一种酮还原酶及其制备高光学纯度β-3肾上腺素能激动剂中间体的方法

技术领域

本发明涉及生物酶催化领域，具体地说涉及一种酮还原酶及其制备高光学纯度β-3肾上腺素能激动剂中间体的方法。

背景技术

膀胱过度活动症(OAB)是排尿功能障碍常见的临床表现之一，以尿急症状为主要特征，常伴有尿频和夜尿增多，可伴或不伴有急迫性尿失禁。该症状随着年龄的增长呈现显著升高的趋势。OAB在全球范围内发病率逐年增高，其严重影响患者的工作和正常生活。

在过去的几十年中，抗毒蕈碱药是治疗OAB的主要手段，是能够缓解其引起的各种症状，但该类药物对部分膀胱过度活动症效果不佳，且存在较多不良反应，如口干、视力模糊、头晕以及认知障碍等。维贝格龙(Vibegron)作为一种具有很强选择性的新型小分子β-3肾上腺素受体激动剂，对β-3肾上腺素受体的亲和力较其他两种β-1和β-2受体高约9000倍，与膀胱平滑肌β-3受体结合可明显松驰膀胱逼尿肌，增加膀胱容量，使膀胱能容纳更多的尿液，减轻OAB症状。维贝格龙相较于传统抗毒蕈碱类药物不良反应轻微，患者更容易接受，为OAB症患者提供了更多的治疗选择。

式II化合物(化学名称：叔丁基((1R,2R)-1-羟基-1-苯基己基-5-炔-2-基)氨基甲酸酯，英文名称：tert-butyl((1R,2R)-1-hydroxy-1-phenylhex-5-yn-2-yl)carbamate是制备维贝格龙的重要中间体，该化合物手性纯度决定维贝格龙成品的产品质量，该分子结构复杂，存在两个手性中心，连化学合成污染严重且难度较高。该结构存在两个手性中心，其中一个手性中心连有羟基基团，另一个手性中心连有NHBoc基团。一条有效途径是可将式I(叔丁基(1-氧-1-苯己-5-炔基-2-酰基)氨基甲酸酯，英文名：tert-Butyl(1-oxo-1-phenylhex-5-yn-2-yl)carbamate)中的羰基键选用酮还原酶还原为的羟基，且为R构型，而连有NHBoc基团手性中心在高pH下可转为R构型，因此选用酮还原酶也应耐受高pH。

目前维贝格龙主要通过化学法制备，以(4S,5R)-4-甲酰基-2,2-二甲基-5-苯基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯为起始底物通过Witting反应、氢化反应、酰化反应等合成制备，反应复杂，条件苛刻。WO2014150639A1申请公开了选用固定化酮还原酶制备叔丁基((1R,2R)-1-羟基-1-苯基己基-5-炔-2-基)氨基甲酸酯，底物浓度50g/L，反应28h，转化率98％，e.e.值99％，dr值100:1，但底物投加量较低。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种高立体选择性催化的R型酮还原酶，可用于将叔丁基(1-氧-1-苯己-5-炔基-2-酰基)氨基甲酸酯还原为叔丁基((1R,2R)-1-羟基-1-苯基己基-5-炔-2-基)氨基甲酸酯；本发明还有一个目的是提供包含前述酮还原酶的基因序列；本发明还有一个目的是提供含有前述酮还原酶基因序列的表达载体及其宿主细胞；本发明还有一个目的是提供前述酮还原酶催化底物制备β-3肾上腺素受体激动剂中间体上的应用；本发明还有一个目的是提供将前述R型酮还原酶制备固定化酶生物催化制备β-3肾上腺素受体激动剂中间体的方法。

发明内容：本发明提供的一种酮还原酶具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3任意一条氨基酸序列。作为优选方案，所述酮还原酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

利用所述酮还原酶可生物催化底物叔丁基(1-氧-1-苯己-5-炔基-2-酰基)氨基甲酸酯(化合物I)，以制备具有高光学纯度的β-3肾上腺素受体激动剂中间体((1R,2R)-1-羟基-1-苯基己基-5-炔-2-基)氨基甲酸(化合物II)。

本发明提供的酮还原酶是基于中国专利申请CN111235123A公开的羰基还原酶CX-LAC II，对其氨基酸序列定点突变设计获得的。在本申请中，CX-LAC II对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。所述定点突变至少包括在SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的第40位、第94位和第190位进行突变，特别是将第40位的H突变为R，第94位的F突变为P，第190位的Y突变为P，通过基因工程技术构建表达载体通过感受态宿主细胞表达，获得的酮还原酶在pH为10-10.5的情况下均具有不低于99％的e.e.，但d.r.值和转化率仍有上升空间。

作为本发明的优选方案，所述定点突变还包括在SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的第206位和/或第249位进行突变，特别是将第206位的N突变为F，以及将第249位的Y突变为W，获得的酮还原酶在pH为10-10.5的情况下e.e.可达到99.5％以上，且显著改善了转化率和d.r.值，转化率可达到85％左右，产物主要构型为(1R,2R)。

基于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3对应的酮还原酶，本发明还提供包含编码这些酮还原酶基因序列的重组质粒。通过构建重组质粒，加入到感受态宿主细胞获得表达所述酮还原酶的工程菌株。

所述重组质粒选用包括但不限于pET、pGEX、pMAL任意一种载体，优选pET-28质粒；所述宿主细胞选用包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母的任意一种，大肠杆菌细胞生长繁殖速度快且BL21(DE3)适用于高效表达外源基因，因此优选大肠杆菌作为宿主细胞。

本发明还提供了一种固定化酮还原酶，包括固定化载体和前述酮还原酶，所述固定化载体为酶吸附树脂载体和/或酶共价结合固定化载体。优选地，所述固定化载体为酶共价结合固定化载体，特别是氨基树脂载体。同理，利用所述固定化酮还原酶也可生物催化底物叔丁基(1-氧-1-苯己-5-炔基-2-酰基)氨基甲酸酯(化合物I)，获得具有高光学纯度(1R,2R)产物的同时，也提高了产率，并在生产中对高pH和高底物浓度的耐受性得以增强，特别是在pH大于10.4以后，为经固定化处理的酮还原酶的酶活呈下降趋势，而固定化酮还原酶的酶活在pH 10.8之前不会降低，d.r.值最高可达100:1。高pH耐受可显著改善含有NHBoc的手性中心转化为R构型的光学纯度，对所述β-3肾上腺素受体激动剂中间体的制备具有重要意义。

基于前述的酮还原酶，本发明提供的一种β-3肾上腺素受体激动剂中间体的制备方法，包括如下步骤：

(1)将所述酮还原酶的宿主细胞超声破碎，分离，获得粗酶液；

(2)将活化后的氨基树脂载体与所述粗酶液按比例混合，制备固定化酮还原酶；

(3)在包含底物、缓冲液、NADPH和异丙醇的反应体系中，加入所述固定化酮还原酶，反应温度为30-50，℃pH为10-11，获得e.e.％不低于99％的(1R,2R)产物；

其中，所述底物为式(I)所示化合物，所述产物为式(II)所示化合物：

所述步骤(2)中，将氨基树脂载体在碱性缓冲液中加入戊二醛搅拌或振荡，洗涤后获得所述活化后的氨基树脂载体。

进一步地，所述活化的氨基树脂载体与所述粗酶液按1:5～10的质量比混合，20～30℃，150-200rpm振荡24小时。

进一步地，所述底物浓度为100-300g/L，优选在150-200g/L。

所述的缓冲液选用包括但不限于硼砂缓冲液、三乙醇胺、Tris-HCl缓冲液任意一种或多种的组合。优选采用三乙醇胺缓冲液。优选采用三乙醇胺缓冲液。

所述NADPH的摩尔浓度为0.1-1.0mmol/L。

所述固定化酮还原酶与底物的质量比为0.5-1:1，

所述异丙醇的投料比为40％-80％(m/v)，更优选的为70％(m/v)。

技术效果：本发明利用定点突变获得的菌株发酵获得生物酶，经制备成固定化酶后，其可用于在高浓度异丙醇及pH体系下催化高浓度叔丁基(1-氧-1-苯己-5-炔基-2-酰基)氨基甲酸酯底物，转化结束后固定化酶经抽滤可与转化液直接分离，重复用于下一批转化，该方法无需引入其他助溶剂或游离酶蛋白等杂质，整个过程操作方便、产物分离更简单，且固定化酶可重复利用。

附图说明

图1为实施例4不同pH对固定化酮还原酶及游离酶的影响；

图2为实施例5不同浓度异丙醇对游离酶及固定化酶影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

1.酮还原酶菌株构建

以中国专利申请CN111235123A所记载的CX-LAC II基因组为模版，设计如下引物：

正向引物(IRED-P-Nde I)：5’-GGAATTCCATATGAGTAATCGTCTGAAA-3’；

反向引物(IRED-R-Xho I)：5’-CCGCTCGAGTTATTGAGCAGTGTAACC-3’。

然后进行PCR扩增，反应条件为94℃预变性5min，然后30个循环(94℃30s，59℃30s，72℃1.5min)，72℃再延伸10min。

PCR完毕后进行凝胶验证和产物回收。随后将目的片段与pET-26b(+)质粒分别进行由Nde I和Xho I组成的双酶切体系进行酶切，反应结束后进行酶切产物的回收，然后将酶切后的目的片段和pET-26b(+)载体按一定比例混合，加入含有DNA连接酶的溶液于16℃进行连接反应。

将连接产物加入大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行转化，冰浴30min后迅速转移至水浴锅中42℃热激60s，冰浴2min后于超净台中加入500μL无菌无抗性的LB液体培养基进行孵育。孵育后取适量菌液均匀地涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养基的平板上培养，挑取单克隆菌落至4mL卡那抗性的LB液体培养基中，37，℃220rpm培养14h，以该菌液为模板进行PCR验证。PCR验证成功后进行重组质粒抽提，提取的质粒分别进行酶切和测序，验证获得重组酮还原酶克隆菌株，其表达的氨基酸序列KRED I如SEQ ID NO:6所示。

2.酮还原酶表达菌株构建

对KRED I进行定点突变，获得如下几组突变型：

(1)KRED II_1：突变位点H40R，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

(2)KRED II_2：突变位点H40R,F94P，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

(3)KRED II_3：突变位点H40R,F94P,Y190P，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

(4)KRED II_4：突变位点H40R,F94P,Y190P,N206F，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

(5)KRED II_5：突变位点H40R,F94P,Y190P,N206F,Y249W，氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示；

以上序列经密码子优化后委托安徽通用生物股份有限公司合成重组载体pET-26b(+)-KRED II，导入大肠杆菌BL21 star(DE3)感受态细胞中进行转化，冰浴30min后，45℃水浴热激90s，再冰浴2min后将菌液均匀地涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养基的平板上，37℃培养18h后挑取单克隆菌落至4mL卡那抗性的LB液体培养基中，37，℃220rpm培养14h，即获得相应的表达菌株。

3.酮还原酶粗酶液制备

将上述菌株分别接入4mL含卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中，37，℃180rpm培养12小时后，将菌液全部接种至600mL TB液体培养基中，37，℃180rpm培养至OD600至2左右，加入终浓度为0.3mM的IPTG进行诱导，25℃诱导16h。然后5000rpm离心20分钟收集含酮还原酶的菌体，将30g菌体用70g磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH 7.0)重悬，超声破碎后10000rpm离心5min，取上清，即得到酮还原酶粗酶液。

实施例2

以叔丁基(1-氧-1-苯己-5-炔基-2-酰基)氨基甲酸酯为底物，验证不同突变型工程菌株的酶活性及对底物选择性。

配制反应体系如下：100mL体系：加入3g叔丁基(1-氧-1-苯己-5-炔基-2-酰基)氨基甲酸酯，加入30％(m/V)异丙醇，40℃搅拌，10mg NADP+，用三乙醇胺缓冲液(100mmol/L，pH 10.0)定容至100mL，加入2g粗酶液。反应16h，高效液相色谱HPLC检测转化率及产物手性值。结果如表1所示，可见将原始序列SEQ ID NO:6中的第40位的H突变为R，第94位的F突变为P，第190位的Y突变为P，第206位的N突变为F,第249位的Y突变为W，转化率达到88.5％，e.e.值＞99.5％，d.r.值＞100:1，达到了较为理想的转化率和手性纯度。

表1氨基酸序列突变位点酶活比较

注：“-”表示未检测，e.e.值表示对映异构体过量值，d.r.表示非对映异构体比值。

实施例3

1.氨基树脂固定化载体活化

a.按10g氨基树脂LX-1000NH载体加入40mL 0.1M PBS缓冲液(pH 4.2-4.5)，在温度20-25℃，转速150rpm，搅拌或振荡15min，结束后用4M NaOH溶液调pH 8.0，弃液体；

b.加入40mL 0.02M的PBS缓冲液(pH 8.0)，在温度20-25℃，转速150rpm，搅拌或振荡5min，弃液体；

c.加入40mL 0.02M的PBS缓冲液(pH 8.0)，再加入1.6mL 50％的戊二醛(即戊二醛的使用浓度为2％)，在温度20-25℃，转速150rpm，搅拌或振荡60min，弃液体，然后用0.02MPBS洗两遍，抽干液体即得固定化载体，备用。

2.酮还原酶固定化

取1g上述活化好的LX-1000NH树脂载体，加入10g酮还原酶粗酶液，25℃，180rpm振荡交联20h，抽滤水洗三次，再用0.02M PBS pH8.0的缓冲液，0.5M NaCl，150rpm，搅拌或振荡45min，然后用0.02M PBS pH8.0的缓冲液洗2次，抽滤即得固定化酶。

实施例4

配制100mL固定化酶反应体系如下：加入3g叔丁基(1-氧-1-苯己-5-炔基-2-酰基)氨基甲酸酯，加入30％(m/V)异丙醇，40℃搅拌，10mg NADP+，用不同pH三乙醇胺缓冲液(100mmol/L，pH10.0-11.0)定容至100mL，加入5g实施例3制备的KRED II_1固定化酮还原酶。反应16h，高效液相色谱HPLC检测转化率。

游离酶反应体系如下：100mL体系：加入3g叔丁基(1-氧-1-苯己-5-炔基-2-酰基)氨基甲酸酯，加入30％(m/V)异丙醇，40℃搅拌，10mg NADP+，用不同pH三乙醇胺缓冲液(100mmol/L，pH10.0-11.0)定容至100mL，加入2g实施例1获得的KRED II_1酮还原酶粗酶液。反应16h，高效液相色谱HPLC检测转化率。

由图1可知，游离酶在pH 10.0-10.4之间，随着pH升高转化率呈上升趋势，但当pH大于10.4转化率呈下降趋势，表明游离酶在该pH区间的耐受性不及固定化酶；固定化酶pH10.6转化率最高达99.5％，且相较于游离酶可耐受更高pH及较为理想的转化率。

实施例5

由于叔丁基(1-氧-1-苯己-5-炔基-2-酰基)氨基甲酸酯溶解性较差，若想做高底物浓度转化体系，可提高异丙醇浓度。一方面异丙醇做为氢供体是必须要添加的，另一方面高浓度的异丙醇可作为助溶剂，这样可避免引入其他有机溶剂，减少杂质和后分离步骤。

固定化酶反应体系如下：100mL体系：加入15g叔丁基(1-氧-1-苯己-5-炔基-2-酰基)氨基甲酸酯，加入不同浓度(m/V)异丙醇，45℃搅拌，20mg NADP+，用三乙醇胺缓冲液(500mmol/L，pH 10.6)定容至100mL，加入10g KRED II_1固定化酶。反应30h，高效液相色谱HPLC检测转化率。

游离酶反应体系如下：100mL体系：加入15g叔丁基(1-氧-1-苯己-5-炔基-2-酰基)氨基甲酸酯，加入不同浓度(m/V)异丙醇，45℃搅拌，20mg NADP+，用不同pH三乙醇胺缓冲液(500mmol/L，pH 10.4)定容至100mL，加入3g KRED II_1粗酶液。反应30h，高效液相色谱HPLC检测转化率。

由图2可知，游离酶转化体系中异丙醇浓度超过50％，酶活明显受抑制，且高底物浓度反应30h底物残留较高；固定化酶转化体系在60％-80％异丙醇浓度下，转化率均大于99％。

实施例6 1L转化体系

加入150g叔丁基(1-氧-1-苯己-5-炔基-2-酰基)氨基甲酸酯，加入70％(m/V)异丙醇，45℃搅拌，待底物溶解后，加入0.2g NADP+，用三乙醇胺缓冲液(500mmol/L，pH10.6)定容至1L，加入100g KRED II_1固定化酶。反应30h，高效液相色谱HPLC检测转化率99.5％，e.e.值99.8％，d.r.值>100:1。

实施例7 300L转化体系

加入45kg叔丁基(1-氧-1-苯己-5-炔基-2-酰基)氨基甲酸酯，加入210kg异丙醇，45℃搅拌，待底物溶解后，加入60g NADP+，40kg三乙醇胺缓冲液(500mmol/L，pH10.6)，加入30kg KRED II_1固定化酶。反应30h，高效液相色谱HPLC检测转化率99.6％，e.e.值99.8％，d.r.值>100:1。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。