一种改良石蜡切片结合苯胺蓝染色法观察牡丹花粉管行为的荧光显微方法

技术领域

本发明涉及植物显微技术领域，特别涉及改良石蜡切片结合苯胺蓝染色法观察牡丹花粉管行为的荧光显微方法。

背景技术

牡丹授粉后，花粉管在柱头萌发，形成有含有精细胞和营养核的花粉管，花粉管沿着花柱道下行，在子房中从珠孔进入胚囊，精子和卵细胞的结合，完成受精，这是牡丹完成有性生殖的重要过程，观察此过程，并获得清晰、结构完整有连续行为轨迹的照片，为解析牡丹受精过程、种实发育、远缘杂交障碍等提供依据，因此观察花粉管生长及行为轨迹十分重要。

目前为止，植物花粉管生长过程的观察，主要依靠压片、染色，先用NaOH溶液将植物材料软化，在用苯胺蓝燃料浸染处理，然后压片进行荧光观察。牡丹的胚珠大，传统的压片观察不到花粉管在花柱道及子房中完整的生长过程，也无法获得花粉管进入胚珠的具体时间和形态。传统方法中，植物材料仅是被软化，并不透明，导致镜检时影响观察效果，无法真实地观察到花粉管的生长轨迹和发育过程。且制片过程中使用的液体石蜡易凝固，需要长时间才能与二甲苯混匀；需过夜使用烘箱，对实验室安全造成一定隐患。

本发明要解决的技术问题是克服现有授粉后荧光显微压片观察方法中，因待测材料牡丹子房壁较厚，观察困难或因胚珠较大不得不分割，故无法获得全面的花粉管行为及受精过程完整信息的缺点，目的是提供制片过程安全、制片效果好、花粉管及受精过程清楚可视的牡丹授粉后花粉管行为的荧光显微观察方法。

发明内容

本发明提供一种牡丹授粉后花粉管行为的荧光显微观察方法。由待测材料采样与固定、脱水及透明、浸蜡包埋、切片、粘片及展片、染色、观察等步骤组成，各步骤具体操作如下：

第一步:

材料固定：将待观察牡丹花授粉后的心皮取下作为待检材料，解剖镜下将柱头从狭长带沿背缝线和腹缝线用解剖刀分离为二部分后，浸入卡诺固定液，置于真空干燥器内，待材料沉底，12h后转入体积分数为70％的乙醇溶液中，4℃保存。

卡诺固定液配制方法：体积分数为95％乙醇水溶液和冰乙酸按照体积比为3:1混合。

第二步：

脱水、透明：将固定样本的液体全数倒出，向其中置换不同梯度的脱水剂和透明剂，包括以下步骤：85％乙醇溶液浸泡处理2h、95％乙醇溶液浸泡处理2h、无水乙醇溶液浸泡处理2次，每次1.5h；体积比为1:1的无水乙醇二甲苯混合液浸泡处理2h、透明剂纯二甲苯浸泡处理2次，每次1.5h。

第三步：

浸蜡包埋：将上述纯二甲苯倒出，放入生蜡粉，再加入与生蜡粉等体积的纯二甲苯，不开盖放于60℃恒温箱2h,待生蜡粉融化完全后关闭恒温箱；次日，不开盖放于60℃恒温箱4h后，打开盖子60℃恒温箱4h。之后置换纯石蜡溶液3次：第一次换蜡间隔时间为4h,第二次、第三次换蜡间隔时间为2h，最后一次更换石蜡溶液2h后，将样品从石蜡溶液中取出放于包埋盒中包埋。

第四步：

切片、粘片及展片：将所得的蜡块修整为正梯形，固定于包埋盒，于切片机上操作切片，切片厚度14μm。将切好的蜡带水平展布于涂有郝伯特粘贴剂的载玻片上，并将有蜡带的载玻片置于40℃展片机上加热至完全伸展。

郝伯特粘贴剂配制方法：甲液：1g明胶放入100ml蒸馏水，40℃恒温完全溶解后加入甘油15ml和苯酚2g；乙液：4ml甲醛和100ml蒸馏水，使用时，先滴1滴甲液，在载玻片上涂匀后，再滴2～3滴乙液并铺匀。

第五步：

苯胺蓝染色：依次用二甲苯连续2次、无水乙醇和二甲苯混合液(1:1V/V)、无水乙醇连续2次、95％乙醇、85％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇分别浸泡，每次3min，之后于pH 6.7的缓冲液中漂洗20min，最后放入0.1％苯胺蓝溶液中染色3h。

pH 6.7缓冲液配制方法：1mol.L

0.1％苯胺蓝溶液配制方法：0.1g苯胺蓝、0.71g K

第六步：

荧光显微镜观察：0.1％苯胺蓝溶液染色后不封片，直接放于荧光显微镜下观察拍照。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

牡丹的胚珠大，传统的压片观察无法获得完整的花粉管在花柱道及子房中的生长全过程轨迹，也观察不到花粉管进入胚珠的具体时间和形态，本发明将材料制成石蜡切片后观察，有效克服了现有荧光显微压片方法中牡丹子房壁厚，压片后较难清晰观察花粉管及其在花柱道中行为轨迹及受精过程，及因分割胚珠无法获得完整、全面的受精信息的缺陷。采用本发明的技术方案，不需过夜使用烘箱设备，操作上比传统石蜡切片法更安全。实验效果图证明，采用本发明的技术方案，不仅可观察到花粉管在花柱道及子房中连续的行为轨迹，而且胚珠清晰可见，受精信息全面、完整，能为客观、科学地分析牡丹花粉管行为特点提供可靠的数据和技术支撑。

附图说明

图1为传统的整体子房压片法制作的大花黄牡丹心皮压片。图1中Ov示胚珠，PT示花粉管。

图2为本专利方法制作的大花黄牡丹授粉花柱道切片观察。图2中PT示花粉管。

图3为本专利方法制作的大花黄牡丹授粉胚珠切片观察。图3中所示胚珠即为花粉管进入发生受精的胚珠，Ov示胚珠，PT示花粉管。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1大花黄牡丹授粉后花粉管行为观察

第一步：取大花黄牡丹授粉后雌蕊心皮为待检材料，解剖镜下将柱头狭长带沿背缝线和腹缝线用解剖刀分离为二，浸入卡诺固定液，置于真空干燥器内，待材料沉至容器底部，12h后转入体积分数为70％的乙醇溶液中，4℃保存。

诺固定液配制方法：体积分数为95％乙醇水溶液和冰乙酸混合液(3:1，V/V)。

第二步：脱水、透明：倒出固定样本的全部液体，向容器中置换不同梯度的脱水剂和透明剂，包括以下步骤：85％乙醇溶液浸泡2h、95％乙醇溶液浸泡2h、无水乙醇溶液浸泡2次，每次1.5h；体积比为1:1的无水乙醇二甲苯混合液浸泡处理2h、透明剂纯二甲苯浸泡处理2次，每次1.5h。

第三步：浸蜡、包埋：将上述纯二甲苯倒出，放入生蜡粉，再加入与生蜡粉等体积的纯二甲苯，不开盖放于60℃恒温箱2h,待石蜡粉融化完全后，关闭恒温箱；次日，不开盖放于60℃恒温箱4h后，打开盖子60℃恒温箱4h。之后置换纯石蜡溶液3次：第一次换蜡间隔时间为4h，第二次、第三次换蜡间隔时间为2h，最后一次更换纯石蜡溶液2h后，将样品从石蜡溶液中取出放于包埋盒中包埋。

第四步：切片、粘片及展片：将蜡块修整为正梯形，固定于包埋盒。上切片机切片，切片厚度14μm。将切好的蜡带水平展布于涂有郝伯特粘贴剂的载玻片上，并将载玻片置于40℃展片机上加热至完全伸展。

郝伯特粘贴剂配制方法：甲液：1g明胶放入100ml蒸馏水，40℃恒温完全溶解后加入甘油15ml和苯酚2g；乙液：4ml甲醛和100ml蒸馏水，使用时，先滴1滴甲液，在载玻片上涂匀后，再滴2～3滴乙液，并铺匀。

第五步：苯胺蓝染色：依次用二甲苯连续2次、无水乙醇和二甲苯混合液(1:1v/v)、无水乙醇连续2次、95％乙醇、85％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇分别浸泡，每次3min，之后于pH 6.7缓冲液中漂洗20min，最后放入0.1％苯胺蓝溶液中染色3h。

pH 6.7缓冲液配制方法：1mol.L

0.1％苯胺蓝溶液配制方法：0.1g苯胺蓝、0.71g K

第六步：荧光显微镜观察：0.1％苯胺蓝溶液染色后不封片，直接放于荧光显微镜下观察拍照。