一种大气细颗粒物有机组分中的效应组分的非靶向筛选和鉴定方法

技术领域

本发明属于环境新污染物筛查技术领域，具体涉及一种大气细颗粒物有机组分中的效应组分的非靶向筛选和鉴定方法。

背景技术

PM

由于颗粒物负载的有机物种类繁多，成分复杂，因此全面分析其上全部有机物质及其健康效应是不现实的。

发明内容

本发明为了解决由于PM

本发明由如下技术方案实现的：一种大气细颗粒物有机组分中的效应组分的非靶向筛选和鉴定方法，利用高分辨、高灵敏度的气相色谱-高分辨飞行时间质谱GC-HR-ToF-MS、综合EI/ECNI两种电离模式，对大气细颗粒物的有机组分进行全面的非靶向识别，利用了效应导向分析EDA，以关键毒性作为导向，筛选鉴定大气细颗粒物中的关键毒性物质。

具体方法为：

（1）大气细颗粒物总有机组分提取：使用大流量大气颗粒物采样器采集颗粒物样品，建立基于加速溶剂萃取仪ASE的PM

具体分为：极性组分提取：萃取剂甲醇，萃取温度100℃，加热时间5 min，平衡萃取时间10 min，循环次数2，润洗体积30%，灌注时间60s；

非极性组分提取：萃取剂为体积比1：1的正己烷/丙酮混合溶液，萃取温度100℃，加热时间5 min，平衡萃取时间10 min，循环次数2，润洗体积30%，灌注时间60s；

分别合并2次萃取液，旋转蒸发、氮吹浓缩至恒重，差值法称量提取物总重量；

（2）大气细颗粒物有机组分分离：A、将步骤（1）提取得到的大气细颗粒物总有机组分采用反向液相色谱RP-HPLC进行色谱分馏；利用PAHs混标和磺胺类抗生素混标标定色谱收集时间；具体液相方法为：仪器：QBH-LC；色谱柱：Sunniest C18, 4.6 mm × 5 μm× 250mm；紫外检测器波长：220 nm&290 nm；流动相：A-纯水，B-乙腈，1.0 ml/min；梯度：0min，50%B；2.5 min，50% B；5.5 min，100% B；11.5 min，100% B；14.5 min，50% B；17 min，50%B；馏分收集器采用时间窗口模式，间断性收集得到一级样品；

筛选：将分馏得到的一级有机组分分别对毒理学对应的体外细胞模型进行染毒，以细胞对应的非特异性指标作为毒理学终点，结合qRT-PCR技术检测一级有机组分对细胞上皮间质转化EMT过程标志因子（如E-cad、N-cad、Fib、Vim）表达的影响，初步筛选得到细颗粒物上毒性组分，并进行二级分馏；

B、将需要二级分馏的样品，溶剂替换为体积比为1：1的丙酮/乙酸乙酯混合溶液，进行正相液相色谱NP-HPLC法色谱分馏；同样利用PAHs混标和磺胺类抗生素混标标定色谱收集时间；具体液相方法为：仪器：QBH-LC；色谱柱：Intersil SIL-100A , 4.6 mm × 5 μm× 250 mm；紫外检测器波长：254 nm；流动相：A-正己烷，1.0 ml/min；等度洗脱：100% A，15min；馏分收集器采用时间窗口模式，间断性收集得到二级样品；

将分馏得到的二级有机组分分别对毒理学对应的体外细胞模型进行染毒，以细胞的对应的非特异性指标作为毒理学终点，从而筛选得到细颗粒物上关键毒性组分；

（3）大气细颗粒物关键毒性组分的鉴定：利用气相色谱结合高通量和高分辨率质谱的气相色谱-高分辨飞行时间质谱GC-HR-TOF-MS仪器，使用EI/ECNI两种电离模式对步骤（2）筛选得到的关键毒性组分进行物质全扫描，得到包含色谱质谱信息的所有组分的总离子流图，然后根据高分辨率的质谱碎片信息和色谱保留时间结合NIST等质谱数据库，对总离子流图中的各色谱质谱信息定性，从而识别筛选到的关键物质。

步骤（2）中所述细胞对应的非特异性指标为细胞迁移能力、存活率或炎性指标。

步骤(2)中所述毒理学对应的体外细胞模型为人肺癌A549细胞，细胞对应的非特异性指标为细胞迁移能力。

本发明提供了一种大气细颗粒物有机组分中的效应组分的非靶向筛选和鉴定方法，适用于研究大气细颗粒物中效应组分的筛查，比如促癌组分、心血管毒性、神经毒性等。本发明不仅可以全面的识别大气细颗粒物负载的有机物质，还能利用效应导向方法筛选出引起特定疾病的关键效应组分。与传统的毒理学实验相比，本研究结合了化学分析，将生物效应与效应污染物联系起来，克服了单一化学分析或单一生物测试在环境样品应用中的不足，不仅可以测试样品的生物效应，且能明确效应物，避免了化学分析中检测的盲目性和生物测试中效应物质的不确定性，为探究复杂大气PM

为了筛选、识别颗粒物引起某一特定疾病的关键有机组分，我们利用了效应导向分析（effrct-directed analysis，EDA）的原理，EDA的基本原理如图1所示。效应导向分析是一套针对复杂有机污染物的分析测试方法，它综合运用生物测试与化学分析，以生物效应为导向，指导活性组分的分离，并对组分进行定性，实现效应物的鉴定，最终明确样品的生物效应和主要效应物。

本发明所述方法结合了毒理学实验和化学分析，将生物效应与效应污染物联系起来，克服了单一化学或单一生物测试在环境样品应用中的不足，不仅可测试样品的生物效应，且能明确效应化合物，避免了化学分析中检测的盲目性和生物测试中效应物质的不确定性，为探究复杂大气PM

附图说明

图1为效应导向分析EDA的基本原理图；

图2为颗粒物样品有机提取物的RPLC一级分馏色谱图；

图3为一级分馏样品促肿瘤转移效应图；图中：A-B：颗粒物样品有机提取物一级分馏组分暴露对A549细胞体外转移能力影响的细胞实验效果图及数据统计图，其中A-H为颗粒物有机提取物一级分馏组分；C：颗粒物样品有机提取物一级分馏组分暴露对细胞间质转化相关标志基因表达的影响；

图4为颗粒物样品有机提取物一级分馏组分D的二级分馏样品效果图；

图5为二级分馏样品促肿瘤转移效应图；图中：A-B：颗粒物样品有机提取物二级分馏组分暴露对A549细胞体外转移能力影响的细胞实验效果图及数据统计图，其中D1、D2为颗粒物有机提取物一级分馏组分D的二级分馏产物；C:颗粒物样品有机提取物二级分馏组分暴露对细胞间质转化EMT相关标志基因表达的影响。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

本领域技术人员意识到的通过常规实验就能了解到的描述的特定实施方案的等同技术，都将包含在本申请中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1：一种大气细颗粒物中促肺癌发展的关键效应有机组分的筛查方法。该方法以肺癌转移为疾病终点，基于效应导向分析方法（EDA）筛选出大气细颗粒物负载的促癌有机组分，并通过高分辨的飞行时间质谱进行非靶向识别，从而准确识别大气细颗粒物负载的关键促癌组分。EDA的基本原理如图1所示，具体方法为：

1、大气细颗粒物总有机组分提取：使用大流量大气颗粒物采样器采集颗粒物样品，结合蒋幸等（Environ. Sci. Technol. 2019, 53, 10479−10486）对PM

具体分为：极性组分提取：萃取剂甲醇，萃取温度100℃，加热时间5 min，平衡萃取时间10 min，循环次数2，润洗体积30%，灌注时间60s；

非极性组分提取：萃取剂为体积比1：1的正己烷/丙酮混合溶液，萃取温度100℃，加热时间5 min，平衡萃取时间10 min，循环次数2，润洗体积30%，灌注时间60s；

分别合并2次萃取液，旋转蒸发、氮吹浓缩至恒重，差值法称量提取物总重量；

2、大气细颗粒物有机组分分离：

A、将步骤（1）提取得到的大气细颗粒物总有机组分采用反向液相色谱RP-HPLC进行色谱分馏；利用PAHs混标和磺胺类抗生素混标标定色谱收集时间；具体液相方法为：仪器：QBH-LC；色谱柱：Sunniest C18, 4.6 mm × 5 μm× 250 mm；紫外检测器波长：220 nm&290 nm；流动相：A-纯水，B-乙腈，1.0 ml/min；梯度：0min，50%B；2.5 min，50% B；5.5 min，100% B；11.5 min，100% B；14.5 min，50% B；17 min，50%B；馏分收集器采用时间窗口模式，每隔1.5分钟收集得到一个一级样品；颗粒物样品的RPLC一级分馏效果图如图2所示。

筛选：建立促癌效应筛选的体外细胞模型，其后续表征方法如下：

通过划痕实验，在显微镜明场条件下直观监测不同的颗粒物有机分馏组分对A549细胞的迁移距离的影响；

qRT-PCR方法检测不同有机分馏组分处理后A549细胞上皮间质转化相关mRNA的表达。

将分馏得到的一级有机组分A-H分别对人肺癌A549细胞模型进行染毒，以A549细胞对应的迁移能力作为毒理学终点，结合qRT-PCR检测技术分析一级有机组分对A549细胞上皮间质转化过程标志因子（如E-cad、N-cad、Fib、Vim）表达的影响，初步筛选得到细颗粒物上毒性组分，并进行二级分馏；一级分馏样品促肿瘤转移效应如图3所示，样品D引起细胞迁移能力的增加最为显著，并且样品D诱导上皮间质转化因子（E-cad、N-cad、Fib、Vim）表达的改变程度最高，因此我们认为样品D可能是诱导A549细胞迁移能力增加的关键组分，因此针对样品D进行进一步的二级分馏。

B、将需要二级分馏的样品D，溶剂替换为体积比为1：1的丙酮/乙酸乙酯混合溶液，进行正相液相色谱NP-HPLC法色谱分馏；同样利用PAHs混标和磺胺类抗生素混标标定色谱收集时间；具体液相方法为：仪器：QBH-LC；色谱柱：Intersil SIL-100A , 4.6 mm × 5 μm× 250 mm；紫外检测器波长：254 nm；流动相：A-正己烷，1.0 ml/min；等度洗脱：100% A，15min；馏分收集器采用时间窗口模式，每个2分钟收集得到一个二级样品；二级分馏样品NP-HPLC效果如图4所示。

将分馏得到的二级有机组分分别对毒理学对应的人肺癌A549细胞进行染毒，以A549细胞的迁移能力作为毒理学终点，从而筛选得到细颗粒物上促肿瘤细胞转移组分；二级分馏样品促肿瘤转移效应如图5所示，样品D2引起细胞迁移能力的增加最为显著，并且样品D2诱导上皮间质转化因子（E-cad、N-cad、Fib、Vim）表达的改变程度最高，因此我们认为样品D可能是诱导A549细胞迁移能力增加的关键组分，因此针对样品D2进行组分鉴定。

3、大气细颗粒物关键毒性组分的鉴定：利用气相色谱结合高通量和高分辨率质谱的气相色谱-高分辨飞行时间质谱GC-HR-TOF-MS仪器，使用EI/ECNI两种电离模式对步骤（2）筛选得到的关键毒性组分进行物质全扫描，得到包含色谱质谱信息的所有组分的总离子流图，然后根据高分辨率的质谱碎片信息和色谱保留时间结合NIST等质谱数据库，对总离子流图中的各色谱质谱信息定性，从而识别筛选到的关键物质大气细颗粒物促癌组分。

促肿瘤转移效应关键组分识别结果如表1所示，结果显示：初步得到促肺肿瘤转移效应关键组分35种：（1）7，7-二氯-2-庚酮C

4、促肿瘤转移效应关键组分进一步筛选

通过高通量气相色谱-高分辨飞行时间质谱GC-HR-TOF-MS仪器全面识别到35种有机组分，针对这35种有机组分分别与细胞上皮间质转化过程的关键转录调控因子进行分子对接，比较其结合能力，对接结果如表1所示。

表1：气相色谱-高分辨飞行时间质谱识别的促肿瘤转移效应关键组分

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样品D2各组分与调控EMT过程关键转录因子的分子对接结果如表2所示。

表2：样品D2各组分与调控EMT过程关键转录因子的分子对接结果

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结合表2所示结果，通过分子对接进一步筛选得到的促肿瘤转移关键效应组分如表3所示。

表3为通过分子对接进一步筛选得到的促肿瘤转移关键效应组分

本发明最终识别筛选到的大气细颗粒物中促肿瘤转移关键效应组分为：（1）三己胺C

通过本发明所述方法，以肺癌为特异的疾病终点，分离、鉴定颗粒物关键促癌效应组分，实现对颗粒物关键促癌效应组分的针对性控制。为探究复杂大气PM

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。