用于水稻基因分型的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术和分子育种技术领域，具体涉及用于水稻基因分型的SNP分子标记及其应用。

背景技术

在种业振兴的大背景下，分子指纹技术将成为作物育种的有力工具。缺少利用分子指纹技术对材料的分子特征的规范记录，可能会导致不同阶段获得的育种材料在分子指纹上存在差异，极大地增加种子企业的风险。

近年来，在水稻分子指纹分析方面已有相关标准陆续出台。目前行业内大规模使用的是SSR标准，受制于该检测技术本身的特性，SSR标记技术在实验操作便捷性、实验数据结果分析效率、数据记录规范性、单台仪器的单日检测通量等方面都明显弱于SNPs标记检测技术。

为了实现对一群指定材料群体及其衍生后代进行更加便捷、高效和经济的分子指纹鉴定，开发用于水稻育种核心骨干亲本群体鉴定的SNP标记具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供用于水稻基因分型的SNP分子标记及其应用。

为实现上述目的，本发明通过芯片技术分析了水稻育种骨干核心亲本群体，获得了5万以上的SNPs变异信息，同时，利用特定的筛选方案确定了有效鉴定这群亲本群体的SNPs标记组，并通过实验验证了该SNPs标记组能够用于上述水稻育种骨干核心亲本群体的基因分型、真实性和纯度鉴定。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供用于水稻基因分型的SNP分子标记，所述分子标记包含以下SNP分子标记中的任意一个或至少两个的组合：F0119312673GA、R0136269938AG、F0136380590GA、R0206491684CT、R0204051573TC、R0327455062GA、R0507762619GC、F0523332421GA、R0601649489CT、R0620792855TC、F0819572912CT、R0819367050GA、R0908001195CT、R0921310853CT、F1013749894GT和F1109053928AG。

在本发明的一些实施方式中，所述用于水稻基因分型的SNP分子标记包含以下SNP分子标记中的任意一个：F0119312673GA、R0136269938AG、F0136380590GA、R0206491684CT、R0204051573TC、R0327455062GA、R0507762619GC、F0523332421GA、R0601649489CT、R0620792855TC、F0819572912CT、R0819367050GA、R0908001195CT、R0921310853CT、F1013749894GT和F1109053928AG。

在本发明的一些实施方式中，所述用于水稻基因分型的SNP分子标记包含以下SNP分子标记中的任意2～16个的组合：F0119312673GA、R0136269938AG、F0136380590GA、R0206491684CT、R0204051573TC、R0327455062GA、R0507762619GC、F0523332421GA、R0601649489CT、R0620792855TC、F0819572912CT、R0819367050GA、R0908001195CT、R0921310853CT、F1013749894GT和F1109053928AG。

以上所述的分子标记除R0921310853CT、R0507762619GC外，命名规则如下：第1位的字母代表序列的方向(F代表正义链，R代表反义链)，第2、3位是染色体(例如：01代表1号染色体)，第4-11位共8位代表坐标(MSU6.0)，第12、13位是第1位字母所示方向下的碱基变异类型。以F0119312673GA为例，该SNP分子标记的多态性位点位于水稻1号染色体正义链坐标(MSU6.0)为19312673的位置，多态性为G/A。R0921310853CT、R0507762619GC的首字母与第12、13位的碱基对应关系与上述规则不同。

具体地，以上所述的分子标记的多态性位点的具体信息如表1所示。

表1

具体地，以上所述的分子标记的核苷酸序列为如SEQ ID NO.49-64所示序列中的一个或多个，其中，SEQ ID NO.49所示序列的多态性位点位于第35位，多态性为A/G；SEQ IDNO.50所示序列的多态性位点位于第39位，多态性为T/C；SEQ ID NO.51所示序列的多态性位点位于第20位，多态性为A/G；SEQ ID NO.52所示序列的多态性位点位于第20位，多态性为A/G；SEQ ID NO.53所示序列的多态性位点位于第70位，多态性为A/G；SEQ ID NO.54所示序列的多态性位点位于第44位，多态性为T/C；SEQ ID NO.55所示序列的多态性位点位于第20位，多态性为G/C；SEQ ID NO.56所示序列的多态性位点位于第20位，多态性为A/G；SEQID NO.57所示序列的多态性位点位于第20位，多态性为A/G；SEQ ID NO.58所示序列的多态性位点位于第81位，多态性为A/G；SEQ ID NO.59所示序列的多态性位点位于第31位，多态性为T/C；SEQ ID NO.60所示序列的多态性位点位于第38位，多态性为T/C；SEQ ID NO.61所示序列的多态性位点位于第20位，多态性为A/G；SEQ ID NO.62所示序列的多态性位点位于第22位，多态性为T/C；SEQ ID NO.63所示序列的多态性位点位于第78位，多态性为T/G；SEQID NO.64所示序列的多态性位点位于第20位，多态性为A/G。

在本发明的一些实施方式中，所述用于水稻基因分型的SNP分子标记包含核苷酸序列如SEQ ID NO.49-64所示的分子标记中的任意一个。

SEQ ID NO.49-64所示序列具体如下：

SEQ ID NO.49：

CATTGTGGTACAGTATTCACGCAGCAATGCACAGGGTTTTCATCTAATGTTATAGG；

SEQ ID NO.50：

TGTTTCAGGGACCGAGCTACGGCCTACGGGCAGCGACTTGTTTTTACCGTCATTTGCAGC；

SEQ ID NO.51：

CCCGAAAGTTCAACGTCCAGTGATGAAAACCTTTCAGCACCCCCTTGTGTAGTGACATTTA；

SEQ ID NO.52：

CACCATTGATCCTTCCATAGGCAACCTCACCTACCTGAGAAAGCTTGATCTCCCTGTGAATCATCTAACTGGTACCATCCCTTCAGAGCTTGGTCGTC；

SEQ ID NO.53：

AGCATACCTCGTTCATGGCGCGTTTCGGAAGCTCTTGAATATGGACTAGTCGGTGTGAACGAGGGGATCATCTCAACAGAGGTAAGAAG；

SEQ ID NO.54：

ACAAATGGAGGTCTAGAGAAGGATAAAGATTAGATTATTTTGACGACTACAGACTTTGTACAT；

SEQ ID NO.55：

CACCATGGTTCTTGGTTAACTTGGATTCAACAACATGAATAATGTCCTGTGTGGA；

SEQ ID NO.56：

ATTACAAGCGTTTCCATCAGCAATGCTCTCGATCGATTCAGCAACTTCGGTCTCTTTCCGGTGAGCTGGTT；

SEQ ID NO.57：

ACAATCTGGCTTGATCTCCGCAACTGGTGATATTGAGTCACAAAGCACAGTTACTGAAGAACGTGAACTAGGTAGTGCATGA；

SEQ ID NO.58：

CCAAGGACACACTAACGGTCTTTCCAAAAGAATCATGAAGATGACAAGATATCAGGACTTGTTGTTTTCTGACAATGGTAGAACCGTCCAACACCAATTA；

SEQ ID NO.59：

GCACAAGCCAACGTATCATAAAGTGGGTGTCACGAATTCGCGTCGCTCAT；

SEQ ID NO.60：

GGATCAATAACACGTCCGCCTGCACTAAATGCTGATTCTGAAGCTACAGGTGACACT；

SEQ ID NO.61：

GTACTTATGATCGAGACATGCATGGTTTCATATATGCATGCAATGCATGGACCATGTACT；

SEQ ID NO.62：

GGTTGTAAAATAAGTGGAGTGCCTGTATGTATCTGTATGCATGCACGGCA；

SEQ ID NO.63：

CTTGGACCGGCAAACACATGCATGTGTGGCTACAGCAACTTGCTAATTAACTGGTATATGTGTCTCATTCACAAATGTGTAGCTTCCGTATCTAACA；

SEQ ID NO.64：

CGGTGTCAGAGATCAGAATGGGGAGAAGAGGAGGAGGAGAGAGAAGCTAGA。

在本发明的一些实施方式中，所述用于水稻基因分型的SNP分子标记包含核苷酸序列如SEQ ID NO.49-64所示的分子标记中的任意2～16个的组合。

本发明还提供由以下所示的KASP引物组扩增得到的SNP分子标记中的一个或多个：F0119312673GA：SEQ ID NO.1-3；R0136269938AG：SEQ ID NO.4-6；F0136380590GA：SEQID NO.7-9；R0206491684CT：SEQ ID NO.10-12；R0204051573TC：SEQ ID NO.13-15；R0327455062GA：SEQ ID NO.16-18；R0507762619GC：SEQ ID NO.19-21；F0523332421GA：SEQID NO.22-24；R0601649489CT：SEQ ID NO.25-27；R0620792855TC：SEQ ID NO.28-30；F0819572912CT：SEQ ID NO.31-33；R0819367050GA：SEQ ID NO.34-36；R0908001195CT：SEQID NO.37-39；R0921310853CT：SEQ ID NO.40-42；F1013749894GT：SEQ ID NO.43-45；F1109053928AG：SEQ ID NO.46-48。

上述SNP分子标记可用于表2中所示的水稻育种骨干核心亲本材料的基因分型，进而对这些水稻育种材料进行真实性和纯度的鉴定。

第二方面，本发明提供用于水稻基因分型的引物组，所述引物组包含用于扩增以上所述的SNP分子标记的引物对。

优选地，所述引物组包含以下引物对中的一对或多对：SEQ ID NO.1和3所示引物对、SEQ ID NO.2和3所示引物对、SEQ ID NO.4和6所示引物对、SEQ ID NO.5和6所示引物对、SEQ ID NO.7和9所示引物对、SEQ ID NO.8和9所示引物对、SEQ ID NO.10和12所示引物对、SEQ ID NO.11和12所示引物对、SEQ ID NO.13和15所示引物对、SEQ ID NO.14和15所示引物对、SEQ ID NO.16和18所示引物对、SEQ ID NO.17和18所示引物对、SEQ ID NO.19和21所示引物对、SEQ ID NO.20和21所示引物对、SEQ ID NO.22和24所示引物对、SEQ ID NO.23和24所示引物对、SEQ ID NO.25和27所示引物对、SEQ ID NO.26和27所示引物对、SEQ IDNO.28和30所示引物对、SEQ ID NO.29和30所示引物对、SEQ ID NO.31和33所示引物对、SEQID NO.32和33所示引物对、SEQ ID NO.34和36所示引物对、SEQ ID NO.35和36所示引物对、SEQ ID NO.37和39所示引物对、SEQ ID NO.38和39所示引物对；SEQ ID NO.40和42所示引物对、SEQ ID NO.41和42所示引物对；SEQ ID NO.43和45所示引物对、SEQ ID NO.44和45所示引物对；SEQ ID NO.46和48所示引物对、SEQ ID NO.47和48所示引物对。

进一步优选地，所述引物组中的引物为KASP标记引物。

在本发明的一些实施方式中，所述引物组包含以下KASP标记引物对中的任意一对：

F0119312673GA：SEQ ID NO.1-3；

R0136269938AG：SEQ ID NO.4-6；

F0136380590GA：SEQ ID NO.7-9；

R0206491684CT：SEQ ID NO.10-12；

R0204051573TC：SEQ ID NO.13-15；

R0327455062GA：SEQ ID NO.16-18；

R0507762619GC：SEQ ID NO.19-21；

F0523332421GA：SEQ ID NO.22-24；

R0601649489CT：SEQ ID NO.25-27；

R0620792855TC：SEQ ID NO.28-30；

F0819572912CT：SEQ ID NO.31-33；

R0819367050GA：SEQ ID NO.34-36；

R0908001195CT：SEQ ID NO.37-39；

R0921310853CT：SEQ ID NO.40-42；

F1013749894GT：SEQ ID NO.43-45；

F1109053928AG：SEQ ID NO.46-48。

在本发明的一些实施方式中，所述引物组包含以下KASP标记引物对中的任意2～16对：

F0119312673GA：SEQ ID NO.1-3；

R0136269938AG：SEQ ID NO.4-6；

F0136380590GA：SEQ ID NO.7-9；

R0206491684CT：SEQ ID NO.10-12；

R0204051573TC：SEQ ID NO.13-15；

R0327455062GA：SEQ ID NO.16-18；

R0507762619GC：SEQ ID NO.19-21；

F0523332421GA：SEQ ID NO.22-24；

R0601649489CT：SEQ ID NO.25-27；

R0620792855TC：SEQ ID NO.28-30；

F0819572912CT：SEQ ID NO.31-33；

R0819367050GA：SEQ ID NO.34-36；

R0908001195CT：SEQ ID NO.37-39；

R0921310853CT：SEQ ID NO.40-42；

F1013749894GT：SEQ ID NO.43-45；

F1109053928AG：SEQ ID NO.46-48。

上述引物组可用于高效扩增、检测以上所述的SNP分子标记，进而用于水稻育种骨干核心亲本材料(表2所示)的基因分型、真实性和纯度鉴定。

第三方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的引物组。

优选地，所述试剂盒还包含KASP技术检测所需的其他PCR反应试剂，包括但限于KASP预混液、分析预混液、水等。

第四方面，本发明提供一种水稻育种芯片，所述芯片包含以上所述的SNP分子标记或其检测试剂。

上述水稻育种芯片可用于水稻育种骨干核心亲本材料(表2所示)的基因分型、真实性和纯度鉴定。

第五方面，本发明提供以上所述的SNP分子标记或其检测试剂或以上所述的引物组或包含所述引物组的试剂盒的以下任一种应用：

(1)在水稻基因分型中的应用；

(2)在水稻品种鉴定中的应用；

(3)在水稻真实性和/或纯度鉴定中的应用；

(4)在水稻育种材料检测中的应用；

(5)在水稻制种或繁种质量监测中的应用；

(6)在水稻育种芯片制备中的应用；

(7)在水稻分子标记辅助育种中的应用；

(8)在水稻种质资源分子指纹分析中的应用。

优选地，上述应用中，待测水稻为表2中所示的水稻育种骨干核心亲本群体中的水稻材料或其后代材料。

第六方面，本发明提供一种水稻基因分型方法，所述方法包括：检测待测水稻中以上所述的SNP分子标记的基因型，获得待测水稻的基因分型结果。

上述方法中，检测待测水稻中以上所述的SNP分子标记的基因型可采用以上所述的引物组或试剂盒进行检测。

第七方面，本发明提供一种鉴定水稻真实性和/或纯度的方法，所述方法包括：检测待测水稻中以上所述的SNP分子标记的基因型，将得到的待测水稻的基因型与参照样品的相应基因型进行比较，判断水稻的真实性和/或纯度。

上述方法中，检测待测水稻中以上所述的SNP分子标记的基因型可采用以上所述的引物组或试剂盒进行检测。

上述方法中，所述参照样品即为水稻材料的标准对照品。

本申请提供的上述技术方案，均建立了严谨的试验方案，通过筛选、比对、测试，并在应用实践中取得了预期的效果。

本发明的有益效果至少包括：本发明提供了一套用于水稻基因分型、鉴定水稻真实性和纯度的SNP分子标记，该SNP分子标记组利用远少于目前使用的48个SSR标记的SNP标记数量，即可实现水稻材料的真实性和纯度鉴定，极大地降低了检测成本并提高了检测通量和效率。

在基于100多份材料的育种群体时，理论上，二态性的单核苷酸多态性(SNP)，可以在8个多态性位点区分256种单倍型。利用本发明提供的基于KASP终点荧光检测的SNP标记技术，通过远少于48个SSR标记的SNP标记，可实现水稻真实性的鉴定，实现了降低成本和增加通量的双重优势，由此建立的水稻分子检测的方法在水稻育种和生产实践中具有很好的应用价值。

附图说明

图1-图4为本发明实施例2中illumina芯片分型效果类型图，其中，图1：合格类特征为同类分型聚类集中，不同类型间距大，无异常分型的位点；图2：不合格类特征为有信号值低或无的异常分型的位点；图3：不合格类特征为在亲本群体预期纯合的前提下出现杂合基因型的位点；图4：不合格类特征为预期两种纯合基因型的前提下，出现了多于两种聚类分型的位点。

图5-图20为本发明实施例2中155份水稻育种核心骨干亲本在芯片检测中16个分子标记分型图，其中，图5为标记F0119312673GA，图6为标记F0136380590GA，图7为标记R0136269938AG，图8为标记R0206491684CT，图9为标记R0204051573TC，图10为标记R0327455062GA，图11为标记F0523332421GA，图12为标记R0507762619GC，图13为标记R0601649489CT，图14为标记R0620792855TC，图15为标记R0819367050GA，图16为标记F0819572912CT，图17为标记R0908001195CT，图18为标记R0921310853CT，图19为标记F1013749894GT，图20为标记F1109053928AG。

图21-图36为本发明实施例2中16个分子标记检测155份水稻育种核心骨干亲本基因型的实验图，其中，图21为标记F0119312673GA，图22为标记R0136269938AG，图23为标记F0136380590GA，图24为标记R0206491684CT，图25为标记R0204051573TC，图26为标记R0327455062GA，图27为标记R0507762619GC，图28为标记F0523332421GA，图29为标记R0601649489CT，图30为标记R0620792855TC，图31为标记F0819572912CT，图32为标记R0819367050GA，图33为标记R0908001195CT，图34为标记R0921310853CT，图35为标记F1013749894GT，图36为标记F1109053928AG。

图37-图52为本发明实施例3中16个分子标记检测公司内部组配的89份水稻F1分型效果，其中，图37为标记F0119312673GA，图38为标记R0136269938AG，图39为标记F0136380590GA，图40为标记R0206491684CT，图41为标记R0204051573TC，图42为标记R0327455062GA，图43为标记R0507762619GC，图44为标记F0523332421GA，图45为标记R0601649489CT，图46为标记R0620792855TC，图47为标记F0819572912CT，图48为标记R0819367050GA，图49为标记R0908001195CT，图50为标记R0921310853CT，图51为标记F1013749894GT，图52为标记F1109053928AG。

具体实施方式

本发明中使用的术语的定义如下：

本文所用术语“单核苷酸多态性”或者“SNP”或者“SNP标记”或者“SNP位点”是指存在于染色体的基因组序列中的核苷酸序列，基于核苷酸序列的差异(单个核苷酸——A、T、C或G的改变)而引起的多核苷酸序列变化，造成染色体基因组的多样性，进而允许不同等位基因(例如来自两个不同个体的等位基因)或不同个体彼此相区分。该变化可能发生在基因的编码区或非编码区(例如启动子区或其附近，或者内含子)内或者基因间区域中。

本文所用术语“等位基因”指同源染色体上存在于给定基因座中的相同基因的不同形式。

本文所用术语“SNP芯片”或“芯片”指生物微芯片，其能够通过排列和附着几百至几十万个生物分子来分析样品DNA中所含有的SNP的存在，所述生物分子如具有已知序列的DNA、DNA片段、cDNA、寡核苷酸、RNA或RNA片段，它们被以一定的间隔固定在由玻璃、硅或尼龙形成的小固体基材上。根据互补的程度，样品中含有的核酸和固定在表面的之间发生杂交。通过检测和判断杂交，可以同时获得关于样品中含有的遗传物质信息。

现行的DNA芯片主要类型包括：在片原位合成法，其采用修饰的寡核苷酸单体逐步原位合成空间组合的序列形成DNA芯片，从而在硬质表面上直接合成寡核苷酸阵列。离片合成法，其涉及利用点样法将预先合成好的序列点到特定位点形成DNA芯片，从而形成固定在玻璃基片的DNA阵列。微珠法，其涉及在编码的微珠上直接合成DNA，或者将预先制备好的序列固定到编码的微珠上，进而任意组装构成微珠芯片。

本文所用术语“分子标记(Molecular Markers)”或“多态性位点”，是指以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性包括但不限于：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。在本申请的上下文中，分子标记通常是指SNP标记。

本文所用术语“KASP”是指竞争性等位基因特异性多聚酶链式反应，由于其可以分析基因突变(SNP)，有望成为植物基因组分析的首选技术平台。

本文所用术语“真实性”是指生物体的独特性，尤其水稻的物种属性时不同繁殖来源情况下的独特性、一致性和稳定性，其特征体现为待测样品与标准品在独特性、一致性和稳定性上的比较是否一致。

本文所用术语“纯度”在本申请的上下文中是指一批种子，尤其是水稻种子中，目标种子的含量。

为实现本申请的目的，本申请首先通过比对涵盖155份水稻育种核心骨干亲本芯片检测数据，筛选能够区分水稻育种核心骨干亲本的多态性位点。共获得能够完全区分水稻育种核心骨干亲本的分布于不同染色体的多态性位点16个。随后又开发出能检测这16个多态性位点的引物和，利用开发出的引物能够鉴定水稻的真实性和纯度。

具体而言，本发明提供了如下技术方案。

在第一方面，本发明提供了用于水稻基因分型的分子标记，其包括以下分子标记中的一种或多种：F0119312673GA、R0136269938AG、F0136380590GA、R0206491684CT、R0204051573TC、R0327455062GA、R0507762619GC、F0523332421GA、R0601649489CT、R0620792855TC、F0819572912CT、R0819367050GA、R0908001195CT、R0921310853CT、F1013749894GT和F1109053928AG。

在第二方面，本发明提供了用于水稻基因分型的引物组，所述引物组选自以下引物组的一组或多组：

SEQ ID NO.1和3所示引物对和/或SEQ ID NO.2和3所示引物对；

SEQ ID NO.4和6所示引物对和/或SEQ ID NO.5和6所示引物对；

SEQ ID NO.7和9所示引物对和/或SEQ ID NO.8和9所示引物对；

SEQ ID NO.10和12所示引物对和/或SEQ ID NO.11和12所示引物对；

SEQ ID NO.13和15所示引物对和/或SEQ ID NO.14和15所示引物对；

SEQ ID NO.16和18所示引物对和/或SEQ ID NO.17和18所示引物对；

SEQ ID NO.19和21所示引物对和/或SEQ ID NO.20和21所示引物对；

SEQ ID NO.22和24所示引物对和/或SEQ ID NO.23和24所示引物对；

SEQ ID NO.25和27所示引物对和/或SEQ ID NO.26和27所示引物对；

SEQ ID NO.28和30所示引物对和/或SEQ ID NO.29和30所示引物对；

SEQ ID NO.31和33所示引物对和/或SEQ ID NO.32和33所示引物对；

SEQ ID NO.34和36所示引物对和/或SEQ ID NO.35和36所示引物对；

SEQ ID NO.37和39所示引物对和/或SEQ ID NO.38和39所示引物对；

SEQ ID NO.40和42所示引物对和/或SEQ ID NO.41和42所示引物对；

SEQ ID NO.43和45所示引物对和/或SEQ ID NO.44和45所示引物对；

SEQ ID NO.46和48所示引物对和/或SEQ ID NO.47和48所示引物对。

在第三方面，本发明提供了用于水稻基因分型的引物对，所述引物对选自用于扩增以下分子标记中的一个或多个的引物对：F0119312673GA、R0136269938AG、F0136380590GA、R0206491684CT、R0204051573TC、R0327455062GA、R0507762619GC、F0523332421GA、R0601649489CT、R0620792855TC、F0819572912CT、R0819367050GA、R0908001195CT、R0921310853CT、F1013749894GT和F1109053928AG。

在第四方面，本发明提供了用于水稻基因分型的试剂盒，其包含选自用于扩增以下分子标记中的一个或多个的引物对：F0119312673GA、R0136269938AG、F0136380590GA、R0206491684CT、R0204051573TC、R0327455062GA、R0507762619GC、F0523332421GA、R0601649489CT、R0620792855TC、F0819572912CT、R0819367050GA、R0908001195CT、R0921310853CT、F1013749894GT和F1109053928AG。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于KASP检测的其他PCR试剂，包括但不限于DNA聚合酶，优选高保真DNA聚合酶，缓冲液、dNTP等。

在第五方面，本发明提供了以上第一方面所述的分子标记、第二方面所述的引物组、第三方面所述的引物对或第四方面所述的试剂盒用于鉴定水稻真实性和/或纯度的用途。

在第六方面，本发明提供了以上第一方面所述的分子标记、第二方面所述的引物组、第三方面所述的引物对或第四方面所述的试剂盒用于监测水稻的制种或繁种质量的用途。

在第七方面，本发明提供了一种水稻基因分型的方法，其包括鉴定以上第一方面所述的分子标记的基因型的步骤。

在一些实施方案中，采用以上第二方面所述的引物组、第三方面所述的引物对或第四方面所述的试剂盒鉴定以上第一方面所述的分子标记的基因型。

在第八方面，本发明提供了鉴定水稻真实性和/或纯度的方法，其包括鉴定以上第一方面所述的分子标记的基因型，以及，

将所得结果与参照样品的相应基因型进行比较，从而判定水稻的真实性和/或纯度。

在本发明的一些实施方案中，采用以上第二方面所述的引物组、第三方面所述的引物对或第四方面所述的试剂盒鉴定第一方面所述的分子标记的基因型。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中所使用的水稻育种核心骨干亲本的信息可在中国水稻数据中心网站查询得到，水稻材料可通过市售途径或从中国种子集团有限公司获得。

实施例1 155份水稻育种核心骨干亲本单倍型的多态性位点的鉴定以及标记序列的设计、合成与测试

本发明的SNP分子标记的开发过程简要概括如下：

1、第一轮筛选，标记过滤：

针对水稻育种骨干核心亲本材料155份(表2和表3)，利用已有芯片的基因型数据，为了提高标记的分型效果，挑选芯片中的高质量位点(图1)，剔除低质量位点(图2、图3和图4)，根据标记的数据检出率剔除检出率较低的标记，剔除含无效数据的位点，利用primer3，对SNP上下游500bp的区段，设计标记，剔除无法成功设计标记的位点，根据芯片数据基因型去重，去除重复性位点，计算位点PIC(多态性信息含量)值，去除PIC为0的位点，共计筛选到4956个位点。

2、第二轮筛选，SNP标记组计算:

计算每个位点的PIC值，以PIC值最大的位点作为第一个位点，并以此位点将所有材料分成2组，计算剩余位点在已分成的组合中的权重PIC值，即位点在分组中的PIC*分组内的材料/总材料数并求和，选择权重PIC值最大的作为中选标记，并对上一轮已分成的材料组再次分组，重复以上2个步骤，直到分组总数＝材料总数，或者连续两次的分组总数不变时，得到的位点列表为中选列表，共计得到15个位点，可以实现155份材料完全区分。计算4956个位点间的距离矩阵，挑选与中选位点距离最近的约10个位点作为备选位点，共计挑选165个位点进行标记设计。

3、第三轮筛选，标记开发：

以165个位点设计KASP标记，共计设计77个标记，进行亲本实验验证，挑选分型效果良好的24个标记，重新对155份材料重复第二轮筛选流程，中选16个标记，可以对155份材料进行区分(表2和表3)。

4、第四轮筛选，杂交F1材料验证：利用中选的16个标记对F1杂交种进行实验验证。

表2 155份水稻育种核心骨干亲本单倍型信息(1)

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表3 155份水稻育种核心骨干亲本单倍型信息(2)

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备注：Hom1是指纯合基因型1，Hom2是指纯合基因型2，其中，

对于F0119312673GA，Hom1为TT，Hom2为CC；

对于R0136269938AG，Hom1为AA，Hom2为GG；

对于F0136380590GA，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于R0206491684CT，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于R0204051573TC，Hom1为TT，Hom2为CC；

对于R0327455062GA，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于R0507762619GC，Hom1为CC，Hom2为GG；

对于F0523332421GA，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于R0601649489CT，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于R0620792855TC，Hom1为CC，Hom2为TT；

对于F0819572912CT，Hom1为AA，Hom2为GG；

对于R0819367050GA，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于R0908001195CT，Hom1为AA，Hom2为GG；

对于R0921310853CT，Hom1为TT，Hom2为CC；

对于F1013749894GT，Hom1为AA，Hom2为CC；

对于F1109053928AG，Hom1为GG，Hom2为AA。

通过第3轮筛选，获得了16组成功分型的引物组合，每组引物组合由三条引物组成，其序列分别如SEQ ID NO.1-48所示(从SEQ ID NO.1开始依次至SEQ ID NO.48，每三个序列为一组引物组合)，这16个分子标记的48条引物序列SEQ ID NO.1-SEQ ID No.48由上海生工公司合成。上述针对16个多态性位点的引物的序列具体如下：

SEQ ID NO.1KRCI01S02正向引物1：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCTATAACATTAGATGAAAACT；

SEQ ID NO.2KRCI01S02正向引物2：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCTATAACATTAGATGAAAACC；

SEQ ID NO.3KRCI01S02反向引物：CATTGTGGTACAGTATTCAC；

SEQ ID NO.4KRCI01S05正向引物1：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTGCAAATGACGGTAAAAACA；

SEQ ID NO.5KRCI01S05正向引物2：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCTGCAAATGACGGTAAAAACG；

SEQ ID NO.6KRCI01S05反向引物：TGTTTCAGGGACCGAGCTAC；

SEQ ID NO.7KRCI01S06正向引物1：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCGAAAGTTCAACGTCCAG；

SEQ ID NO.8KRCI01S06正向引物2：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCCGAAAGTTCAACGTCCAA；

SEQ ID NO.9KRCI01S06反向引物：TAAATGTCACTACACAAGGG；

SEQ ID NO.10KRCI02S12正向引物1：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCACCATTGATCCTTCCATAG；

SEQ ID NO.11KRCI02S12正向引物2：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACCATTGATCCTTCCATAA；

SEQ ID NO.12KRCI02S12反向引物：GACGACCAAGCTCTGAAGGG；

SEQ ID NO.13KRCI02S15正向引物1：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTCTTACCTCTGTTGAGAT；

SEQ ID NO.14KRCI02S15正向引物2：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTTCTTACCTCTGTTGAGAC；

SEQ ID NO.15KRCI02S15反向引物：AGCATACCTCGTTCATGGCG；

SEQ ID NO.16KRCI03S05正向引物1：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATGTACAAAGTCTGTAGTCG；

SEQ ID NO.17KRCI03S05正向引物2：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATGTACAAAGTCTGTAGTCA；

SEQ ID NO.18KRCI03S05反向引物：ACAAATGGAGGTCTAGAGAAGGA；

SEQ ID NO.19KRCI05S07正向引物1：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCACCATGGTTCTTGGTTAAC；

SEQ ID NO.20KRCI05S07正向引物2：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACCATGGTTCTTGGTTAAG；

SEQ ID NO.21KRCI05S07反向引物：TCCACACAGGACATTATTCATG；

SEQ ID NO.22KRCI05S09正向引物1：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATTACAAGCGTTTCCATCAG；

SEQ ID NO.23KRCI05S09正向引物2：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTACAAGCGTTTCCATCAA；

SEQ ID NO.24KRCI05S09反向引物：AACCAGCTCACCGGAAAGAG；

SEQ ID NO.25KRCI06S04正向引物1：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACAATCTGGCTTGATCTCCG；

SEQ ID NO.26KRCI06S04正向引物2：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACAATCTGGCTTGATCTCCA；

SEQ ID NO.27KRCI06S04反向引物：TCATGCACTACCTAGTTCACGT；

SEQ ID NO.28KRCI06S05正向引物1：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAATTGGTGTTGGACGGTTC；

SEQ ID NO.29KRCI06S05正向引物2：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTAATTGGTGTTGGACGGTTT；

SEQ ID NO.30KRCI06S05反向引物：CCAAGGACACACTAACGGTCT；

SEQ ID NO.31KRCI08S01正向引物1：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATGAGCGACGCGAATTCGTA；

SEQ ID NO.32KRCI08S01正向引物2：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATGAGCGACGCGAATTCGTG；

SEQ ID NO.33KRCI08S01反向引物：GCACAAGCCAACGTATCATA；

SEQ ID NO.34KRCI08S03正向引物1：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGTGTCACCTGTAGCTTCAG；

SEQ ID NO.35KRCI08S03正向引物2：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGTGTCACCTGTAGCTTCAA；

SEQ ID NO.36KRCI08S03反向引物：GGATCAATAACACGTCCGCC；

SEQ ID NO.37KRCI09S01正向引物1：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTACTTATGATCGAGACATA；

SEQ ID NO.38KRCI09S01正向引物2：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTACTTATGATCGAGACATG；

SEQ ID NO.39KRCI09S01反向引物：AGTACATGGTCCATGCATTG；

SEQ ID NO.40KRCI09S03正向引物1：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTTGTAAAATAAGTGGAGTGT；

SEQ ID NO.41KRCI09S03正向引物2：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTTGTAAAATAAGTGGAGTGC；

SEQ ID NO.42KRCI09S03反向引物：TGCCGTGCATGCATACAGAT；

SEQ ID NO.43KRCI10S05正向引物1：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTTAGATACGGAAGCTACA；

SEQ ID NO.44KRCI10S05正向引物2：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTTAGATACGGAAGCTACC；

SEQ ID NO.45KRCI10S05反向引物：CTTGGACCGGCAAACACATG；

SEQ ID NO.46KRCI11S03正向引物1：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGGTGTCAGAGATCAGAATG；

SEQ ID NO.47KRCI11S03正向引物2：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGGTGTCAGAGATCAGAATA；

SEQ ID NO.48KRCI11S03反向引物：TCTAGCTTCTCTCTCCTCCTCC。

实施例2 16个分子标记对水稻真实性鉴定效果的验证

为验证实施例1中获得的16个分子标记鉴定水稻亲本真实性的效果，需要测试引物组合的实际检测及分型效果，利用155份水稻核心骨干亲本的DNA进行实验测试。通过比较参照样品的基因型与实际检测的基因型是否一致，从而判定引物组是否达到预期的检测效果。检测方法的具体操作步骤如下：

1.水稻叶片基因组DNA提取：

根据检测需要从水稻叶片组织抽提基因组DNA，其中水稻幼嫩叶片DNA抽提采用康为植物基因组抽提试剂盒标准流程抽提。

2.DNA样品质量检测：

用Nanodrop分光光度计测量基因组DNA中蛋白质和有机物质污染水平，基因组DNA的A260/280比值应在1.8-2.0之间，A260/230比值应在1.8-2.2之间，DNA工作液浓度为10ng/μl。

3.基因型检测：

利用实施例1得到的16个分子标记的KASP标记引物，按照LGC提供的KASP检测的反应体系和反应程序的标准操作方法进行操作，产生检测样品原始的基因型数据，即样品在特定位点上的基因型的型别，如纯合子hom1(对应基因型AA或TT或CC或GG)，纯合子hom2(对应基因型TT或AA或GG或CC)，标准杂合子het(对应基因型AG或TC或AT或AC或TG或CG)，混杂(Un)或者无扩增杂交信号(Un)。

4.数据分析：

QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System仪器自带的分析软件，参照自定义构建的分型区间，根据图21-图36所示的方式对分子标记的检测效果进行判读分类：(a)纯合子hom1(对应基因型AA或TT或CC或GG)；(b)纯合子hom2(对应基因型TT或AA或GG或CC)；(c)标准杂合子het(对应基因型AG或TC或AT或AC或TG或CG)；(d)混杂(Un)；(e)无扩增信号(Un)。

5.结果比较——基因型检测鉴定结果与实际基因型的比对：

实际的参照基因型为使用样品的DNA，经过illumina芯片检测获得的基因型。将按照上述4个步骤获得的基因分型结果与实际的参照基因型进行比较，结果参见表4、表5以及图5-图20和图21-图36。

6.结论

通过上述5步，结果显示，对于所检测材料的基因型，两种方法检测结果吻合度为97.14％，且分型结果能够将155份材料分为155组，不一致出现在部分KASP标记检测基因型为Het或Un。该结果表明实施例1中筛选得到的16组引物组能够对155份水稻材料进行可靠地分型，提供了可靠的真实性判定结果。与上述同样的操作，在对多个单一个体进行检测时即能够实现纯度检测。

表4 16个KASP标记检测155份亲本的基因型(1)

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表5 16个KASP标记检测155份亲本的基因型(2)

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备注：Hom1是指纯合基因型1，Hom2是指纯合基因型2，其中，

对于F0119312673GA，Hom1为TT，Hom2为CC；

对于R0136269938AG，Hom1为AA，Hom2为GG；

对于F0136380590GA，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于R0206491684CT，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于R0204051573TC，Hom1为TT，Hom2为CC；

对于R0327455062GA，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于R0507762619GC，Hom1为CC，Hom2为GG；

对于F0523332421GA，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于R0601649489CT，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于R0620792855TC，Hom1为CC，Hom2为TT；

对于F0819572912CT，Hom1为AA，Hom2为GG；

对于R0819367050GA，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于R0908001195CT，Hom1为AA，Hom2为GG；

对于R0921310853CT，Hom1为TT，Hom2为CC；

对于F1013749894GT，Hom1为AA，Hom2为CC；

对于F1109053928AG，Hom1为GG，Hom2为AA。

实施例3 16个分子标记在对89份F1品系真实性检测中的应用

为了测试实施例1获得的16个分子标记在水稻F1代中判定真实性的实际效果。收集了89份水稻F1代材料。它们是2020年收获的种子，采用100粒混合取样后，使用康为植物DNA提取试剂盒，获得质量合格的DNA样品，通过前述16个分子标记的基因型检测，获取分型结果，参见图37-图52以及表6和表7。

表6 89份水稻F1检测16个分子标记的基因型信息(1)

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表7 89份水稻F1检测16个分子标记的基因型信息(2)

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备注：Hom1是指纯合基因型1，Hom2是指纯合基因型2，其中，

对于KRCI01S02，Hom1为TT，Hom2为CC；

对于KRCI01S05，Hom1为AA，Hom2为GG；

对于KRCI01S06，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于KRCI02S12，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于KRCI02S15，Hom1为TT，Hom2为CC；

对于KRCI03S05，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于KRCI05S07，Hom1为CC，Hom2为GG；

对于KRCI05S09，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于KRCI06S04，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于KRCI06S05，Hom1为CC，Hom2为TT；

对于KRCI08S01，Hom1为AA，Hom2为GG；

对于KRCI08S03，Hom1为GG，Hom2为AA；

对于KRCI09S01，Hom1为AA，Hom2为GG；

对于KRCI09S03，Hom1为TT，Hom2为CC；

对于KRCI10S05，Hom1为AA，Hom2为CC；和

对于KRCI11S03，Hom1为GG，Hom2为AA。

结果显示，将89份组配F1代利用16个KASP标记基因型分成了87组，其中有4个F1被分别划归为2个F1的两组，总的可鉴别F1的比例为95.5％。其中，有82个F1组合在16个标记中的多态性标记数目不低于6个，最多的多态性标记在9个，多态性超过9个的组合有47个，占到了一半以上。

上述结果表明，本发明提供的16个分子标记能够帮助水稻在F1代组配过程中对材料真实性进行监测，同样的操作，在对多个单一个体进行检测时就能够实现纯度检测。对保障种子F1代组配繁种质量具有积极贡献。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。