肝素结合蛋白定量检测的样本缓冲液、制备方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫学检测领域，具体地，涉及一种肝素结合蛋白定量检测的样本缓冲液、制备方法及试剂盒。

背景技术

目前，市面上检测HBP的检测方法学主要有免疫比浊法、荧光免疫层析半定量法等方法。

现有公开号为CN113189341A的中国专利，其公开了一种用于检测样品中肝素结合蛋白的试剂盒。所述试剂盒包括：用于预处理样品的预处理试剂和用于识别肝素结合蛋白的识别试剂，所述预处理试剂包括溶血剂和电解质，其中，所述溶血剂是浓度为1-3mg/mL的TritonX-100，所述电解质是浓度为30-60mg/mL的氯化钠，并且所述预处理试剂的pH值为5.5～6.5。该专利的免疫比浊方法存在操作复杂、耗时长等缺点，并且不能进行床旁检测。

现有公开号为CN113484525A的中国专利，其公开了一种肝素结合蛋白(HBP)时间分辨荧光免疫层析半定量检测试纸条，包括试纸条本体，所述试纸条本体根据时间分辨荧光微球偶联的HBP标记抗体进行检测；所述试纸条本体两端分别设有检测线和质控线，所述检测线的点样成分为与所述时间分辨荧光微球偶联的HBP标记抗体配对的HBP抗体，所述质控线的点样成分为羊抗小鼠IgG。该专利的荧光免疫层析半定量法存在准确度和稳定性不高的局限性。

发明人认为需要提供一种既能简化工艺、节约成本，又能反应更充分，极高的提升反应灵敏度、精密度的肝素结合蛋白定量检测的试剂盒。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种肝素结合蛋白定量检测的样本缓冲液、制备方法及试剂盒。

根据本发明提供的一种肝素结合蛋白定量检测的样本缓冲液,所述样本缓冲液包括含有荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体和荧光微球偶联的兔IgG的磷酸盐缓冲液。

优选地，所述样本缓冲液的pH为7.0-7.4。

优选地，所述荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体的浓度为0.1mg/mL～1mg/mL，所述荧光微球偶联的兔IgG的浓度为0.1mg/mL～0.5mg/mL。

优选地，所述荧光微球包括时间分辨荧光微球、胶乳微球、荧光素、量子点。

根据本发明提供的一种制备所述肝素结合蛋白定量检测的样本缓冲液的方法，使用荧光微球标记鼠抗人HBP单克隆抗体形成所述荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体，使用荧光微球标记兔IgG形成所述荧光微球偶联的兔IgG，然后使用磷酸盐缓冲液进行稀释。

优选地，所述荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体的标记方法包括以下步骤：

步骤A1，吸取荧光微球，加入尖底离心管中；

步骤A2，加入MES缓冲液和超纯水,混匀；

步骤A3，加入EDC和NHS，混匀后室温避光旋摇；

步骤A4，离心，去上清，加入MES缓冲液重悬荧光微球，并用移液器吹打混匀，超声分散；

步骤A5，加入鼠抗人HBP单克隆抗体，吹打混匀后室温避光旋摇；

步骤A6，加入乙醇胺，吹打混匀后室温避光旋摇；

步骤A7，离心，去上清，加入保存液重悬荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体，并用移液器吹打混匀，超声分散，避光保存。

优选地，其特征在于，所述荧光微球偶联的兔IgG的标记方法包括以下步骤：

步骤B1，吸取荧光微球，加入尖底离心管中；

步骤B2，加入MES缓冲液和超纯水,混匀；

步骤B3，加入EDC和NHS，混匀后室温避光旋摇；

步骤B4，离心，去上清，加入MES缓冲液重悬荧光微球，并用移液器吹打混匀，超声分散；

步骤B5，加入兔IgG，吹打混匀后室温避光旋摇；

步骤B6，加入乙醇胺，吹打混匀后室温避光旋摇；

步骤B7，离心，去上清，加入保存液重悬荧光微球偶联的兔IgG，并用移液器吹打混匀，超声分散，避光保存。

根据本发明提供的一种肝素结合蛋白定量检测的试剂盒，包括上述的肝素结合蛋白定量检测的样本缓冲液，还包括试剂条，所述试剂条包括样品垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸，所述样品垫和所述吸水纸分别位于所述硝酸纤维素膜的两端，所述硝酸纤维素膜上自所述样品垫向所述吸水纸方向依次包被有检测T线和质控C线。

优选地，所述检测T线包被有鼠抗人HBP单克隆抗体，浓度为1～3mg/mL,所述质控C线包被有羊抗兔IgG抗体，浓度为0.5～1mg/mL。

优选地，所述试剂条底部包括支撑底板。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明通过直接在样本缓冲液内制备荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体和荧光微球偶联的兔IgG，无需进行荧光微球的固相化处理，有助于简化工艺、节约成本；荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体和荧光微球偶联的兔IgG在液体环境中直接跟肝素结合蛋白进行反应，此种反应模式相较固相反应更充分，实现对肝素结合蛋白的精准检测，极高的提升反应灵敏度，提高试剂盒检测精密度。

2、本发明通过采用荧光微球进行标记，并且将荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体和荧光微球偶联的兔IgG置于样本缓冲液上而不是固相于独立的结合垫上，为肝素结合蛋白的检测提供了均相反应体系，使得检测精密度、灵敏度以及线性得到了很大的提高。

3、本发明通过定量客观反映HBP的存在，特异性高，重复性好，检测灵敏度高，线性范围宽，为临床诊断及疗效观察和预后判断提供了更有力的实验诊断依据。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明主要体现肝素结合蛋白定量检测的试剂盒的结构示意图。

图中所示：

样品垫1              硝酸纤维素膜2         检测T线3

质控C线4             吸水纸5               支撑底板6

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

根据本发明提供的一种肝素结合蛋白定量检测的样本缓冲液及试剂盒，样本缓冲液包括含有荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体和荧光微球偶联的兔IgG的磷酸盐缓冲液。荧光微球包括但不限于时间分辨荧光微球、胶乳微球、荧光素、量子点等。

样本缓冲液的pH为7.0～7.4。

荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体的浓度为0.1mg/mL～1mg/mL。

荧光微球偶联的兔IgG的浓度为0.1mg/mL～0.5mg/mL。

样本缓冲液的制备方法如下：使用荧光微球标记鼠抗人HBP单克隆抗体形成荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体，使用荧光微球标记兔IgG形成荧光微球偶联的兔IgG，将荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体重悬液和荧光微球偶联的兔IgG分别按照1％～10％和1％～5％的比例进行稀释，所用稀释液为pH为7.0-7.4的磷酸盐缓冲液。

荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体和荧光微球偶联的兔IgG的标记方法包括多种可实现方法，可根据实际应用情况进行调整，本申请通过以下标记方法为例简单说明。

荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体的标记方法包括以下步骤：

步骤A1，吸取50μl的荧光微球，加入1.5mL的尖底离心管中；

步骤A2，加入400μl的MES缓冲液和440μl的超纯水,混匀，MES缓冲液选用50mM，pH:6.0的MES缓冲液；

步骤A3，加入10μl的EDC和100μl的NHS，混匀后室温避光旋摇60分钟，EDC的浓度为20mg/mL，NHS的浓度为20mg/mL，室温一般在10～30℃；

步骤A4，15000RPM，离心15min，去上清，加入1000μlMES缓冲液重悬荧光微球，并用移液器吹打混匀，超声分散1min；

步骤A5，加入鼠抗人HBP单克隆抗体，吹打混匀后室温避光旋摇60分钟；

步骤A6，加入5μl的乙醇胺，吹打混匀后室温避光旋摇60分钟；

步骤A7，15000RPM，离心15min，去上清，加入1000μl保存液重悬荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体，并用移液器吹打混匀，超声分散1min，4℃避光保存，保存液选用2％BSA,pH:9.0的Tris·HCl缓冲液。

荧光微球偶联的兔IgG的标记方法包括以下步骤：

步骤B1，吸取50μl的荧光微球，加入1.5mL的尖底离心管中；

步骤B2，加入400μl的MES缓冲液和440μl的超纯水,混匀，MES缓冲液选用50mM，pH:6.0的MES缓冲液；

步骤B3，加入10μl的EDC和100μl的NHS，混匀后室温避光旋摇60分钟，EDC的浓度为20mg/mL，NHS的浓度为20mg/mL，室温一般在10～30℃；

步骤B4，15000RPM，离心15min，去上清，加入1000μlMES缓冲液重悬荧光微球，并用移液器吹打混匀，超声分散1min；

步骤B5，加入兔IgG，吹打混匀后室温避光旋摇60分钟；

步骤B6，加入5μl的乙醇胺，吹打混匀后室温避光旋摇60分钟；

步骤B7，15000RPM，离心15min，去上清，加入1000μl保存液重悬荧光微球偶联的兔IgG，并用移液器吹打混匀，超声分散1min，4℃避光保存，保存液选用2％BSA,pH:9.0的Tris·HCl缓冲液。

本申请的样本缓冲液内含荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体和荧光微球偶联的兔IgG，与常规试剂条相比，无需进行荧光微球的固相化处理。进一步的，荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体和荧光微球偶联的兔IgG在液体环境中直接跟肝素结合蛋白进行反应，此种反应模式相较固相反应更充分，极高的提升反应灵敏度、精密度。

实施例2

如图1所示，根据本发明提供的一种肝素结合蛋白定量检测的试剂盒，包括实施例1所述的肝素结合蛋白定量检测的样本缓冲液，还包括试剂条，试剂条包括样品垫1、硝酸纤维素膜2以及吸水纸5，样品垫1和吸水纸5分别位于硝酸纤维素膜2的两端，硝酸纤维素膜2上自样品垫1向吸水纸5方向依次包被有检测T线3和质控C线4。试剂条底部包括支撑底板6。层析方向为自样品垫1向吸水纸5方向。

检测T线3包被有鼠抗人HBP单克隆抗体，浓度为1～3mg/mL,质控C线4包被有羊抗兔IgG抗体，浓度为0.5～1mg/mL。

通过采用荧光微球进行标记，并且将荧光微球偶联的鼠抗人HBP单克隆抗体和荧光微球偶联的兔IgG置于样本缓冲液上而不是固相于独立的结合垫上，为肝素结合蛋白的检测提供了均相反应体系，使得检测精密度、灵敏度以及线性得到了很大的提高。本申请可以通过定量客观反映HBP的存在，特异性高，重复性好，检测灵敏度高，线性范围宽，为临床诊断及疗效观察和预后判断提供了更有力的实验诊断依据。

在本申请的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。