一种耐碱微生物、菌剂及其在火山石硅铁浸提中的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种耐碱微生物、菌剂及其在火山石硅铁浸提中的用途。

背景技术

矿物风化是地球表面各种地貌形态和土壤形成的基础，动植物及微生物对矿物的风化作用是其中最重要的组成部分之一。风化作用是指岩石矿物在物理化学或生物因素下，岩石结构成分遭到机械破碎后裂解形成小颗粒或者溶解后形成生物矿的过程，是发生在地球表面的最重要的一种地球化学作用。岩石风化根据发生的原因可以分为物理风化作用、化学风化作用和生物风化作用。物理风化作用包括地壳运动、温度变化、雨水冲刷、冰冻等因素引起的岩石风化，是指地球表面岩石发生机械破碎，但不改变其化学成分，也没有新矿物产生的作用。化学风化作用是指地球岩石表面受到了H

微生物能够通过自身的生长和代谢作用，以及分泌出的一些胞外物质加速矿物的溶解，微生物风化是生物风化很重要的一个方面。微生物在岩石或是单一矿物的风化过程中所起的作用是微生物的活动能够导致不同类型的岩石或是矿物的成分发生改变，而改变的成分主要是一些重要的元素如Si、Al、Fe、Mg、Ca等。经微生物诱导形成的矿物主要是微生物的生理代谢过程中的副产物，由于微生物活动改变了矿物形成的微环境，进而促进了矿物的形成。另外，工业上细菌矿物风化被用来生物冶金，它可以利用细菌分泌的胞外多糖物质使金属被腐蚀，从而被生物浸出，最后得到珍贵的金属。

金属浸提是用于金属提取与回收的一种新兴生物技术。铁和硅是工业生产中必不可少的元素，细菌浸出是利用微生物及其代谢产物氧化、溶浸矿石中的目的组分的浸出方法。但现有的金属浸提技术还存在浸出率低、生长周期长、培养条件复杂、培养原料不易获得等缺点。关于利用细菌浸出金属采用的微生物一般为嗜酸性微生物，并不适合在碱性环境的金属浸提。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种耐碱微生物、菌剂及其在火山石硅铁浸提中的用途，具有适合碱性环境金属浸提、浸出率高、成本低、生长周期短、工艺培养条件简易、原料易得、有利于环境保护等优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供一种耐碱微生物，名称为单纯周芽孢杆菌WS-L19(Peribacillussimplex WS-L19)，保藏编号为CCTCC NO:M 2022767，保藏时间为2022年5月31日，现保藏于中国典型培养物保藏中心。地址为：中国武汉，武汉大学。

本发明提供的耐碱微生物是从黑龙江省黑河市五大连池尾山火山石样品中培养分离并经过筛选传代得到的菌株。菌体呈杆状，耐碱，革兰氏染色呈阳性，大小为2.5-3.0μm×0.6-0.8μm，表面光滑，可以用于碱性条件的金属浸提，该技术为火山石硅铁浸提提供了新的方法。

相比于现有技术，本发明提供的微生物具有较好的耐碱性，可在碱性环境中生长。且该工艺培养条件简易，原料易得，利于环境保护。与传统冶炼技术相比，采用本发明提供的微生物进行冶炼具有成本低，环境污染小的优点。

本发明提供一种菌剂，包括上述耐碱微生物和/或上述耐碱微生物的发酵液。菌剂中，除了耐碱微生物和/或上述耐碱微生物的发酵液外，还可以添加其他物质，其他物质可以为利于保存、利用的物质或者其他菌株以利于复配等。

本发明的菌剂是一种中温细菌，可以在20-40℃范围内生长，合适生长温度为30-35℃，最适生长温度为35℃，可以在中性及碱性条件下生长，合适生长pH为6.00-11.00，最适生长pH为7.00，培养条件简单。所产生的铁载体能够在低Fe环境中，通过铁载体与三价铁特异性结合，提高对Fe的吸收和利用效率。

本发明相比于同类金属浸出微生物，可以避免在碱性环境下硅、铁浸出困难的问题，且本菌剂是天然富集得到，具有稳定性好的优点。且本发明提供的菌剂培养条件简单，浸出效率高，可以进行工业化生产。

本发明提供一种上述耐碱微生物的发酵方法，包括以下步骤：将上述耐碱微生物接种培养基，发酵培养。

培养基可以LB培养基，发酵培养的pH为5.00-11.00(优选地，pH为6.00-11.00；最优地，pH为7.00)，发酵培养温度为20-40℃(优选地，适合生长的培养温度为35℃左右，适合浸提的培养温度为36.6℃)。

采用上述条件有利于上述耐碱微生物的生长。

本发明提供上述耐碱微生物在矿物冶炼或金属浸提中的应用。

进一步，用于硅、铝、铁、镁、钙中的一种或几种的组合矿物冶炼或金属浸提。

例如：本发明提供上述Peribacillus simplex WS-L19在火山石硅、铁浸提中的用途，以便于从火山石中提取矿物，为矿物浸提提供了新思路。

本发明提供上述菌剂在矿物冶炼或金属浸提中的应用。

进一步，用于硅、铝、铁、镁、钙中的一种或几种的组合矿物冶炼或金属浸提。

本发明提供的微生物或菌剂，可以适用于碱性条件，具有浸出率高、稳定性好、成本低、生长周期短、工艺培养条件简易、原料易得、有利于环境保护等优点。

本发明提供一种矿物冶炼或浸提金属的方法，包括以下步骤：采用上述耐碱微生物或上述菌剂矿物冶炼或浸提金属。

进一步，通过矿物冶炼或金属浸提获得硅、铝、铁、镁、钙中的一种或几种的组合。

进一步，将上述耐碱微生物或上述菌剂接到培养基中，将火山石加入到培养基中，发酵培养。

例如：使用时，将火山石在上述微生物的培养基中发酵培养浸出。可以按以下步骤进行火山石硅、铁的浸提。

优选地，浸出条件优化可以为：培养基初始pH值为6.00-9.00(优选地，培养基初始pH为7.00)，培养温度为20-40℃(优选地，发酵培养温度为30-40℃)，发酵培养时间为6-9d，接种量为1％(v/v)，火山石添加量为2％(w/v)，体系装液量为50％(v/v)。

采用上述条件有利于所述微生物产酸、产铁载体和形成生物膜能力，为侵蚀火山石提供了条件。

附图说明

图1为Peribacillus simplex WS-L19革兰氏染色图。

图2为火山石接菌前后扫描电镜图(注：a为火山石电镜图片；b为火山石在Peribacillus simplex WS-L19侵蚀作用下的电镜图片)。

图3为Peribacillus simplex WS-L19的系统发育树图。

具体实施方式

本发明技术方案除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。

本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明不局限于以下列举具体实施方式或实施例，还包括具体实施方式或实施例间的任意组合。

本发明克服了碱性环境下细菌浸出领域受到的制约问题，提供了一种耐碱微生物。

该耐碱微生物采集自五大连池火山群中尾山的火山石样品，利用传统分离技术与分子鉴定相结合的方式富集分离出19株的可培养微生物，将过筛获得的2mm左右火山石为供试岩石，100mL三角瓶中分装50mL 10％LB培养基，加入0.5g火山石，120℃灭菌20min。将获得的风化细菌分别接种于50mL培养基中培养12-24h，离心(8000rpm，2min)收集菌体后，用生理盐水洗涤3次后重悬于生理盐水中，调节OD

经鉴定该微生物为单纯周芽孢杆菌WS-L19(Peribacillus simplex WS-L19)，具有如下特征：菌体呈杆状，革兰氏染色呈阳性(图1)，尺寸为2.5-3.0μm×0.6-0.8μm；有较强的产酸能力，在10％LB固体培养基上呈现淡黄色圆形菌落，菌落直径为0.3-0.8mm，表面光滑。Peribacillus simplex WS-L19具有较强的耐碱性，可以在pH值为6.00-11.00的范围内正常生长，在pH值为7.00最适生长，Peribacillus simplex WS-L19是一种中温细菌，可以在20-40℃范围内生长，合适生长温度为30-35℃，最适生长温度为35℃左右，适合浸提的温度为36.6℃左右。能够在盐度为0.05-3％的范围内正常生长，具有较好的盐耐受能力。研究发现Peribacillus simplex WS-L19具有产酸、产铁载体和形成生物膜能力，为侵蚀火山石提供了条件。

本发明提供了一种菌剂，包括上述耐碱微生物和/或上述耐碱微生物的发酵液。

本发明提供一种利用上述微生物或菌剂矿物冶炼或浸提金属的方法，包括以下步骤：将火山石置于含有上述微生物或菌剂的培养基中，浸出硅、铝、铁、镁、钙。

具体操作为：将上述微生物或菌剂接种到培养基中，将火山石加入到接种微生物或菌剂的培养基中，发酵培养。在Peribacillus simplex WS-L19侵蚀火山石初期，发酵体系pH逐渐增加，培养液中OH

例如，可以采用以下方法：将2％(w/v)火山石加入到含有Peribacillus simplexWS-L19的培养基中浸出，浸出时培养基的温度为36.6℃，培养基浓度为30.9％LB培养基，浸出时培养基初始pH值为7.00；将获得的风化细菌分别接种于50mL培养基中培养12-24h，离心(8000rpm，2min)收集菌体后，用生理盐水洗涤3次后重悬于生理盐水中，调节OD

采用上述的参数有利于加快菌体生长繁殖速率，缩短培养时间。

在具体的实施过程中，可以按照以下比例配置特定的浓度。

本发明的技术方案培养基的配制方法包括以下步骤：

LB培养基：按以下比例配制，氯化钠10.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，蒸馏水1L，以0.1M氢氧化钠溶液调节pH至7.0±0.2，在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min。

10％LB培养基：按以下比例配制，LB培养基100mL，蒸馏水900mL，0.1M氢氧化钠溶液调节pH至7.0±0.2，在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min。

实施例1耐碱微生物分离鉴定

采集黑龙江省五大连池尾山的火山石样品，将5g火山石置于50mL无菌水中，120rpm，30℃，富集2h，取出富集液作为原菌液稀释10

将纯化后的菌种进行筛选，筛选方法包括以下步骤：以过筛获得的2mm左右火山石为供试岩石，10％LB培养基为火山石侵蚀试验的培养基，以发酵液中的Fe和Si含量的增加作为火山石侵蚀的标志。结果发现，其中编号为WS-L19的菌株培养液中Fe和Si含量显著高于其他可培养细菌。

将菌株WS-L19进行16S rRNA基因鉴定，鉴定方法包括以下步骤：挑取适量单菌落溶于1mL ddH

采取上述鉴定方法鉴定该微生物属于Peribacillus属，将其命名为单纯周芽孢杆菌WS-L19(Peribacillus simplex WS-L19)。于2022年5月31日将Peribacillus simplexWS-L19保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2022767，地址为：中国武汉，武汉大学。

发明人进一步研究，结果表明，Peribacillus simplex WS-L19对火山石的侵蚀机制主要是以酸解作用、碱解作用、生物膜作用、铁载体作用等方式。Peribacillus simplexWS-L19产生的琥珀酸、丙酸、乳酸等有机酸中的氢离子可能与岩石发生离子交换，通过生物作用和酸解作用相结合的方式将火山石中Fe等元素大量溶出。

实施例2

LB培养基培养是配方包括：氯化钠10.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，蒸馏水1L，用蒸馏水调整LB培养基浓度为30.9％，接种量为1％(v/v)，装液量为50％(v/v)，火山石添加量为2％(w/v)，转速为127.2rpm，温度为36.6℃，培养时间为6d。

将培养液初始pH值分别设置为5.00、6.00、7.00、8.00、9.00。Peribacillussimplex WS-L19具有较宽泛的pH生长范围，在pH为5.00-9.00范围内均可生长。当初始pH为7.00时，铁和硅的溶出率较高，分别为2.38％、3.88％。

铁的溶出率计算方法：浸出液中铁的含量/火山石总铁含量×100％。

硅的溶出率计算方法：浸出液中硅的含量/火山石总硅含量×100％。

结果显示，当pH为5.00时，侵蚀初期菌株生长缓慢，说明酸性环境会抑制菌株生长；初始pH为9.00时，Peribacillus simplex WS-L19依然正常生长，说明菌株具有较强的耐碱性。

实施例3

本实施例与实施例2的不同之处是：浸出时培养基初始pH为7.00，培养温度设置为20-40℃，其他步骤与实施例2相同。

实验结果：菌剂生长合适温度为30-35℃，浸出最适温度为36.6℃。

实施例4

按1％(v/v)的接种量将Peribacillus simplex WS-L19菌液(OD

结果显示，在侵蚀时间为0-9d时，火山石中Fe和Si的溶出率随时间逐渐增加。侵蚀时间9d后Fe和Si的溶出率不再增长，溶出率分别为1.66％和2.86％。

铁的溶出率计算方法：浸出液中铁的含量/火山石总铁含量×100％。

硅的溶出率计算方法：浸出液中硅的含量/火山石总硅含量×100％。

实施例5

将Peribacillus simplex WS-L19菌液(OD

结果所示，Peribacillus simplex WS-L19的侵蚀效果随接种量的增加呈现先增大后减小的趋势，且在接种量为1％(v/v)时火山石中Fe和Si的溶出率最高，分别为2.0％和2.7％。

铁的溶出率计算方法：浸出液中铁的含量/火山石总铁含量×100％。

硅的溶出率计算方法：浸出液中硅的含量/火山石总硅含量×100％。

实施例6

采用响应面法对Peribacillus simplex WS-L19侵蚀条件进行优化。响应面存在最大预测值当转速固定130.4rpm，温度为30.0℃，LB培养基浓度为38.2％时，Peribacillussimplex WS-L19对火山石的侵蚀效果较好，Fe溶出量最高，预测发酵液中Fe浓度可达85μg·g

当LB培养基浓度固定在35.2％时，转速为125.6rpm，温度为35.7℃，Peribacillussimplex WS-L19对火山石的侵蚀效果较好，Si溶出量最高，预测发酵液中Si浓度可达1045μg·g

当温度固定为36.6℃，转速为127.2rpm，LB培养基浓度为30.9％时，预测满意高达97.3％，Peribacillus simplex WS-L19对火山石的侵蚀效果最好，获得Fe和Si的溶出量分别为85μg·g

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。