制聚集的寡核苷酸的大小，其中所述直径通过动态光散射(DLS)确定。

重要的是，本发明方法不仅允许控制大小，并且因此，控制形成的聚集的寡核苷酸的构象，而且除此之外，无论用于变性步骤的寡核苷酸的纯度如何，都可控制。此外，本发明方法另外因为允许控制聚集使得能够提供并且提供更宽的其中执行聚集步骤的操作窗口。这类控制和额外的时间以及更宽的操作窗口，以及在方法控制中的更高的精确度，分别使本发明方法对于GMP质量，特别是大规模GMP质量的昂贵生产非常有利。此外，最终获得的寡核苷酸包装的VLP的产量另外更高得多，而且纯度更高，特别是不需进一步昂贵的纯化步骤。

如所指示，与通过本发明方法形成的聚集的寡核苷酸相比，WO2007/144150的现有技术方法导致形成相对于形成的聚集的寡核苷酸的具体大小和构象示出显著的不一致和大的变化的聚集的寡核苷酸，如通过动态光散射(DLS)确定。然而，必须指出，在使用所述RNA噬菌体的衣壳作为标准品的尺寸排阻HPLC中，如在WO2007/144150中定义，即使相应的最佳范围略有偏移，但是通过本发明方法形成的聚集的寡核苷酸全部符合相对峰开始时间(PST)的标准。因此，通过本发明方法形成的优选的聚集的寡核苷酸确实具有PST，如相应地确定为90％-105％，优选地92％-102％。

与WO2007/144150的现有技术方法相比，本发明方法的另外的优势为避免盐，并且特别是使用离液剂，优选地脲用于变性步骤。因此，含有变性的，通常为单体寡核苷酸的本发明方法的所得溶液为稳定的，没有再聚集的威胁，并且因此，可存储以供进一步使用。如此，可将这些溶液加热或冷却多次而不形成聚集体，并且有利地，可将其冷冻以供将来使用。对于后者，对于如所指示的现有技术方法来说是不可能的，这是由于在寡核苷酸降解之前停止变性步骤所需的中和步骤期间产生的盐的存在。因此，必须在没有储存可能性的情况下随后使用所述制备的现有技术溶液。

对于本发明，寡核苷酸的聚集状态的特征在于动态光散射(DLS)，其测量在散射光中的时间依赖性波动。然后通过使聚集体通过溶剂的扩散速率相关来计算聚集的寡核苷酸的流体力学半径和直径。已发现聚集的寡核苷酸的平均流体动力学直径为6-16nm，优选地7-14nm，进一步优选地8-14nm，再进一步优选地9-14nm，再进一步优选地10-14nm，再进一步优选地11-13nm，因此，11、12或13nm，并且最优选地12nm为最佳。

因此，在另一方面，本发明提供用于生产包含以下的组合物的方法：(i)病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒为RNA噬菌体的病毒样颗粒，和(ii)聚集的寡核苷酸，其中所述聚集的寡核苷酸包装到所述病毒样颗粒中，所述方法包含以下步骤：

(a)产生混合物，其中所述混合物包含：

(i)所述RNA噬菌体的外壳蛋白；

(ii)能够防止所述外壳蛋白自组装的试剂；和

(iii)聚集的寡核苷酸，其中所述聚集的寡核苷酸包含包含至少一个聚G段的寡核苷酸，并且其中所述聚集的寡核苷酸的平均直径为6-16nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定；

(b)从所述混合物去除所述试剂；和

(c)使所述外壳蛋白自组装到病毒样颗粒中并且包装所述聚集的寡核苷酸。

在再另一方面，本发明提供用于生产包含以下的组合物的方法：(i)病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒为RNA噬菌体的病毒样颗粒，和(ii)聚集的寡核苷酸，其中所述聚集的寡核苷酸包装到所述病毒样颗粒中，所述方法包含以下步骤：

(a)产生混合物，其中所述混合物包含：

(i)所述RNA噬菌体的外壳蛋白；

(ii)能够防止所述外壳蛋白自组装的试剂；和

(iii)聚集的寡核苷酸，其中所述聚集的寡核苷酸包含包含至少一种聚段的寡核苷酸，并且其中所述聚集的寡核苷酸通过根据本发明的第一方面的方法可获得，并且其中所述聚集寡核苷酸的平均直径为6-16nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定；

(b)从所述混合物去除所述试剂；和

(c)使所述外壳蛋白自组装到病毒样颗粒中并且包装所述聚集的寡核苷酸。

在再另一方面，本发明提供用于生产包含以下的组合物的方法：(i)病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒为RNA噬菌体的病毒样颗粒，和(ii)聚集的寡核苷酸，其中所述聚集的寡核苷酸包装到所述病毒样颗粒中，所述方法包含以下步骤：

(a)产生混合物，其中所述混合物包含：

(i)所述RNA噬菌体的外壳蛋白；

(ii)能够防止所述外壳蛋白自组装的试剂；和

(iii)包含所述聚集的寡核苷酸的核苷酸组合物，并且其中所述核苷酸组合物通过根据本发明的用于生产包含聚集的寡核苷酸的核苷酸组合物的方法可获得，并且其中所述聚集的寡核苷酸包含包含至少一个聚G段的寡核苷酸，并且其中所述聚集的寡核苷酸的平均直径为6-16nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定；

(b)从所述混合物去除所述试剂；和

(c)使所述外壳蛋白自组装到病毒样颗粒中并且包装所述聚集的寡核苷酸。

在所述方法期间，所述病毒样颗粒在存在所述聚集寡核苷酸的情况下通过所述RNA噬菌体的外壳蛋白的自组装形成。

在再另一方面中，本发明提供包含聚集的寡核苷酸的核苷酸组合物，其中所述核苷酸组合物通过根据本发明的用于生产包含聚集的寡核苷酸的核苷酸组合物的方法可获得，其中优选地，所述聚集的寡核苷酸的平均直径为6-16nm，优选地7-14nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在再另一方面中，本发明提供包含聚集的寡核苷酸的核苷酸组合物，其中所述聚集的寡核苷酸的平均直径为7-14nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在再另一方面中，本发明提供包含(i)RNA噬菌体的病毒样颗粒和(ii)聚集的寡核苷酸的组合物，其中所述聚集的寡核苷酸包装到所述病毒样颗粒中，其中所述组合物通过根据本发明用于生产包含以下的组合物的方法可获得：(i)病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒为RNA噬菌体的病毒样颗粒，和(ii)聚集的寡核苷酸。

在再另一方面中，本发明提供包含(i)RNA噬菌体的病毒样颗粒和(ii)聚集的寡核苷酸的组合物，其中所述聚集的寡核苷酸包装到所述病毒样颗粒中，其中所述聚集的寡核苷酸的平均直径为6-16nm，优选地7-14nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

随着本说明书继续，本发明的另外的方面和实施例将变得显而易见。

附图说明

图1A：如通过本发明方法获得的变性的寡核苷酸G10和聚集的寡核苷酸G10的动态光散射(DLS)。如在实例3中所描述执行DLS。图1A示出变性的高纯度G10寡核苷酸，其中平均颗粒直径为0.90nm，指示G10寡核苷酸二级结构已经被破坏，变性完成，并且已获得单体。如重叠曲线所示，执行多次扫描。这些扫描的平均直径(D

图1B：如通过本发明方法获得的变性的寡核苷酸G10和聚集的寡核苷酸G10的动态光散射(DLS)。如在实例3中所描述执行DLS。图1B示出获得的随后聚集G10寡核苷酸具有适当的聚集，并且直径为12nm。如重叠曲线所示，执行多次扫描。这些扫描的平均直径(D

图2A：变性的寡核苷酸G10的DLS。如在实例3中所描述执行DLS。如在现有技术(WO2007/144150)中所描述，SEQ ID NO:1的低纯度寡核苷酸G10(约79％，如通过反相HPLC和阴离子交换HPLC确定)用于解聚集(变性)。DLS示出颗粒平均直径为2.2nm，指示不是所有寡核苷酸G10二级结构已被破坏并且变性成单体。如重叠曲线所示，执行多次扫描。这些扫描的平均直径(D

图2B：变性的寡核苷酸G10的DLS。如在实例3中所描述执行DLS。如在现有技术(WO2007/144150)中所描述，SEQ ID NO:1的高纯度寡核苷酸G10(约94％，如通过反相HPLC和阴离子交换HPLC确定)用于解聚集(变性)。DLS示出颗粒平均直径为2.8nm，指示不是所有寡核苷酸G10二级结构已被破坏并且变性成单体。如重叠曲线所示，执行多次扫描。这些扫描的平均直径(D

图2C：变性的寡核苷酸G10的DLS。如在实例3中所描述执行DLS。SEQ ID NO:1的高纯度寡核苷酸G10(约94％，如通过反相HPLC和阴离子交换HPLC确定)用于本发明方法的变性。DLS示出颗粒平均直径为0.9nm，指示寡核苷酸G10已完全或基本上完全变性成单体。如重叠曲线所示，执行多次扫描。这些扫描的平均直径(D

图3A：聚集的寡核苷酸G10的DLS。如在实例3中所描述执行DLS。使用如从实例5获得的变性的寡核苷酸(图2A-2C)。低纯度G10的如在现有技术(WO2007/144150)中所描述的聚集通过现有技术方法变性。SEQ ID NO:1的低纯度寡核苷酸G10对应于约79％纯度，如通过反相HPLC和阴离子交换HPLC确定。DLS示出聚集的寡核苷酸，其不仅在期望颗粒范围的高侧(15nm)，而且此外，10％的材料显著更大(30-50nm)。如重叠曲线所示，执行多次扫描。这些扫描的平均直径(D

图3B：聚集的寡核苷酸G10的DLS。如在实例3中所描述执行DLS。使用如从实例5获得的变性的寡核苷酸(图2A-2C)。高纯度G10的如在现有技术(WO2007/144150)中所描述的聚集通过现有技术方法变性。SEQ ID NO:XX的高纯度寡核苷酸G10对应于约94％纯度，如通过反相HPLC和阴离子交换HPLC确定。DLS示出聚集的寡核苷酸的平均直径完全(100％)在6-16nm的直径范围(期望范围)外，如由阴影框说明。如重叠曲线所示，执行多次扫描。这些扫描的平均直径(D

图3C：聚集的寡核苷酸G10的DLS。如在实例3中所描述执行DLS。使用如从实例5获得的变性的寡核苷酸(图2A-2C)。高纯度G10的聚集根据本发明方法。SEQ ID NO:1的高纯度寡核苷酸G10对应于约94％纯度，如通过反相HPLC和阴离子交换HPLC确定。DLS示出所述聚集的寡核苷酸的平均直径完全(100％)在6-16nm的直径范围(期望范围)内，如由阴影框说明。如重叠曲线所示，执行多次扫描。这些扫描的平均直径(D

图4A：通过尺寸排阻色谱法分析的纯化Qβ外壳蛋白的表征。纯化QβVLP的样品。观察到的峰(比率A260/A280＝2)由VLP的RNA核心支配，因为在260nm处RNA的吸收系数大约高于外壳蛋白的吸收系数高100倍。

图4B：通过尺寸排阻色谱法分析的纯化Qβ外壳蛋白的表征。拆卸反应的上清液的样品。释放的外壳蛋白由在大约12min处存在蛋白样峰指示。此外，在6.8到11min的范围内存在未沉淀的RNA分子的若干物种。

图4C：通过尺寸排阻色谱法分析的纯化Qβ外壳蛋白的表征。纯化Qβ外壳蛋白的样品。在柱TSK G5000PWxl(东曹生命科学(Tosoh Bioscience))上在PBS中执行分析。

图5A：用通过现有技术的解聚集-聚集方法和通过本发明的变性和聚集获得的聚集的寡核苷酸G10包装的RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒(VLP)的DLS和电子显微照片(EM)图片。如在实例3中所描述执行DLS，并且如在实例8中所描述进行EM。用通过现有技术的解聚集-聚集方法获得的聚集的寡核苷酸G10包装的QβVLP的DLS。如重叠曲线所示，执行多次扫描。这些扫描的平均直径(D

图5B：用通过现有技术的解聚集-聚集方法和通过本发明的变性和聚集获得的聚集的寡核苷酸G10包装的RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒(VLP)的DLS和电子显微照片(EM)图片。如在实例3中所描述执行DLS，并且如在实例8中所描述进行EM。用通过现有技术的解聚集-聚集方法获得的聚集的寡核苷酸G10包装的QβVLP的EM。包括箭头以识别棒状结构。

图5C：用通过现有技术的解聚集-聚集方法和通过本发明的变性和聚集获得的聚集的寡核苷酸G10包装的RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒(VLP)的DLS和电子显微照片(EM)图片。如在实例3中所描述执行DLS，并且如在实例8中所描述进行EM。用通过本发明方法获得的聚集的寡核苷酸G10包装的QβVLP的DLS。如重叠曲线所示，执行多次扫描。这些扫描的平均直径(D

图5D：用通过现有技术的解聚集-聚集方法和通过本发明的变性和聚集获得的聚集的寡核苷酸G10包装的RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒(VLP)的DLS和电子显微照片(EM)图片。如在实例3中所描述执行DLS，并且如在实例8中所描述进行EM。用通过本发明方法获得的聚集的寡核苷酸G10包装的QβVLP的EM。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。

平均直径：如本文所用，如通过动态光散射(DLS)确定的术语“平均直径”是指如通常并且优选地以如在实例3中所描述的方式通过DLS测量的直径，并且给定平均直径值的测量的颗粒是指具有所述直径作为正态分布(高斯分布)中的平均值的颗粒。因此，如本文所用，如通过动态光散射(DLS)确定并且如通常并且优选地应用到根据本发明的寡核苷酸、聚集的寡核苷酸和用聚集的寡核苷酸包装的VLP的术语“平均直径”通常并且优选地是指如通过DLS测量的直径，通常并且优选地以如在实例3中所描述的方式，并且给定平均直径值的测量的颗粒是指其中至少90％，优选地至少95％的所述颗粒具有所述给定值的直径或所述给定值的±10％的直径的颗粒。为了清楚起见，例如，平均直径值为12nm的本发明聚集的寡核苷酸是指所述本发明聚集寡核苷酸，其中至少90％，优选地至少95％的所述本发明聚集的寡核苷酸的直径为10.8nm到13.2nm。另外，如本文所用，如通过动态光散射(DLS)确定并且如通常并且优选地应用到根据本发明的寡核苷酸、聚集的寡核苷酸和用聚集的寡核苷酸包装的VLP的术语“平均直径”通常并且优选地是指如通过DLS测量的直径，通常并且优选地以如在实例3中所描述的方式，并且给定平均直径值的测量的颗粒是指其中至少65％，优选地至少70％的所述颗粒具有所述给定值的直径或所述给定值的±5％的直径的颗粒。为了清楚起见，例如，平均直径值为12nm的本发明聚集的寡核苷酸是指所述本发明聚集寡核苷酸，其中至少65％，优选地至少70％的所述本发明聚集的寡核苷酸的直径为11.4n到12.6nm。

值的所有范围，特别是本文公开的平均直径或直径的所有范围，应指落在所述范围内的所有值，包括限定范围的值。为了清楚起见，例如，直径值12nm到13nm应指12nm或13nm的直径或落入12nm和13nm内的所有直径。

离液剂：如本文所用，术语“离液剂”是指破坏蛋白、寡核苷酸或其它大分子的有序结构的分子或物质。此稳定性的下降通常是由氢键键合网络的破坏引起的。例子包括脲、苯酚、异丙醇(IPA)、乙醇和氯化胍等。

寡核苷酸：如本文所用，术语寡核苷酸是指单链脱氧核糖核苷酸。优选的寡核苷酸包含至少一个如下文定义的聚G段。更优选的寡核苷酸包含2、3、4、5或6个所述聚G段。非常优选的寡核苷酸恰好包含两个聚G段，其中优选地，所述两个聚G段中的一个位于所述寡核苷酸的5'端或3'端。甚至更优选的寡核苷酸恰好包含两个聚G段，其中所述两个聚G段中的一个位于所述寡核苷酸的5'端，并且所述两个聚G段中的一个位于所述寡核苷酸的3'端。通常并且优选地，如本文所用的寡核苷酸由6到1000，优选地10到1000，更优选地10到200，再更优选地10到100，再更优选地20到40，并且最优选30个核苷酸组成。另外优选的寡核苷酸由15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸组成。再更优选的寡核苷酸由24到32个核苷酸，更优选地约30个核苷酸组成。

术语寡核苷酸还指包含至少一个修饰的核苷酸的分子，其中优选地，所述修饰的核苷酸选自(a)核苷酸类似物或(b)包含主链修饰的核苷酸。在一个实施例中，寡核苷酸包含至少一种选自由以下组成的组的修饰的核苷酸：(a)肽核酸，(b)肌苷，(c)三苯甲基化碱基，(d)硫代磷酸酯，(e)烷基硫代磷酸酯，(f)5-硝基吲哚脱氧呋喃核糖基，(g)5-甲基脱氧胞嘧啶，和(h)5,6-二氢-5,6-二羟基脱氧胸苷。在另一实施例中，寡核苷酸包含硫代磷酸酯化的核苷酸或替代地由其组成。硫代磷酸酯化的核苷酸在细胞或生物中被保护免受降解，并且因此是优选的核苷酸修饰。进一步优选的是通常在自然界中发现的多核苷酸的化学、酶促或代谢修饰形式。然而，优选的寡核苷酸仅仅由未修饰的核苷酸，即腺苷、胸苷、鸟苷和/或胞苷组成。又进一步优选的寡核苷酸仅仅由磷酸二酯结合核苷酸组成。

非常优选的寡核苷酸为含有未甲基化CpG的寡核苷酸，其包含至少一个，优选地一、二、三或四个CpG基序。再更优选的寡核苷酸包含回文序列，其中优选地所述回文序列包含至少一个，优选地一、二、三或四个CpG基序。再更优选的寡核苷酸包含回文序列，其中优选地所述回文序列包含序列GACGATCGTC(SEQ ID NO:2)或优选地由其组成。再更优选的寡核苷酸包含回文序列，其中所述回文序列在其5'端处通过聚g段侧接，并且其中所述回文序列在其3'端处通过聚G段侧接，其中优选地所述回文序列为GACGATCGTC(SEQ ID NO:2)。非常优选的寡核苷酸包含回文序列，其中所述回文序列在其5'端处通过至少3到15，优选地6到10个鸟苷实体侧接，并且其中所述回文序列在其3'端处通过至少3到15，优选地6到10个鸟苷实体侧接，其中优选地所述回文序列为GACGATCGTC(SEQ ID NO:2)。

聚G段：术语聚G段涉及寡核苷酸的片段，其中所述链段由至少3个连续鸟苷残基组成。优选的聚G段由3到25，优选地4到20，更优选地4到15并且最优选4到10个连续鸟苷实体组成。进一步优选的聚G段由3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续鸟苷实体组成。

CpG基序：如本文所用，术语CpG基序是指短的DNA序列，优选地单链DNA序列，其包含胞嘧啶(C)-鸟苷(G)二核苷酸，其中C未甲基化并且其中优选地所述CG二核苷酸为磷酸二酯结合的。优选地，CpG基序包含至少一个，优选地一、二或三个额外的核苷酸5'和/或3'的所述CG二核苷酸，其中进一步优选地，所述额外的核苷酸不包含CG二核苷酸。

相对峰开始时间：术语“相对峰开始时间”为指示寡核苷酸的聚集状态的参数，并且其主要如WO 2007/144150中所描述使用如实例4中所描述的条件通过分析尺寸排阻HPLC来分析。

包装：如本文所用，术语“包装”是指寡核苷酸，通常并且优选地聚集寡核苷酸关于病毒样颗粒的状态。术语“聚集的寡核苷酸包装到VLP中”或“用聚集的寡核苷酸包装的VLP”的使用是等同的。如本文所用，术语“包装”通常并且优选地是指非共价结合，优选地离子相互作用、疏水性相互作用或氢键。通常并且非常优选地，如本文所用，术语“包装”是指所述聚集的寡核苷酸在VLP内的封装。通常且优选地，用聚集的寡核苷酸包装的VLP保护所述聚集的寡核苷酸免于降解，优选地免于DNA酶水解。因此，在优选的含义中，术语“包装”指示在包装状态下的聚集的寡核苷酸不可用于DNA酶水解。更优选地，术语“包装”指示聚集的寡核苷酸不可用于DNA酶水解，其中进一步优选地，DNA酶为DNAseI或核酸酶。再更优选地，术语“包装”指示聚集的寡核苷酸不可用于核酸酶水解。

寡核苷酸对于DNA酶(例如DNaseI或核酸酶)的可及性优选地如WO2003/024481A2的实例11-17中所描述(参见其中第111页)。在优选的含义中，当用核酸酶处理(在包含2mMMgCl

外壳蛋白：如本文所用，术语“外壳蛋白”是指能够掺入噬菌体或RNA噬菌体的衣壳组装体中的RNA噬菌体的(一种或多种)蛋白。因此，术语外壳蛋白是指形成RNA噬菌体的衣壳或RNA噬菌体的VLP的蛋白。通常且优选地，RNA噬菌体的外壳蛋白具有二聚体结构。

重组外壳蛋白的片段：如本文所用，重组外壳蛋白的片段被定义为多肽，其分别具有至少70％，优选地至少80％，更优选地至少90％，甚至更优选地至少95％野生型外壳蛋白或野生型重组蛋白的长度，并且其优选保留形成VLP的能力。优选地，片段通过至少一种内部缺失、至少一种截断或其至少一种组合获得。术语“重组外壳蛋白的片段”或“外壳蛋白的片段”应另外涵盖多肽，其分别具有与野生型外壳蛋白至少80％，优选地90％，甚至更优选地95％氨基酸序列同一性，并且其优选地能够组装到病毒样颗粒中。术语“突变体外壳蛋白”是指分别具有衍生自野生型重组蛋白或外壳蛋白的氨基酸序列的多肽，其中氨基酸序列至少80％，优选地至少85％、90％、95％、97％或99％与野生型序列相同，并且优选地保留组装到VLP中的能力。

病毒样颗粒(VLP)：如本文所用，VLP是指非复制性或非感染性的，优选地非复制性和非感染性的病毒颗粒，或是指非复制性或非感染性的，优选地，类似于病毒颗粒，优选病毒的衣壳的非复制性和非感染性结构。如本文所用，术语“非复制性”是指不能复制VLP所包含的基因组。如本文所用，术语“非感染性”是指不能进入宿主细胞。优选地，根据本发明的病毒样颗粒为非复制性和/或非感染性的，因为它缺乏病毒基因组或基因组功能的全部或部分。在一个实施例中，病毒样颗粒为病毒颗粒，其中病毒基因组已被物理或化学灭活，通过拆卸和重组或通过将纯化的蛋白组装到VLP中去除。通常并且更优选地，病毒样颗粒缺乏病毒基因组的全部或部分复制性和感染性组分。根据本发明的病毒样颗粒可含有与其基因组不同的核酸。根据本发明的病毒样颗粒的典型并且优选的实施例为病毒衣壳，如相应病毒、噬菌体，优选地RNA噬菌体的病毒衣壳。术语“衣壳”是指由病毒蛋白亚基构成的大分子组装体。通常，存在60、120、180、240、300、360和多于360个病毒蛋白亚基。通常并且优选地，这些亚基的相互作用导致形成具有固有重复组织的病毒衣壳，其中所述结构通常并且优选地为球形。举例来说，RNA噬菌体的衣壳具有二十面体对称的球形形式。

RNA噬菌体的病毒样颗粒：如本文所用，术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”是指包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段，或优选地主要由其组成，或由其组成的病毒样颗粒。此外，RNA噬菌体的病毒样颗粒类似于RNA噬菌体的结构，为非复制性和/或非感染性的，并且至少缺少编码RNA噬菌体复制机制的一个或多个基因，并且通常还缺少编码负责病毒附着或进入宿主的一种或多种蛋白的基因。衍生自RNA噬菌体的优选的VLP表现出二十面体对称性并且由180个亚基组成。在本发明的上下文中，术语RNA噬菌体的病毒样颗粒优选地涉及通过RNA噬菌体的重组外壳蛋白或其片段或突变体的自组装获得的大分子结构，其中优选地，所述自组装分别在存在寡核苷酸和聚集的寡核苷酸的情况下发生。

能够防止外壳蛋白自组装的试剂：能够防止外壳蛋白自组装的试剂是防止在所述混合物中自发形成病毒样颗粒的试剂。技术人员能够例如通过尺寸排阻色谱法分析所述混合物来实验确定所述试剂的化学性质和适当的浓度，如例如在WO2007/144150的实施例9中公开。当将所述混合物在室温下，优选地在22℃下，温育至少1h后，通过尺寸排阻色谱法没有检测到病毒样颗粒时，试剂能够防止外壳蛋白的自组装，如例如在WO2007/144150的实施例9中公开。然而，能够防止外壳蛋白自组装的试剂不会不可逆地修饰所述外壳蛋白，并且从所述混合物去除所述试剂将导致病毒样颗粒的自发形成。能够防止外壳蛋白自组装的优选试剂包含清洁剂、盐酸胍和脲，最优选地脲。优选的清洁剂为十二烷基硫酸钠、吐温20、TritonX 100等。通常并且优选地，能够防止外壳蛋白自组装的试剂另外包含还原剂，如通常并且优选地DDT，其使由所述外壳蛋白的半胱氨酸残基形成的分子间二硫键保持处于还原状态。

纯度：本发明组合物的纯度通过分析尺寸排阻HPLC确定，所述组合物包含(i)病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒，和(ii)聚集的寡核苷酸，其中所述聚集的寡核苷酸包装到所述病毒样颗粒中，其中所述HPLC在主要，优选地精确地如在实施例4中公开的条件下执行。所述组合物的纯度确定为在所述组合物中含有的所述病毒样颗粒的峰面积相对于同一色谱图中所有峰的总峰面积的百分比。

一个”、“一(a/an)”：除非另外指示，否则当在本公开中使用术语“一个”、“一(a或an)”时，它们意指“至少一个”或“一个或多个”。

约：在本申请的含义内，表述约应具有+/-4％，通常并且优选地+/-2％的含义。举例来说约100应意指96到104，通常并且优选地98到102。

本发明提供用于生产包含聚集的寡核苷酸的核苷酸组合物的方法，所述方法包含以下步骤：(a)提供寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个聚G段；(b)使所述寡核苷酸变性，其中所述变性包含以下步骤：(i)在温度I下温育包含所述寡核苷酸和离液剂的水溶液I直到所述寡核苷酸的平均直径为1nm或更小，其中优选地所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定，并且其中所述温度I为75℃到99℃，并且其中优选地所述离液剂为脲；(c)聚集所述寡核苷酸，其中所述聚集包含以下步骤：(i)在温度II下温育包含在步骤(b)中获得的平均直径为1nm或更小的所述寡核苷酸、离液剂和阳离子的水溶液II以形成所述聚集的寡核苷酸，其中执行所述温育直到所述形成的聚集的寡核苷酸的平均直径为6-16nm，其中优选地所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定，并且其中所述温度II为75℃到99℃，并且其中优选地所述离液剂为脲；(ii)将所述溶液II的温度调节到温度III，其中所述温度III低于40℃，优选地低于30℃；其中所述步骤优选地以给定顺序执行。

本发明另外提供用于生产聚集的寡核苷酸的方法，其中所述方法包含以下步骤：(a)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个聚G段；(b)使所述寡核苷酸变性，其中所述变性包含以下步骤：(i)在温度I下温育包含所述寡核苷酸和离液剂的水溶液I直到所述寡核苷酸的平均直径为1nm或更小，其中优选地所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定，并且其中所述温度I为75℃到99℃，并且其中优选地所述离液剂为脲；(c)聚集所述寡核苷酸，其中所述聚集包含以下步骤：(i)在温度II下温育包含在步骤(b)中获得的所述平均直径为1nm或更小的所述寡核苷酸、离液剂和阳离子的水溶液II以形成所述聚集的寡核苷酸，其中执行所述温育直到所述形成的聚集的寡核苷酸的平均直径为6-16nm，其中优选地所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定，并且其中所述温度II为75℃到99℃，并且其中优选地所述离液剂为脲；(ii)将所述溶液II的温度调节到温度III，其中所述温度III低于40℃，优选地低于30℃；其中所述步骤优选地以给定顺序执行。

在优选的实施例中，所述使所述寡核苷酸变性包含在包含所述离液剂的水溶液中溶解所述寡核苷酸以形成所述水溶液I的步骤，其中所述水溶液不包含浓度高于1mM的一价或二价离子，并且其中优选地所述水溶液不包含浓度高于500μM，优选地高于250μM，优选地不高于100μM，优选地不高于50μM，优选地不高于10μM的一价或二价离子。

在另一优选的实施例中，所述使所述寡核苷酸变性包含在包含所述离液剂的水溶液中溶解所述寡核苷酸以形成所述水溶液I的步骤，其中所述水溶液不包含以在添加寡核苷酸之后将引起所述寡核苷酸自聚集的浓度的一价或二价离子。

在另一优选的实施例中，所述水溶液I不包含以使得所述寡核苷酸自聚集的浓度的一价或二价离子。

在另一优选的实施例中，所述使所述寡核苷酸变性包含在包含所述离液剂的水溶液中溶解所述寡核苷酸以形成所述水溶液I的步骤，其中所述水溶液不包含以在添加寡核苷酸之后将引起所述寡核苷酸自发地自聚集的浓度的一价或二价离子。

在另一优选的实施例中，所述水溶液I不包含以使得所述寡核苷酸自发地自聚集的浓度的一价或二价离子。

在另一优选的实施例中，所述使所述寡核苷酸变性包含以下步骤：溶解所述寡核苷酸和所述离液剂以形成所述水溶液I，和将所述溶液I的温度调节到温度I。

在另一优选的实施例中，在所述溶液I中包含的所述离液剂选自脲、苯酚、异丙醇、乙醇和氯化胍。

在另一优选的实施例中，在所述溶液I中包含的所述离液剂为脲。

在另一优选的实施例中，所述温度I为75℃到90℃，优选地80℃到90℃，进一步优选地83℃到87℃，再进一步优选地约85℃，并且最优选地85℃。

在另一优选的实施例中，执行所述在所述温度I下在所述溶液I中温育所述寡核苷酸10到120min，优选地20到60min，进一步优选地20到30min，并且再进一步优选地15-18min。

在另一优选的实施例中，在所述溶液I中所述离液剂，优选地所述脲的所述浓度为200nM到5M，优选地500mM到2M，进一步优选地500mM到1.5M，并且再进一步优选地1M。

在另一优选的实施例中，在所述溶液I中所述寡核苷酸，优选地SEQ ID NO:1的所述寡核苷酸的所述浓度为100μM到1mM，优选地100μM到750μM，进一步优选地200μM到600μM，并且再进一步优选地350μM到500μM。

在另一优选的实施例中，执行所述在所述温度I下在所述溶液中温育所述寡核苷酸在15分钟和120分钟之间，优选地在15min到60min之间，并且进一步优选地在15min到30min之间，再进一步优选地在15min到25min之间。

在另一优选的实施例中，所述寡核苷酸在其5'端处包含至少3个并且最多15个鸟苷实体，并且在其3'端处包含至少3个并且最多15个鸟苷实体，优选地至少6个最多13个鸟苷实体，并且在其3'端处包含至少6个并且最多13个鸟苷实体，进一步优选地至少8个并且最多11个鸟苷实体，并且在其3'端处包含至少8个并且最多11个鸟苷实体。

在另一优选的实施例中，所述寡核苷酸包含回文序列，其中优选地所述回文序列为GACGATCGTC(SEQ ID NO:2)，并且其中进一步优选地所述回文序列在其5'端处侧接至少3个并且最多15个鸟苷实体，并且其中所述回文序列在其3'端处侧接至少3个并且最多15个鸟苷实体，并且其中再进一步优选地所述回文序列在其5'端处侧接至少6个并且最多13个鸟苷实体，并且其中所述回文序列在其3'端处侧接至少6个并且最多13个鸟苷实体，并且其中再进一步优选地所述回文序列在其5'端处侧接至少8个并且最多11个鸟苷实体，并且其中所述回文序列在其3'端处侧接至少8个并且最多11个鸟苷实体。

在另一优选的实施例中，所述寡核苷酸包含10到1000个核苷酸，优选地10到200个核苷酸，进一步优选地10到100个核苷酸，又进一步优选地20到40个核苷酸，并且又进一步优选地30个核苷酸。

在另一优选的实施例中，所述寡核苷酸包含选自由以下组成的组的核酸序列：

(a)G10：GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:1)；

(b)G10-11：GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:3)；

(c)G12-11：GGGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:4)

(d)G6：GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO:5)；

(e)G7：GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO:6)；

(f)G8：GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQ ID NO:7)；

(g)G9：GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQ ID NO:8)；

(h)G11：GGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:9)

(i)G6-10：GGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:24)；

(j)G7-10：GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:25)；

(k)G8-10：GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:26)；和

(l)G9-10：GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:27)。

在另一优选的实施例中，所述寡核苷酸具有核酸序列G10GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:1)。

在另一优选的实施例中，所述寡核苷酸仅仅由磷酸二酯连接的脱氧核苷酸组成。

在另一优选的实施例中，所述寡核苷酸的纯度，优选地SEQ ID NO:1的所述寡核苷酸的纯度为90％或更高，如通过HPLC，优选地通过反相HPLC或阴离子交换HPLC，更优选地通过反相HPLC确定。

在另一优选的实施例中，所述寡核苷酸的纯度，优选地SEQ ID NO:1的所述寡核苷酸的纯度为92％或更高，优选地94％或更高，进一步优选地95％或更高，再进一步优选地97％或更高，再进一步优选地98％或更高，再进一步优选地99％或更高，如通过HPLC，优选地通过反相HPLC或阴离子交换HPLC，更优选地通过反相HPLC确定。

在另一优选的实施例中，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:1的序列，其中所述寡核苷酸仅仅由磷酸二酯连接的脱氧核苷酸组成。

在另一优选的实施例中，所述寡核苷酸由SEQ ID NO:1的序列组成。

在另一优选的实施例中，所述寡核苷酸由SEQ ID NO:1的序列组成，其中所述寡核苷酸仅仅由磷酸二酯连接的脱氧核苷酸组成。

在另一优选的实施例中，在所述溶液II中包含的所述离液剂选自脲、苯酚、异丙醇、乙醇和氯化胍。

在另一优选的实施例中，在所述溶液II中包含的所述离液剂为脲。

因此，在另一优选的实施例中，在所述溶液II(即在所述用于聚集的溶液中)中包含的所述离液剂为脲。

在另一优选的实施例中，所述温度II为75℃到90℃，优选地80℃到90℃，进一步优选地83℃到87℃，再进一步优选地约85℃，并且最优选地85℃。

在另一优选的实施例中，在所述溶液II中所述离液剂，优选地所述脲的所述浓度为200nM到5M，优选地500mM到2M，进一步优选地500mM到1.5M，并且再进一步优选地1M。

在另一优选的实施例中，所述阳离子选自Na

所述阳离子通常并且优选地借助于无机盐提供，并且其中进一步优选地所述无机盐选自氯化物和硫酸盐。优选地，作为所述阳离子的所述Na

在另一优选的实施例中，在所述溶液II中所述阳离子的所述浓度为20mM到2M，优选地50mM到1M，进一步优选地100mM到500mM，并且再进一步优选地250mM。

在另一优选的实施例中，在所述溶液I中包含的所述离液剂和在所述溶液II中包含的所述离液剂相同。

在另一优选的实施例中，在所述溶液I中包含的所述离液剂和在所述溶液II中包含的所述离液剂的浓度相同。

在另一优选的实施例中，在所述溶液I中包含的所述离液剂和在所述溶液II中包含的所述离液剂为脲。

在另一优选的实施例中，所述聚集所述寡核苷酸包含以下步骤：(i)溶解所述离液剂和所述阳离子以形成水溶液IIa，(ii)混合所述水溶液IIa和包含在步骤(b)中获得的所述平均直径为1nm或更小的所述寡核苷酸所述水溶液I以形成所述水溶液II，和(iii)将所述溶液II的温度调节到温度II。

在另一优选的实施例中，所述温度I和所述温度II的温度差为5℃或更小，优选地4℃或更小，进一步优选地3℃或更小，再进一步优选地2℃或更小，再进一步优选地1℃或更小，并且最优选所述温度I和所述温度II相等。

在另一优选的实施例中，执行所述温育直到所述聚集的寡核苷酸的平均直径为7-14nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，执行所述温育直到所述聚集的寡核苷酸的平均直径为8-14nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，执行所述温育直到所述聚集的寡核苷酸的平均直径为9-14nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，执行所述温育直到所述聚集的寡核苷酸的平均直径为10-14nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，执行所述温育直到所述聚集的寡核苷酸的平均直径为11-13nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，执行所述温育直到所述聚集的寡核苷酸的平均直径为11、12或13nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，执行所述温育直到所述聚集的寡核苷酸的平均直径为12nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

根据本发明，通过动态光散射(DLS)确定平均直径，无论是在变性过程中所述寡核苷酸的平均直径，还是在聚集过程中所述聚集的寡核苷酸的平均直径，都是高度有益的，因为在方法运行时可很容易地实现所述确定。这进一步确保分别对寡核苷酸和聚集的寡核苷酸的期望大小的非常高精度和非常高的控制。

在另一优选的实施例中，执行所述温育直到所述聚集的寡核苷酸包含80％到110％的相对峰开始时间，其中所述相对峰开始时间通过以RNA噬菌体的衣壳作为标准品的尺寸排阻HPLC确定。

在另一优选的实施例中，所述方法另外包含纯化所述聚集的寡核苷酸的步骤，并且其中优选地所述纯化包含将所述聚集的寡核苷酸，优选地包含所述聚集的寡核苷酸所述溶液II过滤通过50nm过滤器。

在另一优选的实施例中，所述50nm过滤器为50nm PTFE过滤器。

在另一优选的实施例中，所述将所述聚集的寡核苷酸，优选地包含所述聚集的寡核苷酸的所述溶液II过滤通过所述50nm过滤器，优选地所述50nm PTFE过滤器在0℃-20℃下执行。

所述进一步优选的纯化步骤，优选地过滤，允许在包装到VLP中步骤之前去除任何大的聚集体，并且因此通常另外导致最终产物的纯度进一步提高，即用聚集的寡核苷酸包装的本发明VLP通常提高约5％。因此，纯度的提高通常与在最终产物中较高分子量材料的减少相关联，如通过SEC HLPC或DLS证实。

在另一优选的实施例中，所述方法不包含纯化所述聚集的寡核苷酸的步骤。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸在其5'端处包含至少3个并且最多15个鸟苷实体，并且在其3'端处包含至少3个并且最多15个鸟苷实体，优选地至少6个最多13个鸟苷实体，并且在其3'端处包含至少6个并且最多13个鸟苷实体，进一步优选地至少8个并且最多11个鸟苷实体，并且在其3'端处包含至少8个并且最多11个鸟苷实体。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸包含回文序列，其中优选地所述回文序列为GACGATCGTC(SEQ ID NO:2)，并且其中进一步优选地所述回文序列在其5'端处侧接至少3个并且最多15个鸟苷实体，并且其中所述回文序列在其3'端处侧接至少3个并且最多15个鸟苷实体，并且其中再进一步优选地所述回文序列在其5'端处侧接至少6个并且最多13个鸟苷实体，并且其中所述回文序列在其3'端处侧接至少6个并且最多13个鸟苷实体，并且其中再进一步优选地所述回文序列在其5'端处侧接至少8个并且最多11个鸟苷实体，并且其中所述回文序列在其3'端处侧接至少8个并且最多11个鸟苷实体。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸包含10到1000个核苷酸，优选地10到200个核苷酸，进一步优选地10到100个核苷酸，又进一步优选地20到40个核苷酸，并且又进一步优选地30个核苷酸。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸包含选自由以下组成的组的核酸序列：

(a)G10：GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:1)；

(b)G10-11：GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:3)；

(c)G12-11：GGGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:4)

(d)G6：GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO:5)；

(e)G7：GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO:6)；

(f)G8：GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQ ID NO:7)；

(g)G9：GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQ ID NO:8)；

(h)G11：GGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:9)

(i)G6-10：GGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:24)；

(j)G7-10：GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:25)；

(k)G8-10：GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:26)；和

(l)G9-10：GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:27)。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸具有核酸序列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:1)(G10)。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸仅仅由磷酸二酯连接的脱氧核苷酸组成。

在另一方面中，本发明提供包含聚集的寡核苷酸的核苷酸组合物，其中所述核苷酸组合物通过根据本发明的用于生产包含聚集的寡核苷酸的核苷酸组合物的方法可获得，其中优选地，所述聚集的寡核苷酸的平均直径为6-16nm，优选地7-14nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸的平均直径为8-14nm，优选地9-14nm，进一步优选地10-14nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸的平均直径为11-13nm，优选地11、12或13nm，进一步优选地12nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，至少90％，优选地至少95％的所述聚集的寡核苷酸的直径为10.8nm到13.2nm，其中所述直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，至少65％，优选地至少70％的所述聚集的寡核苷酸的直径为11.4nm到12.6nm，其中所述直径通过动态光散射(DLS)确定。

在所述核苷酸组合物的另一优选的实施例中，至少90％，优选地至少95％的所述聚集的寡核苷酸的直径为12nm±10％，即直径为10.8nm到13.2nm，其中所述直径通过动态光散射(DLS)确定。

在所述核苷酸组合物的另一优选的实施例中，其中至少65％，优选地至少70％的所述聚集的寡核苷酸的直径为12nm±5％，即直径为11.4nm到12.6nm，其中所述直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸具有核酸序列G10GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:1)。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸具有核酸序列G10GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:1)，并且其中所述聚集的寡核苷酸仅仅由磷酸二酯连接的脱氧核苷酸组成。

在再另一方面中，本发明提供包含聚集的寡核苷酸的核苷酸组合物，其中所述聚集的寡核苷酸的平均直径为7-14nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸的平均直径为8-14nm，优选地9-14nm，进一步优选地10-14nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸的平均直径为11-13nm，优选地11、12或13nm，进一步优选地12nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，其中至少90％，优选地至少95％的所述聚集的寡核苷酸的直径为10.8nm到13.2nm，其中所述直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，其中至少65％，优选地至少70％的所述聚集的寡核苷酸的直径为11.4nm到12.6nm，其中所述直径通过动态光散射(DLS)确定。

在所述核苷酸组合物的另一优选的实施例中，至少90％，优选地至少95％的所述聚集的寡核苷酸的直径为12nm±10％，即直径为10.8nm到13.2nm，其中所述直径通过动态光散射(DLS)确定。

在所述核苷酸组合物的另一优选的实施例中，其中至少65％，优选地至少70％的所述聚集的寡核苷酸的直径为12nm±5％，即直径为11.4nm到12.6nm，其中所述直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸具有核酸序列G10GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:1)。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸具有核酸序列G10GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:1)，并且其中所述聚集的寡核苷酸仅仅由磷酸二酯连接的脱氧核苷酸组成。

在另一方面，本发明提供用于生产包含以下的组合物的方法：(i)病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒为RNA噬菌体的病毒样颗粒，和(ii)聚集的寡核苷酸，其中所述聚集的寡核苷酸包装到所述病毒样颗粒中，所述方法包含以下步骤：(a)产生混合物，其中所述混合物包含：(i)所述RNA噬菌体的外壳蛋白；(ii)能够防止所述外壳蛋白自组装的试剂；和(iii)聚集的寡核苷酸，其中所述聚集的寡核苷酸包含包含至少一个聚G段的寡核苷酸，并且其中所述聚集的寡核苷酸的平均直径为6-16nm，其中优选地所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定；(b)从所述混合物去除所述试剂；和(c)使所述外壳蛋白自组装到病毒样颗粒中和包装所述聚集寡核苷酸。

在再另一方面中，本发明提供用于生产包含以下的组合物的方法：(i)病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒为RNA噬菌体的病毒样颗粒，和(ii)聚集的寡核苷酸，其中所述聚集的寡核苷酸包装到所述病毒样颗粒中，所述方法包含以下步骤：(a)产生混合物，其中所述混合物包含：(i)所述RNA噬菌体的外壳蛋白；(ii)能够防止所述外壳蛋白自组装的试剂；和(iii)聚集的寡核苷酸，其中所述聚集的寡核苷酸包含包含至少一个聚G段的寡核苷酸，并且其中所述聚集的寡核苷酸通过根据本发明的第一方面的方法可获得，并且其中所述聚集的寡核苷酸的平均直径为6-16nm，其中优选地所述平均直径通过动态光散射DLS)确定；(b)从所述混合物去除所述试剂；和(c)使所述外壳蛋白自组装到病毒样颗粒中并且包装所述聚集的寡核苷酸。

在再另一方面中，本发明提供用于生产包含以下的组合物：(i)病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒为RNA噬菌体的病毒样颗粒，和(ii)聚集的寡核苷酸，其中所述聚集的寡核苷酸包装到所述病毒样颗粒中，所述方法包含以下步骤：(a)产生混合物，其中所述混合物包含：(i)所述RNA噬菌体的外壳蛋白；(ii)能够防止所述外壳蛋白自组装的试剂；和(iii)核苷酸组合物，其中所述核苷酸组合物通过根据本发明用于生产包含聚集的寡核苷酸的核苷酸组合物的方法可获得，并且其中所述核苷酸组合物包含所述聚集的寡核苷酸，其中所述聚集的寡核苷酸包含包含至少一个聚G段的寡核苷酸，并且其中所述聚集的寡核苷酸的平均直径为6-16nm，其中优选地所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定；(b)从所述混合物去除所述试剂；和(c)使所述外壳蛋白自组装到病毒样颗粒中并且包装所述聚集的寡核苷酸。

在所述方法期间，所述病毒样颗粒在存在所述聚集寡核苷酸的情况下通过所述RNA噬菌体的外壳蛋白的自组装形成。

在优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸的平均直径为8-14nm，优选地9-14nm，进一步优选地10-14nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸的平均直径为11-13nm，优选地11、12或13nm，进一步优选地12nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，所述外壳蛋白包含能够自组装的RNA噬菌体的重组蛋白或其片段。

在另一优选的实施例中，所述外壳蛋白由能够自组装的RNA噬菌体的重组蛋白或其片段组成。

在另一优选的实施例中，所述RNA噬菌体选自由以下组成的组：

(a)噬菌体Qβ；

(b)噬菌体R17；

(c)噬菌体fr；

(d)噬菌体GA；

(d)噬菌体SP；

(e)噬菌体MS2；

(f)噬菌体M11；

(g)噬菌体MX1；

(h)噬菌体NL95；

(i)噬菌体f2；

(j)噬菌体PP7；和

(k)噬菌体AP205。

在另一优选的实施例中，所述RNA噬菌体为Qβ。

在另一优选的实施例中，所述外壳蛋白包含选自由以下组成的组的序列：

(a)SEQ ID NO:10(QβCP)；

(b)SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的混合物(QβA1蛋白)；

(c)SEQ ID NO:12(R17外壳蛋白)；

(d)SEQ ID NO:13(fr外壳蛋白)；

(e)SEQ ID NO:14(GA外壳蛋白)；

(f)SEQ ID NO:15(SP外壳蛋白)；

(g)SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的混合物；

(h)SEQ ID NO:17(MS2外壳蛋白)；

(i)SEQ ID NO:18(M11外壳蛋白)；

(j)SEQ ID NO:19(MXI外壳蛋白)；

(k)SEQ ID NO:20(NL95外壳蛋白)；

(1)SEQ ID NO:21(f2外壳蛋白)；

(m)SEQ ID NO:22(PP7外壳蛋白)；和

(n)SEQ ID NO:23(AP205外壳蛋白)。

在另一优选的实施例中，所述外壳蛋白包含SEQ ID NO:10(QβCP)的序列。

在另一优选的实施例中，所述外壳蛋白包含SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的混合物(QβA1蛋白)。

在另一优选的实施例中，所述外壳蛋白由SEQ ID NO:10(QβCP)的序列组成。

在另一优选的实施例中，所述外壳蛋白由SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的混合物(QβA1蛋白)组成。

在另一优选的实施例中，在所述混合物中所述外壳蛋白的浓度为1到4mg/ml，优选地2.5mg/ml。

在另一优选的实施例中，在所述混合物中所述聚集的寡核苷酸的浓度为25到100μM，优选地62.5μM。

在另一优选的实施例中，在所述混合物中所述聚集的寡核苷酸和所述外壳蛋白的所述摩尔比为0.5到1.2，优选地0.7。

在另一优选的实施例中，所述试剂包含选自脲和盐酸胍的变性化合物。

在另一优选的实施例中，所述试剂包含变性化合物，其中所述变性化合物为脲，并且其中优选地在所述混合物中所述脲的浓度为0.25到7.2M，优选地1M。

在另一优选的实施例中，所述试剂另外包含还原剂。

在另一优选的实施例中，所述还原剂为DTT，其中优选地在所述混合物中所述DTT的浓度为1到25mM，优选地2.5mM。

在另一优选的实施例中，通过第一缓冲液与第一缓冲液交换来执行所述从所述混合物去除所述试剂，其中所述第一缓冲液包含氯化钠，并且其中优选地在所述第一缓冲液中所述氯化钠的浓度为50到350mM，优选地250mM。

在另一优选的实施例中，所述第一缓冲液交换跨隔膜执行，其中所述隔膜的截断分子量为1到50kD，优选地5到30kD，最优选地30kD。

在另一优选的实施例中，所述方法另外包含使所述病毒样颗粒与氧化剂接触的步骤，其中优选地所述氧化剂选自由以下组成的组：

(a)过氧化氢，其中优选地所述过氧化氢的浓度为0.25-50mM，优选地2mM；

(b)氧气；

(c)谷胱甘肽；

(d)Cu

(e)Fe

在另一优选的实施例中，作为氧化剂的所述氧气可为无菌过滤的空气，通常并且优选地无菌过滤的环境空气。

在另一优选的实施例中，所述方法另外包含纯化所述病毒样颗粒的步骤，并且其中所述纯化包含第二缓冲液与第二缓冲液交换，其中所述第二缓冲液为药学上可接受的缓冲液。

在另一优选的实施例中，所述第二缓冲液交换使用隔膜执行，其中所述隔膜的截断分子量为50到1000kD。

在另一优选的实施例中，所述第二缓冲液交换使用隔膜执行，其中所述隔膜的截断分子量为100到300kD。

在另一优选的实施例中，所述组合物的所述纯度为至少99.5％，优选地至少99.6％，更优选地至少99.7％，又更优选地至少99.8％，并且最优选地至少99.9％，如通过尺寸排阻色谱法确定。

在再另一方面中，本发明提供包含(i)RNA噬菌体的病毒样颗粒和(ii)聚集的寡核苷酸的组合物，其中所述聚集的寡核苷酸包装到所述病毒样颗粒中，其中所述组合物通过根据本发明用于生产包含以下的组合物的方法可获得：(i)病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒为RNA噬菌体的病毒样颗粒，和(ii)聚集的寡核苷酸。

在再另一方面中，本发明提供包含(i)RNA噬菌体的病毒样颗粒和(ii)聚集的寡核苷酸的组合物，其中所述聚集的寡核苷酸包装到所述病毒样颗粒中，其中所述聚集的寡核苷酸的平均直径为6-16nm，优选地7-14nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，所述RNA噬菌体为噬菌体Qβ。

在另一优选的实施例中，RNA噬菌体Qβ的所述病毒样颗粒由包含SEQ ID NO:10(QβCP)的序列的外壳蛋白组成。

在另一优选的实施例中，RNA噬菌体Qβ的所述病毒样颗粒由包含SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的混合物(QβA1蛋白)的外壳蛋白组成。

在另一优选的实施例中，RNA噬菌体Qβ的所述病毒样颗粒由SEQ ID NO:10(QβCP)的序列组成的外壳蛋白组成。

在另一优选的实施例中，RNA噬菌体Qβ的所述病毒样颗粒由SEQ ID NO:10和SEQID NO:11的混合物(QβA1蛋白)组成的外壳蛋白组成。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸具有核酸序列G10GGGGGGGGGGGACGATCGTC GGGGGGGGGG(SEQ ID NO:1)。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸具有核酸序列G10GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:1)，并且其中所述聚集的寡核苷酸仅仅由磷酸二酯连接的脱氧核苷酸组成。

在另一优选的实施例中，所述组合物的纯度为至少99.5％，优选地至少99.6％，更优选地至少99.7％，又更优选地至少99.8％，并且最优选地至少99.9％，如通过尺寸排阻色谱法确定。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸的平均直径为6-16，优选地7-14nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸的平均直径为8-14nm，优选地9-14nm，进一步优选地10-14nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，所述聚集的寡核苷酸的平均直径为11-13nm，优选地11、12或13nm，进一步优选地12nm，其中所述平均直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，其中至少90％，优选地至少95％的所述聚集的寡核苷酸的直径为10.8nm到13.2nm，其中所述直径通过动态光散射(DLS)确定。

在另一优选的实施例中，其中至少65％，优选地至少70％的所述聚集的寡核苷酸的直径为11.4nm到12.6nm，其中所述直径通过动态光散射(DLS)确定。

在所述组合物的另一优选的实施例中，至少90％，优选地至少95％的所述聚集的寡核苷酸的直径为12nm±10％，即直径为10.8nm到13.2nm，其中所述直径通过动态光散射(DLS)确定。

在所述组合物的另一优选的实施例中，其中至少65％，优选地至少70％的所述聚集的寡核苷酸的直径为12nm±5％，即直径为11.4nm到12.6nm，其中所述直径通过动态光散射(DLS)确定。

实例

实例旨在说明本发明而不是限制本发明。在下文描述的实例中，除非另有指示，否则所有温度均以摄氏度(℃)阐述。试剂购自商业供应商，如西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)、Boston Bioproducts、英杰(Invitrogen)、阿法埃莎(Alfa Aesar)等，并且除非另有指示，否则所述试剂无需进一步纯化即使用。在描述的反应中使用的水已被纯化或处理以去除所有污染物和盐。通过测量水的电导率可确认无机离子杂质的去除。在本申请中使用的水在25℃下的电阻率通常并且优选地为至少18MΩ·cm。这确保残余无机杂质(如盐)小于1ppb。

寡核苷酸，特别是SEQ ID NO:1的寡核苷酸G10的纯度通过离子对、反相高效液相色谱(IP-RP-HPLC)或通过阴离子交换-高效液相色谱法(IEX-HPLC)确定。

IP-RP-HPLC使用Waters Xbridge BEH C18 4.6×75mm，2.5μm柱，在柱温为70±2℃，流动速率为0.4mL/min，波长为260nm，注射体积为5μL并且运行时间为40分钟下实现。

IEX-HPLC使用Dionex DNAPac PA200 4.0×250mm零件号063000柱在柱温30±2℃，流动速率为1.0mL/min，波长260nm，注射体积为20μL并且运行时间为45分钟下实现。

IP-RP-HPL.C//G10：将样品注射在寡核苷酸离子对柱上并且使用以TEA和HFIP修饰的组合的水乙腈梯度作为离子对缓冲液进行洗脱，其中在260nm处检测。所得寡核苷酸G10峰与由寡核苷酸G10亚群(如G10+1n、G10-1n、G10-2n、G10-3n、>G10+1n和

IEX-HPLC//G10：将样品注射在强阴离子交换柱上，并且在变性条件下分析(pH≥10)。使用组合的盐和甲醇梯度进行洗脱，其中在260nm处检测。所得寡核苷酸G10峰与由寡核苷酸G10亚群(如G10+1n、G10-1n、G10-2n、G10-3n、>G10+1n和

实例1

寡核苷酸G10(SEQ ID NO:1)的变性和聚集

图1A示出用本发明方法获得变性的高纯度G10寡核苷酸的DLS呈单峰。G10寡核苷酸的测量的平均直径为0.90nm指示变性完成并且已经获得单体。如下文所概述，根据本发明，此完全变性的G10寡核苷酸确保并允许形成在期望范围内的良好控制和所定义的聚集的G10寡核苷酸。

最终过滤步骤可用于去除最终痕量(<1％)的大颗粒。这通过使先前冷却的室温的聚集的寡核苷酸溶液通过50nm过滤器来执行。

图1B示出以本发明方法获得的随后聚集的G10寡核苷酸的DLS。获得的非常优选的聚集的G10寡核苷酸示出适当的聚集并且平均直径为12nm。根据本发明，在期望的优选范围内的这些良好控制和定义的聚集的G10寡核苷酸将产生非常高纯度的包装和良好形成的VLP，如下文所概述。

在不同的寡核苷酸浓度下进一步进行非常优选的寡核苷酸G10(SEQ ID NO：1)的变性和聚集，其中获得与在图1A和图1B所描绘的基本相同的DLS。因此，使用在100μm和1mM之间的各种浓度的寡核苷酸G10实现变性。为了方便起见，由于如本文所描述的两种溶液的1:1混合，因此随后的聚集步骤通过用于变性的浓度的正好一半实现。

实例2

寡核苷酸G10-11、G12-11、G6、G7、G8、G9、G11、G6-10、G7-10、G8-10和G9-10(SEQ IDNO:3-9、24-27)的变性和聚集

通过如在实例3中所描述的动态光散射(DLS)和通过如在实例4中所描述的尺寸排阻HPLC分析聚集方法的产物。聚集的寡核苷酸的DLS显示所有聚集的寡核苷酸的平均直径在11-13nm之间，如通过动态光散射(DLS)确定，并且所有在80％-110％PST内，如通过尺寸排阻HPLC确定。

实例3

通过动态光散射分析寡核苷酸G10的聚集

使用动态光散射(DLS)确定根据本发明的寡核苷酸、聚集的寡核苷酸和用聚集的寡核苷酸包装的VLP的粒径。下文提供用于本实例的并且优选地用于确定根据本发明的寡核苷酸、聚集的寡核苷酸和用聚集的寡核苷酸包装的VLP的粒径的仪器设置。

仪器：Malvern Zetasizer Nano ZS

光源：He-Ne激光(在4mW下(最大)633nm)

表1的中间列代表应用于参考标准品(聚苯乙烯微球)的设置，以及用于确认仪器运行正常的校准设置。右列表示应用于用于我们的寡核苷酸、聚集的寡核苷酸和用聚集的寡核苷酸包装的VLP的分析和测量的方法设置。

表1：用于标准品和本发明组合物的仪器设置

DLS软件计算平均流体动力学半径，并且通过基本乘法确定颗粒的平均直径。2×颗粒平均半径＝颗粒直径。为了一致性，此后将报告粒径并且贯穿本发明将其用作平均直径，以纳米为单位(D

实例4

通过尺寸排阻HPLC分析寡核苷酸G10的聚集

主要如在WO 2007/144150中所描述使用以下条件通过分析尺寸排阻HPLC分析聚集的G10寡核苷酸的聚集状态：

柱：TSKgel 5000PWXL 7.8mm*30.0cm(批号：5PWX06GNMH3304，领域：08023，东曹生命科学)

洗脱液：PBS(于20mM磷酸钠缓冲液中150mM NaCl，pH 7.2)

注射体积：40.0μl(优选地包含约20μM到约500μM的浓度)

流动速率：0.8ml/min

梯度：等度

运行时间：20min

波长：215、260和280nm，在260nm处的数据评估

柱烘箱温度：25℃

自动进样器温度：8℃

噬菌体的衣壳用作标准品。

计算如下G10相对于Qβ衣壳的峰开始时间X％(相对峰开始时间Qβ)：X％＝寡核苷酸的峰开始时间[min]除以Qβ衣壳标准品的滞留时间[min]×100％，其中寡核苷酸的峰开始时间确定为当寡核苷酸的洗脱变成可检测时的时间，并且其中Qβ衣壳标准品的滞留时间确定为发生标准品的最大峰的时间。在WO2007/144150的图1中描绘寡核苷酸G10和作为标准品的噬菌体Qβ的衣壳的洗脱曲线的实例。基于在WO2007/144150的图1中描绘的色谱图，针对聚集的寡核苷酸计算出88％的相对峰开始时间。

实例5

通过本发明方法和通过现有技术方法获得的变性的寡核苷酸G10的比较

具有两种两个不同纯度(79％和94％，如通过反相HPLC和阴离子交换HPLC确定；在此实例部分中被称作低和高纯度G10寡核苷酸)的SEQ ID NO:1的寡核苷酸G10各自经进行如在现有技术(WO2007/144150)中所描述的解聚集(变性)。相同的高纯度(94％)寡核苷酸G10经进行如在本文实例1中所描述的变性。使用的寡核苷酸G10的杂质主要是“失败序列”，意指具有较低数量的G残基的寡核苷酸序列，即26聚体、27聚体、28聚体和29聚体。

通过如在实例3中所描述DLS分析所得产物并且在图2A(低纯度G10，现有技术方法)和图2B(高纯度G10，现有技术方法)和图2C(高纯度G10，本发明方法)中示出。完全变性的寡核苷酸G10单体的流体动力学平均直径约为1nm。

经进行现有技术方法变性的低纯度G10产生平均直径为2.2nm的颗粒，指示存在二级结构，并且不是所有寡核苷酸G10已完全变性成单体(图2A)。经进行现有技术方法变性的高纯度G10产生平均直径为2.8nm的颗粒，指示存在二级结构，并且不是所有的寡核苷酸G10已完全变性成单体(图2B)。如将在实例6中讨论，此不完全变性将导致更多的变化，并且进一步导致更大的聚集的寡核苷酸。

经进行本发明方法的变性的高纯度G10产生平均直径为0.9nm的颗粒，指示寡核苷酸G10已完全或基本上完全变性成单体(图2C)。如所指示，根据本发明，此完全变性的G10寡核苷酸确保并允许形成在期望范围内的良好控制和所定义的聚集的G10寡核苷酸。

高度优选且重要的是，如对于非常优选的寡核苷酸G10所示的寡核苷酸的适当变性，导致在开始聚集步骤之前完全或至少几乎完全变性成单体。如果二级结构存在寡核苷酸的二聚体、三聚体或四链体，那么聚集步骤将更可变，并且最终聚集的寡核苷酸将较大并且具有更宽的尺寸分布。

实例6

通过本发明方法和通过现有技术方法获得的聚集的寡核苷酸G10的比较

从如在实例5中所描述的变性实验获得的G10材料如在现有技术(WO2007/144150)中所描述，或如通过本发明方法所描述，并且以此如在上文实例1中所描述进行聚集。

通过如在本文实例3中所描述的DLS分析所得聚集的寡核苷酸并且在图3A(通过现有技术方法变性的低纯度G10的现有技术聚集)和图3B(通过现有技术方法变性的高纯度G10的现有技术聚集和图3C(通过本发明方法变性的高纯度G10的本发明聚集)中示出。

用现有技术方法变性和聚集的低纯度材料产生聚集的寡核苷酸，其不仅在期望平均直径范围(6-16nm)的高侧，而且此外，对于后续适当包装到RNA噬菌体，优选地RNA噬菌体Qβ的VLP中，10％的材料太大(30-40nm)(图3A)。由于此较大和宽的颗粒分布，最终包装的VLP将通过SEC和DLS纯度将降低，并且在电子显微照片中观察到棒状结构(参见下文实例8)。必须指出的是，所述棒状结构通常不能经由过滤纯化来分离，而是需要经由色谱法进行更昂贵和更严格的纯化，这对于大规模生产，特别是对于GMP生产非常不利。

用现有技术方法变性和聚集的高纯度材料产生聚集的寡核苷酸，其对于包装到RNA噬菌体，优选地RNA噬菌体Qβ的VLP中均太大，并且，因此将导致不稳定的VLP(图3B)。此外，识别在～100nm处的第二峰。值得注意的是，由于然后需要加热和冷却时间将比在实验室或制造规模下容易控制的时间短的事实，因此不执行通过减少聚集时间来对使用高纯度材料的现有工艺的优化。实际上，本发明方法能够克服现有技术方法的所述缺点。

因此，与之相反，用本发明的方法变性和聚集的高纯度材料产生平均直径为12nm的聚集的寡核苷酸，指示适当聚集(图3B)。根据本发明，在期望的非常优选范围内的此良好控制和定义的聚集的G10寡核苷酸将产生非常高纯度和良好形成的包装的VLP。

进一步非常优选并且重要的是，寡核苷酸的适当聚集，如对于非常优选的寡核苷酸G10所示，导致完全或至少几乎完全，狭窄定义的直径尺寸分布。控制聚集导致聚集的寡核苷酸的平均直径为11-13nm，优选地平均直径为12nm，如通过如在实例3中所描述DLS确定，确保并且允许实现高纯度包装的VLP。

如果聚集的寡核苷酸太大，那么在包装步骤后所得的材料将具有大的杂质，如在DLS中所示，以及畸形的VLP(如棒状结构)，如在电子显微照片所示。如果聚集的寡核苷酸非常大>50nm，那么可产生不稳定的VLP。

实例7

通过拆卸/重组用聚集的寡核苷酸G10包装QβVLP

以替代和优选的方式，通过将1M DTT添加到终浓度10mM DTT将Qbeta衣壳拆卸成Qbeta二聚体。通过添加1M磷酸钠、0.75M柠檬酸来将NaCl浓度提高到600mm并且将pH调节到pH 2.6使核酸和宿主细胞蛋白沉淀。使用装配有2×0.5m

以替代和优选的方式，

表2：阳离子交换色谱法方法

执行通过Mustang Q胶囊过滤以减少内毒素和任何残余核酸。CEX合并物最初使用0.2μm Millipak 60过滤器(Cat.号MPGL06GH2)过滤，然后以200ml/min的流动速率通过Mustang Q过滤器过滤。然后将从Mustang Q过滤器收集的流动通过第二0.2μm Millipak60过滤器。

替代地，用如通过本发明获得的聚集的寡核苷酸G10的QβVLP包装还可另外如在WO2007/144150的实例10中所描述实现。

实例8

用如通过本发明和通过现有技术方法获得的聚集的寡核苷酸G10包装的QβVLP的比较-DLS和EM

类似于上文所描述的实例7制备QβVLP，不仅使用如在实例1中制备的所描述聚集的G10寡核苷酸，而且另外使用通过如在上文实例6中所描述的现有技术方法制备的聚集的G10寡核苷酸。

在图3A中示出的聚集的寡核苷酸，其通过现有技术方法变性的低纯度G10的现有技术聚集获得，并且具有宽的尺寸分布，其中10％对于包装太大，当进行包装步骤时，产生具有如在图5A所示的DLS和如在图5B中所示的EM的VLP。DLS显示对应于恰当形成的VLP的平均直径为28nm的主峰(96％)(30nm±2nm)，但是也观察到额外的大颗粒峰。相应EM示出具有所述平均直径的球形VLP，并且还示出比期望30nm VLP大得多的棒状结构。

相反，用本发明的方法变性和聚集的高纯度材料当进行包装步骤时产生一个平均直径的包装的VLP并且仅形成VLP。DLS示出在30nm处的一个单峰并且没有大颗粒(图5C)，并且EM示出全部为球形VLP，没有棒状结构(图5D)。

实例9

用变化的参数实现的本发明方法的变性步骤

通过改变脲的浓度、变性时间和应用于所述变性的温度来研究如在实例1中所描述的寡核苷酸G10(SEQ ID NO:1)的变性。通过将G10(94％的高纯度)溶解在水中到1mM的浓度获得本体寡核苷酸G10溶液。添加脲溶液以获得其中脲浓度为0.1M到1M的500μM G10的最终变性溶液。然后将这些样品的等分试样在25℃和85℃之间的温度范围内温育20或60分钟。将样品在冰/水浴中立即冷却到0℃，从冰浴取出，并且使其自然升温到室温，并且进行如在实例3中所描述的DLS测量。表3示成功变性，即平均直径为1nm或更小，不管脲浓度为0.2M到1.0M，都可获得成功变性。

表3：脲浓度和温度对G10寡核苷酸变性的影响