一种三维动态培养的类结直肠组织肿瘤芯片及其应用

技术领域

本发明涉及微流控芯片技术领域，特别涉及一种类结直肠肿瘤组织培养和抑杀技术。

背景技术

据世界卫生组织国际癌症研究机构(International Agency for Research onCancer，IARC)统计，到2022年预计癌症新发病例达2,110万，死亡病例达1160 万。由此可见，恶性肿瘤一直是导致全球居民死亡的主要原因。而且，随着对肿瘤研究的不断深入，学者们发现在肿瘤的诊断和治疗过程中存在很大的局限性。例如，肿瘤的发病机制异常的复杂，高危因素难控制等原因导致肿瘤预防难；有效筛查技术少、早期诊断技术水平低等因素导致肿瘤发现时普遍偏晚；肿瘤异质性导致的肿瘤治疗效果差、复发转移率高、精准性差等导致肿瘤治疗难度大。尤其是，目前肿瘤药物的研发周期长，导致药物上市非常慢。并且，动物实验不能完全真实的模拟人体器官真实反映状态，加之缺乏有效的新的治疗途径，造成肿瘤的治疗困难重重。

“器官芯片”技术，将组织工程，微流控技术和仿生原理集成为一体，是在微流体装置中通过连续灌注的方式3D培养活细胞，目的是模拟体内脏器或组织的生理功能，但是研究目标不是建立一个完整的体外活体器官，而是综合最小的功能单位，在体外重塑组织或器官的功能。“器官芯片”系统可以给细胞生长提供体内的物理环境，包括生理水平相关的流体剪切力，循环应变和机械压缩等，能准确地模拟细胞微环境，它们更加真实的代表了细胞和器官，并且在考虑剪切应力的同时保持了生理液体，能够控制流体流动，从而增强许多细胞类型的分化，功能和长期存活。相较于常规细胞培养技术而言，器官芯片技术能更真实的反映人体情况，在新药筛选方面也比动物实验更特异、更有效，因此有希望部分替代试验周期较长的动物实验。器官芯片技术，在新药研发、干细胞研究、组织器官发育和毒理学预测等领域具有重要的应用前景，尤其在肿瘤药物筛查、药物递送等研究领域具有良好临床转化价值。

基于上述这些原因，当前亟待解决的关键问题是建立一种体外微环境，模拟实体瘤状态，并进行肿瘤细胞的杀伤研究，以期更好地推动临床肿瘤免疫治疗的发展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对背景技术中存在的问题，提供一种三维动态培养的类结直肠组织肿瘤芯片构建及其应用。一方面，本发明可以提供一种类结直肠肿瘤类器官的培养和药物实验的微流控系统及使用方法，以解决现有的微流控芯片应用在细胞培养中，不能模拟在体内的供血环境中的连续自然流动的药物递送条件，缺乏对培养器官所处的液体环境进行实时地、持续地调节从而观测器官相关响应的能力的问题；另一方面，该研究可有效降低动物实验带来的周期长、稳定性差的问题出现的可能性。

为实现本发明的上述目的，本发明首先提供一种三维动态培养的类结直肠组织肿瘤芯片，包括培养液灌注腔室和类结直肠肿瘤组织培养腔室，所述培养液灌注腔室设置在类结直肠肿瘤组织腔室上游，所述培养液灌注腔室的上游设有至少一个进液口，所述类结直肠肿瘤组织腔室的下游设有至少一个排液口。

进一步地，所述芯片包括顶板、底板和中间板，所述中间板固定在所述底板上，所述顶板可滑动地连接在所述中间板和底板的组合体上。

进一步地，所述顶板上设有与所述类结直肠肿瘤组织腔室一一对应的开孔。

进一步地，所述培养液灌注腔室呈类结直肠状布置；所述培养液灌注腔室包括至少两组，每组灌注腔室包括至少一道类结直肠状的灌注通道，所述培养液灌注腔室从上游至下游灌注通道逐渐增多。

进一步地，所述培养液灌注腔室设置在所述中间板上；所述类结直肠肿瘤组织腔室包括位于上部的培养液流通腔室和位于下部的培养腔室，所述培养液流通腔室设置在所述中间板上，所述培养液流通腔室和所述培养液灌注腔室连通，所述培养液流通腔室贯穿所述中间板，所述培养液流通腔室的下方设有PET膜，所述PET膜的形状与所述培养液流通腔室的截面形状一致；所述类结直肠肿瘤组织腔室包括多个，多个腔室分组设置，每组腔室分别连接一道培养液灌注腔室中的灌注通道。

进一步地，所述类结直肠肿瘤组织腔室包括孔状腔室和条状腔室，所述孔状腔室在所述中间板上按组均布，所述条状腔室连接相邻的孔状腔室，相邻的组别中对齐的孔状腔室之间设有微柱。

进一步地，所述类结直肠肿瘤组织腔室的底部设有温敏性水凝胶复合材料，所述温敏性水凝胶复合材料设置在底板上。

本发明还提供一种上述类结直肠组织肿瘤芯片的应用，在该芯片中，所述的HTC116细胞、SW480细胞、SW48细胞、HCT-8细胞、HCT-8/VCR、caco-2细胞、HT-29细胞、HRT-18细胞、LoVo细胞、SW620细胞、CMT93细胞中的一种、两种或多种与一定浓度的水凝胶混合培养形成类肿瘤组织，所述水凝胶硬度含量为30-60％。在本发明中的类结直肠组织主要是指模拟结肠组织处的肿瘤细胞组织的类肿瘤组织。

上述类结直肠组织肿瘤芯片还可以用于进行肿瘤细胞的抑杀实验，其中所述的抑杀实验可用抗癌药物或小分子制剂等。

本发明的有益效果是：本发明用于构建的结直肠癌肿瘤芯片，可模拟在体内的供血环境中的连续自然流动的药物及小分子制剂递送条件，对模拟仿生的肿瘤微环境进行实时地观察和药物筛选；另一方面，该研究可有效解决并替代动物实验降低动物实验带来的周期长的问题。对于结直肠癌的临床治疗、早期预防干预均有重要的意义。

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的芯片的爆炸图。

图2是本发明的中间板的主视图。

图3是图2中的A部位放大图。

图4是本发明中类结直肠肿瘤组织腔室部分的剖视图。

图5是2D条件下结直肠癌细胞生长细胞活性观察。

图6是3D条件下结直肠癌细胞生长细胞活性观察。

图中标号：培养液灌注腔室1，类结直肠肿瘤组织腔室2，进液口3，排液口4，灌注通道5，顶板6，底板7，中间板8，乳胶管9，培养液流通腔室10，培养腔室11，圆孔12，连接通道13，PET膜14，开孔15，滑轨16，微柱17，温敏性水凝胶复合材料18。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种可以进行三维动态培养的类结肠组织肿瘤芯片的构建及其应用。

(1)芯片的设计和制作。

如图1所示，芯片的具体结构包括培养液灌注腔室1和类结直肠肿瘤组织培养腔室2，所述培养液灌注腔室1设置在类结直肠肿瘤组织腔室2上游，所述培养液灌注腔室1的上游设有至少一个进液口3，在本实施例中，进液口3有三个，分别连接培养液灌注腔室1，所述类结直肠肿瘤组织腔室2的下游设有至少一个排液口4，在本发明中，培养液灌注腔室1和类结直肠肿瘤组织腔室2均为多个。所述培养液灌注腔室1呈类结直肠状布置，从而可以更好地将形态和动态结合起来模拟直肠环境。所述培养液灌注腔室1包括至少两组，在本实施例中，所述培养液灌注腔室1包括三组，三组培养液灌注腔室1从上游向下游依次布置，每组灌注腔室包括至少一道类结直肠状的灌注通道5，所述培养液灌注腔室1从上游至下游灌注通道5逐渐增多，例如，在本实施例中，最上游的一组培养液灌注腔室1包括4根灌注通道5，中间的一组培养液灌注腔室1包括5根灌注通道5，最下游(也即最接近类结直肠肿瘤组织腔室2)的一组培养液灌注腔室1包括6 根灌注通道5，这种布置方式一方面可以让培养液的流通更为均匀，另一方面可以更好地模拟液体在直肠内的流通环境。

本发明的肿瘤芯片包括顶板6、底板7和中间板8，所述中间板固定在所述底板上，所述顶板6可滑动地连接在所述中间板8和底板7的组合体上，实际制作中，本实施例中，可以选用厚度分别为2mm，1.5mm和2mm的透明PMMA 板，分别作为顶板6、中间板8和底板7，顶层PMMA板的一端切割3个直径 1.8mm的圆孔，作为进液孔(对应进液口3)，另一端切割1个直径为1.8mm的圆孔，作为出液孔(对应排液口4)，进液孔和出液孔均连接乳胶管9。

如图1所示，所述顶板上设有与所述类结直肠肿瘤组织腔室2一一对应的开孔15，所述底板7的两侧设有滑轨16，所述顶板6可以沿所述滑轨16滑动，从而使开孔15和类结直肠肿瘤组织腔室2对应或闭合所述类结直肠肿瘤组织腔室 2，在加药状态时可以滑动盖子露出腔室。

所述培养液灌注腔室1设置在所述中间板8上；如图3所示，所述类结直肠肿瘤组织腔室2包括位于上部的培养液流通腔室10和位于下部的培养腔室11，所述培养液流通腔室10设置在所述中间板8上，所述培养液流通腔室10和所述培养液灌注腔室1连通，所述培养液流通腔室10贯穿所述中间板8。

如图2所示，具体制作的时候，在中间板8上切割多个直径为1.8～2.5mm的圆孔12(即孔状腔室)，多个圆孔分列布置，且各列中的圆孔对齐排列，列的数量与最下游的灌注通道5的数量相同，例如，本实施例中，培养液流通腔室 10就包括6列圆孔，每一列圆孔中最上游的圆孔和所对应的灌注通道5连通，相邻的列中对齐的孔状腔室之间设有微柱17，在本发明中，微柱为4根一组。

如图1所示，相邻圆孔之间通过连接通道13(即条状腔室)连通培养液流通腔室10的下方设有PET膜14，PET膜14的形状与所述培养液流通腔室的横向截面形状一致，可以刚好将类结直肠肿瘤组织腔室2上部的培养液流通腔室 10和下部的培养腔室11隔开，通过PET膜14可以渗滤流通和培养过程中的杂质，将不需要的物质留在培养液流通腔室10，而不进入到培养腔室11内。

如图3所示，所述类结直肠肿瘤组织腔室2的底部(底板7内)设有用于培养的温敏性水凝胶复合材料18。

在所有的PMMA板都切割完毕之后连同液体导管(乳胶管)等都浸泡于75％无水乙醇中灭菌30min，自然干燥后每一层PMMA板通过等离子除尘处理后热压固定。中间板8和底板7之间通过胶粘的方式固定连接。

(2)肿瘤细胞的三维培养

将混有一定浓度比例的结直肠癌细胞株-GelMA水凝胶混合液，通过微流注射泵于顶板的其中一个进液口3处，推进至类结直肠肿瘤组织腔室2，待注满类结直肠肿瘤组织腔室的时候停止混悬液的注入，利用便携式紫外照射笔避光条件下对混悬液进行光固化处理30S，待水凝胶凝固后，用灭菌胶头堵塞该进液口3。然后用蠕动泵通过外接软管到另一个进液孔3中，将细胞培养液推送至培养液灌注腔室1，将芯片置于37℃恒温培养箱内培养，二氧化碳浓度为5％。

(3)肿瘤细胞的抑杀效果研究

将一定浓度的分离自自然杀伤细胞的外泌体，所述肿瘤细胞包括结直肠癌细胞中的HTC116细胞、SW480细胞、SW48细胞、HCT-8细胞、HCT-8/VCR、 caco-2细胞、HT-29细胞、HRT-18细胞、LoVo细胞、SW620细胞、CMT93细胞等一种或多种。所述的外泌体浓度可以为0ng/μL-80ng/μL。按照5μg/μL、10 μg/μL、20μg/μL和40μg/μL的浓度添加到培养体系内，然后分别在4、8、12、 24和48小时内测量细胞的活性。同时，分别观察在利用2D培养和3D培养的条件下，NK细胞外泌体对癌细胞的抑杀效果对照。

在添加了NK细胞外泌体以后，共培养24h显现出不同的细胞活力，具体详见图5和6。我们用CCK-8检测细胞在添加不同NK细胞外泌体含量比例中的状态，用OD高低代表细胞状态，越高说明存活细胞多。

研究结果证实，无论是在2D条件下，还是3D“肿瘤”芯片里，NK细胞外泌体对结直肠癌细胞都有杀伤效果。相比于2D环境，在3D动态环境中NK细胞外泌体对肿瘤细胞的杀伤效果更加的明显。该结果一方面提示，NK细胞外泌体具有和NK细胞相类似的肿瘤抑制作用，另一方面提示所建立的“肿瘤芯片”模型可以较好地用来模拟人体肿瘤组织动态微环境，该结果可为临床上肿瘤免疫方式提供新的研究思路和应用策略。