利福霉素的发酵方法及发酵培养基

技术领域

本发明涉及利福霉素制备领域，具体而言，涉及一种利福霉素的发酵方法及发酵培养基。

背景技术

利福霉素类抗生素是1957年由意大利Lepetit公司首先从地中海诺卡氏菌(Amycolatopsis Nocardia)培养中发现的一类抗生素。1959年Sensi等首次从地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis Mediterranei)的发酵液中分离得到利福霉素S，它是第一个用于临床治疗的利福霉素。因产生菌菌种不同，从发酵液中已经分离得到利福霉素A、B、C、D、E、S和SV等各种成分，其中以利福霉素B、S和SV比较重要，而且可以相互转换，随着菌种的变化，主要产物为利福霉素B、利福霉素SV等。

利福霉素B抗菌活性较低，但通过化学方法可以转变为其他抗菌活性较高的衍生物。如经氧化、酸水解及还原，可分别转化成利福霉素O、S及SV。现已分离出能直接产生利福霉素O的链霉菌或诺卡氏菌及直接产生利福霉素SV的变株。中国1972年在土壤里从小单孢菌中找到了利福霉素S产生菌。利福霉素S及SV都广泛被用作制备其它新衍生物的重要原料。20世纪80年代中期前，国际上生产利福霉素主要有意大利、瑞士、韩国和中国等，中国生产利福霉素SV，其他国家厂家均有利福霉素B的生产。后来国内引进利福霉素B菌种，成功进行了试制。据相关报道，工业化生产利福霉素B的发酵放罐浓度约为20g/L而利福霉素SV发酵的放罐浓度仅有7g/L左右。利福霉素B虽然活性较小但其产量高，而且可以通过化学反应转化为其他组分，如S、O以及SV等。目前，工厂中主要生产利福霉素B或SV，然后在此基础上进行化学修饰来获得利福平、利福昔明、利福喷丁等利福霉素衍生药物。

关于提高利福霉素B发酵水平的研究前人做了大量的工作，金一平等《利福霉素B发酵放大Ⅱ.从15L酵罐到7m

关于提高利福霉素发酵水平的现有文献大多是通过菌种诱变、选育、优化培养基配方或培养条件来达到更高产率，先前文献中对发酵过程中的补料研究限于流加碳源和用氨水调控pH，或补入一些消泡剂控制液面，其它补料方法鲜有研究。

菌渣是抗生素生产过程中产生的固体废物，属于危险固废，其主要成分包括菌丝体、剩余培养基、发酵代谢产物和少量残留抗生素。我国是微生物药物生产大国，仅抗生素废渣年产量高达200万吨以上若处理不当，残留的抗生素等药物扩散到环境中，将对饮用水、空气和土壤造成污染，进而影响人类健康与生态平衡。因此，开展微生物制药菌渣的无害化处理与资源化利用以保障环境健康与安全，具有重要的经济和社会意义。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种利福霉素的发酵方法及发酵培养基，以解决现有技术中利福霉素发酵产率低的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种利福霉素的发酵方法，该发酵方法包括：将利福霉素产生菌置于发酵培养基中进行发酵，产生利福霉素；发酵培养基包括利福霉素提取后脚料以及如下任意一种多种：碳源、氮源、无机盐或消泡剂。

进一步地，利福霉素提取后脚料包括菌丝体和/或萃取后浓缩废液；优选地，利福霉素提取后脚料在发酵培养基中的添加量为0.2～80g/L；优选地，利福霉素包括利福霉素B或利福霉素SV；优选地，利福霉素产生菌包括地中海拟无枝酸菌。

进一步地，无机盐包括硝酸钾、磷酸二氢钾、碳酸钙、六水氯化钴或铵盐中的一种或多种；优选地，铵盐包括硫酸铵、氯化铵或硝酸铵中的一种或多种；优选地，在利福霉素产生菌的发酵前中期补加铵盐补充液，其中，发酵前中期指发酵培养基的pH降至7.0之前；优选地，铵盐补充液的补加量为发酵培养基的0.05％～5％(W/V)，铵盐补充液为浓度2％(m/v)至饱和浓度的溶液。

进一步地，碳源包括葡萄糖；优选地，氮源包括黄豆粉、蛋白胨或鱼粉中的一种或多种；优选地，消泡剂包括有机硅消泡剂、聚醚类消泡剂或高碳醇类消泡剂。

进一步地，发酵培养基中：葡萄糖的浓度为50.0～150.0g/L、黄豆粉的浓度为5.0～45.0g/L、蛋白胨的浓度为0～15.0g/L、硝酸钾的浓度为2.5～7.5g/L、磷酸二氢钾的浓度为0.05～0.15g/L、碳酸钙的浓度为2.5～7.5g/L、六水氯化钴的浓度为0.0007～0.0013g/L、铵盐的浓度为1.0～3.0g/L、鱼粉的浓度为0～15g/L、消泡剂的浓度为0.2～1.2g/L、利福霉素提取后脚料的浓度为0.2～80g/L。

进一步地，发酵方法包括：将发酵培养基灭菌后，接种利福霉素产生菌，通气、搅拌培养；在发酵前中期向发酵培养基中补加铵盐补充液和碳源；发酵培养基的pH降至6.3～7.0时，停止补入铵盐补充液，向发酵培养基中加入氨水，维持发酵培养基的pH为6.0～7.0，并向发酵培养基中补入碳源；向发酵培养基中补加氮源和消泡剂，至发酵结束。

进一步地，铵盐补充液在发酵培养至45～65h时开始补加；优选地，铵盐补充液的温度10～60℃；优选地，利福霉素产生菌的接种量占发酵培养基的3～13v/v％；优选地，向发酵培养基中加入氨水，维持发酵培养基的pH为6.3～6.7；优选地，发酵温度为26～32℃；优选地，通气比为0.5～1.5VVM；优选地，罐压为0.02～0.08MPa。

为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种制备利福霉素的发酵培养基，该发酵培养基包括利福霉素提取后脚料以及如下任意一种多种：碳源、氮源、无机盐或消泡剂。

进一步地，利福霉素提取后脚料包括菌丝体和/或萃取后浓缩废液；优选地，发酵培养基中的利福霉素提取后脚料的浓度为0.2～80g/L；优选地，碳源包括葡萄糖；优选地，氮源包括黄豆粉和/或蛋白胨；优选地，无机盐包括硝酸钾、磷酸二氢钾、碳酸钙、六水氯化钴或铵盐中的一种或多种；优选地，铵盐包括硫酸铵、氯化铵或硝酸铵中的一种或多种。

进一步地，发酵培养基包括50.0～150.0g/L葡萄糖、5.0～45.0g/L黄豆粉、0～15.0g/L蛋白胨、2.5～7.5g/L硝酸钾、0.05～0.15g/L磷酸二氢钾、2.5～7.5g/L碳酸钙、0.0007～0.0013g/L六水氯化钴、1.0～3.0g/L铵盐、0～15g/L鱼粉、0.2～1.2g/L消泡剂、0.2～80g/L利福霉素提取后脚料；优选地，消泡剂包括有机硅消泡剂、聚醚类消泡剂或高碳醇类消泡剂。

应用本发明的技术方案，通过在发酵培养基中添加利福霉素提取后脚料，能够提高发酵培养基中的利福霉素的产率。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明实施例1的利福霉素提取后脚料的工艺流程图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

术语解释：

菌丝体：指利福霉素发酵液发酵结束后，利用板框过滤等常规固液分离方法，获得的固体渣。

萃取后浓缩废液：指利福霉素发酵液发酵、固液分离后得到的液体部分，液体部分经萃取后的水相废液。

如背景技术所提到的，关于提高利福霉素发酵水平的现有文献大多是通过菌种诱变、选育、优化培养基配方或培养条件来达到更高产率，先前文献中对发酵过程中的补料研究限于流加碳源和用氨水调控pH，或补入一些消泡剂控制液面，其它补料方法鲜有研究，为此需要提供一种新的发酵方法以提高利福霉素的产率。

本发明通过创新性地在发酵培养基中添加利福霉素提取后脚料，能够提高菌株发酵的利福霉素产量，达到提高发酵产率的目标。因而，在本申请中发明人尝试在利福霉素的发酵方法中，采用包括利福霉素提取后脚料的发酵培养基，对利福霉素产生菌进行发酵，因而提出了本申请的一系列保护方案。

在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种利福霉素的发酵方法，该发酵方法包括：将利福霉素产生菌置于发酵培养基中进行发酵，产生利福霉素；发酵培养基包括利福霉素提取后脚料以及如下任意一种多种：碳源、氮源、无机盐或消泡剂。

在利福霉素提取后脚料中，含有大量可溶性培养基残留物、蛋白质、糖类、色素、发酵代谢中间体和一些活性物质。这些活性物质及发酵中间体有可能是合成利福霉素酶类的诱导物，可能有利于利福霉素的生物合成。本发明在大量试验的基础上，发现在利福霉素发酵培养基中加入利福霉素提取后脚料，利用此种发酵方法，能够提高发酵产率，并减少有机氮源的使用量，降低原料成本。且利福霉素提取后脚料属于危险固废，若处理不当将影响环境。利用利福霉素提取后脚料进行发酵，能够对这种微生物制药菌渣进行无害化处理与资源化利用，保障环境健康与安全的同时，降低培养基成本和危险物后处理成本。

在一种优选的实施例中，利福霉素提取后脚料包括菌丝体和/或萃取后浓缩废液；优选地，利福霉素提取后脚料在发酵培养基中的添加量为0.2～80g/L；优选地，利福霉素包括利福霉素B或利福霉素SV；优选地，利福霉素产生菌包括地中海拟无枝酸菌。

菌丝体为利福霉素发酵液发酵结束后，利用板框过滤等常规固液分离方法，获得的固体渣。菌丝体的含水量较高，在使用时按照折算干重进行计算和投料。萃取后浓缩废液指利福霉素发酵液发酵、固液分离得到的液体部分后，液体部分经氯仿或醋酸丁酯等有机试剂萃取后的水相废液，通过反渗透等方式进行浓缩，获得的浓缩液即为萃取后浓缩废液。根据化学需氧量(COD)能够判断萃取后浓缩废液中需要被氧化的还原性物质的量，即能够从侧面反映萃取后浓缩废液的浓度，COD越高，浓度越大。COD大于5-10g/L即认为浓缩完成。萃取后浓缩废液在投料时按照浓缩液的重量进行计算和投料。

在一种优选的实施例中，无机盐包括硝酸钾、磷酸二氢钾、碳酸钙、六水氯化钴或铵盐中的一种或多种；优选地，铵盐包括硫酸铵、氯化铵或硝酸铵中的一种或多种；优选地，在利福霉素产生菌的发酵前中期补加铵盐补充液，其中，发酵前中期指发酵培养基的pH降至7.0之前；优选地，铵盐补充液的补加量为发酵培养基的0.05％～5％(W/V)，铵盐补充液为浓度2％(m/v)至饱和浓度的溶液。

在发酵前中期补加铵盐补充液，能够降低发酵培养基的pH值，从而使利福霉素产生菌提前进入次级代谢，增加利福霉素的产出时间，从而达到提高发酵产率的目的。在发酵培养基的pH降至7.0之前的发酵前中期，即由于pH未达到适宜的酸性环境，菌株尚处于以初级代谢为主的阶段，补加铵盐补充液即能够提供额外的酸性环境，减少pH下降至7.0所需的时间。不同的温度下，饱和浓度会有变化，可根据生产环境的温度对铵盐补充液的浓度进行灵活调整。

铵盐的饱和浓度受温度影响，因此受环境温度的影响，向发酵培养基中补加的铵盐补充液最大浓度(即饱和浓度)也会发生变化。在10℃下，硫酸铵的饱和浓度为52.52％；在20℃下，硫酸铵的饱和浓度为53.65％；在25℃下，硫酸铵的饱和浓度为54.12％；在30℃下，硫酸铵的饱和浓度为54.59％。向发酵培养基中补入的铵盐补充液的浓度不影响补料效果，可以根据溶液浓度的变化灵活调整补入的溶液体积。发酵条件可以在上述范围内灵活选择。

在一种优选的实施例中，碳源包括葡萄糖；优选地，氮源包括黄豆粉、蛋白胨或鱼粉中的一种或多种；优选地，消泡剂包括有机硅消泡剂、聚醚类消泡剂或高碳醇类消泡剂。高碳醇类消泡剂为C12～C22的碳醇类消泡剂。

在一种优选的实施例中，发酵培养基中：葡萄糖的浓度为50.0～150.0g/L、黄豆粉的浓度为5.0～45.0g/L、蛋白胨的浓度为0～15.0g/L、硝酸钾的浓度为2.5～7.5g/L、磷酸二氢钾的浓度为0.05～0.15g/L、碳酸钙的浓度为2.5～7.5g/L、六水氯化钴的浓度为0.0007～0.0013g/L、铵盐的浓度为1.0～3.0g/L、鱼粉的浓度为0～15g/L、消泡剂的浓度为0.2～1.2g/L、利福霉素提取后脚料0.2～80g/L。

利用包括但不限于上述成分和/或培养基对利福霉素产生菌进行培养，能够发酵获得高产量的利福霉素。利福霉素提取后脚料的质量即为脚料1和脚料2的质量和。菌渣(脚料1)：利福霉素B发酵液板框过滤后的菌丝体，检测后含水率，投料按折干后计算；萃取后浓缩废液(脚料2)：将利福霉素B发酵滤液经氯仿或醋酸丁酯萃取后的废液，投料时按萃取后浓缩废液重量加入。

在一种优选的实施例中，发酵方法包括：将发酵培养基灭菌后，接种利福霉素产生菌，通气、搅拌培养；在发酵前中期向发酵培养基中补加铵盐补充液和碳源；发酵培养基的pH降至6.3～7.0时，停止补入铵盐补充液，向发酵培养基中加入氨水，维持发酵培养基的pH为6.0～8.0，向发酵培养基中加入碳源；向发酵培养基中补加氮源和消泡剂，至发酵结束。

在发酵过程中，在发酵前中期补加铵盐和碳源，使发酵培养基的pH快速下降至6.3-7.0后，即停止加入铵盐。在发酵中，随着菌株的代谢产物产出，发酵培养基的pH值也持续下降，为了保证发酵培养基的pH环境适宜菌株生存，在后续发酵中通过加入氨水，维持发酵培养基的pH值在适合菌株生存的环境。并补加碳源和氮源，以提供菌株代谢和增殖所需的能量。向培养基中加入消泡剂，能够防止培养、搅拌中产生的大量泡沫，影响发酵装置的正常运行。

在一种优选的实施例中，铵盐补充液在发酵培养至45～65h时开始补加；优选地，铵盐补充液的温度为10～60℃；优选地，利福霉素产生菌的接种量占发酵培养基的3～13v/v％；优选地，向发酵培养基中加入氨水，维持发酵培养基的pH为6.3～6.7；优选地，发酵温度为26～32℃；优选地，通气比为0.5～1.5VVM；优选地，罐压为0.02～0.08MPa。

在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种制备利福霉素的发酵培养基，发酵培养基包括利福霉素提取后脚料以及如下任意一种多种：碳源、氮源、无机盐或消泡剂。

在一种优选的实施例中，利福霉素提取后脚料包括菌丝体和/或萃取后浓缩废液；优选地，发酵培养基中的利福霉素提取后脚料的浓度为0.2～80g/L；优选地，碳源包括葡萄糖；优选地，氮源包括黄豆粉和/或蛋白胨；优选地，无机盐包括硝酸钾、磷酸二氢钾、碳酸钙、六水氯化钴或铵盐中的一种或多种；优选地，铵盐包括硫酸铵、氯化铵或硝酸铵中的一种或多种。

该发酵培养基包括葡萄糖50.0～150.0g/L、黄豆粉5.0～45.0g/L、蛋白胨0～15.0g/L、硝酸钾2.5～7.5g/L、磷酸二氢钾0.05～0.15g/L、碳酸钙2.5～7.5g/L、六水氯化钴0.0007～0.0013g/L、铵盐1.0～3.0g/L、鱼粉0～15g/L、消泡剂0.2～1.2g/L、利福霉素提取后脚料0.2～80g/L。优选地，消泡剂包括有机硅消泡剂、聚醚类消泡剂或高碳醇类消泡剂。上述制备利福霉素的发酵培养基中，包括利福霉素提取后脚料，其中含有大量可溶性培养基残留物、蛋白质、糖类、色素、发酵代谢中间体和一些活性物质。这些活性物质及发酵中间体有可能是合成利福霉素酶类的诱导物，有利于利福霉素的生物合成。利用上述培养基，能够提高菌株生存利福霉素的产率。

下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。

下述实施例的菌种选用：生产使用的菌种来源是地中海拟无枝酸菌，母瓶发酵液质量要求为：菌体浓度15％-20％(取一定体积发酵液在离心机进行离心，然后测量上清液体积，菌体浓度＝(发酵液体积—离心后清液体积)/发酵液体积)；镜检无杂菌。

实施例1-5

利福霉素B摇瓶试验：

菌渣(脚料1)：利福霉素B发酵液板框过滤后的菌丝体，检测后含水率62％，投料按折干后计算，

萃取后浓缩废液(脚料2)：将利福霉素B发酵滤液经氯仿或醋酸丁酯萃取后的废液，COD为2.5g/L，经多效浓缩或反膜浓缩5倍，浓缩液COD为8.2g/L；备用，投料时按萃取后浓缩废液重量加入。

采用的菌种是地中海拟无枝酸菌(菌种号：CGMCC4.5720)，培养基配制量取25mL分装于250mL三角烧瓶灭菌后，接入接种量与培养条件：取培养好的母瓶，2.5mL(10％接种量)转种至发酵瓶，28.0℃，220rpm摇床培养，发酵6天结束。

利福霉素提取后脚料的工艺流程图如图1所示。

实施例1-5发酵培养基组成及发酵结束后检测结果如下表1所示：

表1实例1-5发酵培养基组成及试验结果

实施例6-10

利福霉素SV摇瓶试验：

菌渣(脚料1)：利福霉素SV发酵液板框过滤后的菌丝体，检测后含水率65％，投料按折干后计算，

萃取后浓缩废液(脚料2)：将利福霉素SV发酵滤液经醋酸丁酯萃取后的废液，COD为2.3g/L，经多效蒸馏浓缩或膜浓缩5倍，萃取后浓缩废液COD为7.5g/L；备用，投料时按萃取后浓缩废液重量加入；

培养基配制量取25mL分装于250mL三角烧瓶灭菌后，菌种是公司内部保藏的地中海拟无枝酸菌，接入接种量与培养条件：取培养好的母瓶，2.5mL(10％接种量)转种至发酵瓶，28.0℃，220rpm摇床培养，发酵6天结束。实施例6-10发酵培养基组成及发酵结束后检测结果如下表2所示：

表2.实例6-10发酵培养基组成及试验结果

实施例11

22m

首先将一级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后用压差法将已经培养好的地中海拟无枝酸菌接种体500mL用压差接种法，接入一级种子罐中进行培养。培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm，搅拌转速245rpm。至菌体浓度15％、培养时间70h移入二级种子培养基。

二级种子培养：体积1750L，二级种子培养基配方：葡萄糖52.5kg、黄豆粉26.26kg、硫酸铵4.38kg、磷酸二氢钾0.88kg、碳酸钙10.51kg、七水合硫酸镁0.88kg、消泡剂1.06kg。首先将二级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后将已经培养好的一级种子移入二级种子罐进行培养。二级种子培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm：搅拌转速198rpm。

至菌浓浓度15％、培养时间22h移入发酵培养基。发酵培养基体积15000L，发酵培养基配方：葡萄糖750kg、黄豆粉75kg、蛋白胨75kg、硝酸钾56.25kg、磷酸二氢钾0.75kg、碳酸钙37.5kg、六水氯化钴0.0105kg、硫酸铵15kg、鱼粉37.5kg、脚料1(菌丝体)242kg(含水率62％)、消泡剂3kg。先将发酵培养基灭菌，通入无菌空气，冷却至26-32℃，然后将培养好的二级种子450L移入发酵培养基中进行培养。

发酵培养条件为：

a温度26-32℃。

b压力：0.03-0.10Mpa。

c当发酵进行到45h后补入30％(m/v)硫酸铵溶液，补入量为25L。

d当pH降低到6.5，停止补入硫酸铵，补入氨水维持pH6.0-6.5。

e当发酵60h后，补入有黄豆粉50kg、鱼粉25kg。

f发酵进行到100h后补入PPG，一直到发酵结束。

g发酵过程中，溶氧含量控制在20％以上。

发酵周期240h，效价30743U/mL时终止发酵。

实施例12

一级种子培养：体积200L，一级种子培养基配方：葡萄糖7.0kg、黄豆粉4.0kg、硫酸铵0.8kg、磷酸二氢钾0.15kg、碳酸钙1.8kg、七水合硫酸镁0.15kg、消泡剂0.18kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后用压差法将已经培养好的地中海拟无枝酸菌接种体550mL用压差接种法，接入一级种子罐中进行培养。培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm，搅拌转速245rpm。至菌体浓度16％、培养时间72h移入二级种子培养基。

二级种子培养：体积1750L，二级种子培养基配方：葡萄糖61.25kg、黄豆粉35kg、硫酸铵7kg、磷酸二氢钾1.31kg、碳酸钙15.75kg、七水合硫酸镁1.31kg、消泡剂1.58kg。首先将二级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后将已经培养好的一级种子移入二级种子罐进行培养。二级种子培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm：搅拌转速198rpm。

至菌浓浓度15％、培养时间24h移入发酵培养基。发酵培养基体积15000L，发酵培养基配方：葡萄糖1125kg、黄豆粉337.5kg、脚料1菌丝体242kg(含水率62％)、硝酸钾56.25kg、磷酸二氢钾1.13kg、碳酸钙56.25kg、六水氯化钴0.0128kg、硫酸铵22.5kg、鱼粉56.25kg、消泡剂4.5kg。先将发酵培养基灭菌，通入无菌空气，冷却至26-32℃，然后将培养好的二级种子750L移入发酵培养基中进行培养。

发酵培养条件为：

a温度26-32℃。

b压力：0.03-0.10Mpa。

c当发酵进行到46h后补入35％(m/v)硫酸铵溶液，补入量为250L。

d当pH降低到6.5，停止补入硫酸铵，补入氨水维持pH6.2-6.7。

e当发酵65h后，补入黄豆粉100kg、鱼粉50kg。

f发酵进行到100h后补入PPG，一直到发酵结束。

g发酵过程中，溶氧含量控制在20％以上。

发酵周期243h，效价30281U/mL时终止发酵。

实施例13

一级种子培养：体积200L，一级种子培养基配方：葡萄糖8.0kg、黄豆粉5.0kg、硫酸铵1.0kg、磷酸二氢钾0.2kg、碳酸钙2.4kg、七水合硫酸镁0.2kg、消泡剂0.24kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后用压差法将已经培养好的地中海拟无枝酸菌接种体600mL用压差接种法，接入一级种子罐中进行培养。培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm，搅拌转速245rpm。至菌体浓度17％、培养时间74h移入二级种子培养基。

二级种子培养：体积1750L。二级种子培养基配方：葡萄糖70.0kg、黄豆粉43.75kg、硫酸铵8.75kg、磷酸二氢钾1.75kg、碳酸钙21.0kg、七水合硫酸镁1.75kg、消泡剂2.1kg。首先将二级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后将已经培养好的一级种子移入二级种子罐进行培养。二级种子培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm：搅拌转速198rpm。

至菌浓浓度17％、培养时间26h移入发酵培养基。发酵培养基体积15000L，发酵培养基配方：葡萄糖1500kg、黄豆粉300kg、蛋白胨150kg、硝酸钾75kg、磷酸二氢钾1.5kg、碳酸钙75kg、六水氯化钴0.015kg、硫酸铵22.5kg、脚料1菌丝体242kg(含水率62％)、消泡剂6.0kg。先将发酵培养基灭菌，通入无菌空气，冷却至26-32℃，然后将培养好的二级种子1200L移入发酵培养基中进行培养。

发酵培养条件为：

a温度26-32℃。

b压力：0.03-0.10Mpa。

c当发酵进行到47h后补入30％(m/v)硝酸铵溶液。

d当pH降低到6.5，停止补入硝酸铵，补入氨水维持pH6.3-6.7。

e当发酵70h后，补入黄豆粉175kg、鱼粉50kg。

f发酵进行到100h后补入PPG，一直到发酵结束。

g发酵过程中，溶氧含量控制在20％以上。

发酵周期245h，效价31091U/mL时终止发酵。

实施例14

一级种子培养：体积200L，一级种子培养基配方：葡萄糖9.0kg、黄豆粉7.0kg、硫酸铵1.6kg、磷酸二氢钾0.25kg、碳酸钙3kg、七水合硫酸镁0.25kg、消泡剂0.3kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后用压差法将已经培养好的地中海拟无枝酸菌接种体650mL用压差接种法，接入一级种子罐中进行培养。培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm，搅拌转速245rpm。至菌体浓度18％、培养时间78h移入二级种子培养基。

二级种子培养：体积1750L，二级种子培养基：葡萄糖78.75kg、黄豆粉61.25kg、硫酸铵14kg、磷酸二氢钾2.19kg、碳酸钙26.25kg、七水合硫酸镁2.19kg、消泡剂2.63kg。首先将二级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后将已经培养好的一级种子移入二级种子罐进行培养。二级种子培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm：搅拌转速198rpm。

至菌浓浓度18％、培养时间32h移入发酵培养基。发酵培养基体积15000L，发酵培养基配方：葡萄糖1875kg、黄豆粉300kg、蛋白胨187.5kg、硝酸钾93.75、磷酸二氢钾1.88kg、碳酸钙93.75kg、六水氯化钴0.018kg、硫酸铵37.5kg、消泡剂12kg，菌丝体242kg(含水率62％)，脚料2(萃取后浓缩废液)600kg(COD为8.2g/L)。先将发酵培养基灭菌，通入无菌空气，冷却至26-32℃，然后将培养好的二级种子1500L移入发酵培养基中进行培养。

发酵培养条件为：

a温度26-32℃。

b压力：0.03-0.10Mpa。

c当发酵进行到48h后补入35％(m/v)硝酸铵溶液。

d当pH降低到6.5，停止补入硝酸铵，补入氨水维持pH6.4-6.8。

e当发酵75h后，补入黄豆粉200kg、鱼粉100kg。

f发酵进行到100h后补入PPG，一直到发酵结束。

g发酵过程中，溶氧含量控制在20％以上。

发酵周期248h，效价30800U/mL时终止发酵。

实施例15

一级种子培养：体积200L，一级种子培养基配方：葡萄糖10.0kg、黄豆粉8.0kg、硫酸铵2.5kg、磷酸二氢钾0.3kg、碳酸钙3.6kg、七水合硫酸镁0.3kg、消泡剂0.36kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后用压差法将已经培养好的地中海拟无枝酸菌接种体700mL用压差接种法，接入一级种子罐中进行培养。培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm，搅拌转速245rpm。至菌体浓度20％、培养时间82h移入二级种子培养基。

二级种子培养：体积1750L，二级种子培养基配方：葡萄糖87.5kg、黄豆粉70kg、硫酸铵21.88kg、磷酸二氢钾2.63kg、碳酸钙31.5kg、七水合硫酸镁2.63kg、消泡剂3.15kg。首先将二级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后将已经培养好的一级种子移入二级种子罐进行培养。二级种子培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm：搅拌转速198rpm。

至菌浓浓度20％、培养时间36h移入发酵培养基。发酵培养基体积15000L，发酵培养基配方：葡萄糖2250kg、黄豆粉150kg、蛋白胨75kg、硝酸钾112.5、磷酸二氢钾2.25kg、碳酸钙112.5kg、六水氯化钴0.0195kg、硫酸铵45kg、消泡剂18kg，脚料1(菌丝体)484kg(含水率62％)，脚料2(萃取后浓缩废液)1200kg(COD为8.2g/L)。先将发酵培养基灭菌，通入无菌空气，冷却至26-32℃，然后将培养好的二级种子1750L移入发酵培养基中进行培养。

发酵培养条件为：

a温度26-32℃。

b压力：0.03-0.10Mpa。

c当发酵进行到50h后补入30％(m/v)氯化铵溶液。

d当pH降低到6.5，停止补入氯化铵，补入氨水维持pH6.5-7.0。

e当发酵80h后，补入黄豆粉375kg。

f发酵进行到100h后补入PPG，一直到发酵结束。

g发酵过程中，溶氧含量控制在20％以上。

发酵周期250h，效价30800U/mL时终止发酵。

实施例16

22m

首先将一级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后用压差法将已经培养好的地中海拟无枝酸菌接种体500mL用压差接种法，接入一级种子罐中进行培养。培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm，搅拌转速245rpm。至菌体浓度15％、培养时间70h移入二级种子培养基。

二级种子培养：体积1750L，二级种子培养基配方：葡萄糖52.5kg、黄豆粉26.26kg、硫酸铵4.38kg、磷酸二氢钾0.88kg、碳酸钙10.51kg、七水合硫酸镁0.88kg、消泡剂1.06kg。首先将二级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后将已经培养好的一级种子移入二级种子罐进行培养。二级种子培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm：搅拌转速198rpm。

至菌浓浓度15％、培养时间22h移入发酵培养基。发酵培养基体积15000L，发酵培养基配方：葡萄糖750kg、黄豆粉75kg、蛋白胨75kg、硝酸钾112.5kg、磷酸二氢钾0.75kg、碳酸钙37.5kg、六水氯化钴0.0105kg、硫酸铵15kg、鱼粉37.5kg、脚料1(菌丝体)242kg(含水率62％)、消泡剂3kg。先将发酵培养基灭菌，通入无菌空气，冷却至26-32℃，然后将培养好的二级种子450L移入发酵培养基中进行培养。

发酵培养条件为：

a温度26-32℃。

b压力：0.03-0.10Mpa。

c补入氨水维持pH6.0-6.5。

d当发酵60h后，补入有黄豆粉50kg、鱼粉25kg。

e发酵进行到100h后补入PPG，一直到发酵结束。

f发酵过程中，溶氧含量控制在20％以上。

发酵周期240h，效价24591U/mL时终止发酵。

实施例17

一级种子培养：体积200L，一级种子培养基配方：葡萄糖7.0kg、黄豆粉4.0kg、硫酸铵0.8kg、磷酸二氢钾0.15kg、碳酸钙1.8kg、七水合硫酸镁0.15kg、消泡剂0.18kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后用压差法将已经培养好的地中海拟无枝酸菌接种体550mL用压差接种法，接入一级种子罐中进行培养。培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm，搅拌转速245rpm。至菌体浓度16％、培养时间72h移入二级种子培养基。

二级种子培养：体积1750L，二级种子培养基配方：葡萄糖61.25kg、黄豆粉35kg、硫酸铵7kg、磷酸二氢钾1.31kg、碳酸钙15.75kg、七水合硫酸镁1.31kg、消泡剂1.58kg。首先将二级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后将已经培养好的一级种子移入二级种子罐进行培养。二级种子培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm：搅拌转速198rpm。

至菌浓浓度15％、培养时间24h移入发酵培养基。发酵培养基体积15000L，发酵培养基配方：葡萄糖1125kg、黄豆粉337.5kg、脚料1(菌丝体)242kg(含水率62％)、硝酸钾56.25kg、磷酸二氢钾1.13kg、碳酸钙56.25kg、六水氯化钴0.0128kg、硫酸铵22.5kg、鱼粉56.25kg、消泡剂4.5kg。先将发酵培养基灭菌，通入无菌空气，冷却至26-32℃，然后将培养好的二级种子750L移入发酵培养基中进行培养。

发酵培养条件为：

a温度26-32℃。

b压力：0.03-0.10Mpa。

c补入氨水维持pH6.2-6.7。

d当发酵65h后，补入黄豆粉100kg、鱼粉50kg。

e发酵进行到100h后补入PPG，一直到发酵结束。

f发酵过程中，溶氧含量控制在20％以上。

发酵周期243h，效价25000U/mL时终止发酵。

实施例18

一级种子培养：体积200L，一级种子培养基配方：葡萄糖8.0kg、黄豆粉5.0kg、硫酸铵1.0kg、磷酸二氢钾0.2kg、碳酸钙2.4kg、七水合硫酸镁0.2kg、消泡剂0.24kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后用压差法将已经培养好的地中海拟无枝酸菌接种体600mL用压差接种法，接入一级种子罐中进行培养。培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm，搅拌转速245rpm。至菌体浓度17％、培养时间74h移入二级种子培养基。

二级种子培养：体积1750L。二级种子培养基配方：葡萄糖70.0kg、黄豆粉43.75kg、硫酸铵8.75kg、磷酸二氢钾1.75kg、碳酸钙21.0kg、七水合硫酸镁1.75kg、消泡剂2.1kg。首先将二级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后将已经培养好的一级种子移入二级种子罐进行培养。二级种子培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm：搅拌转速198rpm。

至菌浓浓度17％、培养时间26h移入发酵培养基。发酵培养基体积15000L，发酵培养基配方：葡萄糖1500kg、黄豆粉300kg、蛋白胨150kg、硝酸钾75kg、磷酸二氢钾1.5kg、碳酸钙75kg、六水氯化钴0.015kg、硫酸铵22.5kg、脚料1(菌丝体)242kg(含水率62％)、消泡剂6.0kg。先将发酵培养基灭菌，通入无菌空气，冷却至26-32℃，然后将培养好的二级种子1200L移入发酵培养基中进行培养。

发酵培养条件为：

a温度26-32℃。

b压力：0.03-0.10Mpa。

c补入氨水维持pH6.3-6.7。

d当发酵70h后，补入黄豆粉175kg、鱼粉50kg。

e发酵进行到100h后补入PPG，一直到发酵结束。

f发酵过程中，溶氧含量控制在20％以上。

发酵周期245h，效价23698U/mL时终止发酵。

实施例19

一级种子培养：体积200L，一级种子培养基配方：葡萄糖9.0kg、黄豆粉7.0kg、硫酸铵1.6kg、磷酸二氢钾0.25kg、碳酸钙3kg、七水合硫酸镁0.25kg、消泡剂0.3kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后用压差法将已经培养好的地中海拟无枝酸菌接种体650mL用压差接种法，接入一级种子罐中进行培养。培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm，搅拌转速245rpm。至菌体浓度18％、培养时间78h移入二级种子培养基。

二级种子培养：体积1750L，二级种子培养基：葡萄糖78.75kg、黄豆粉61.25kg、硫酸铵14kg、磷酸二氢钾2.19kg、碳酸钙26.25kg、七水合硫酸镁2.19kg、消泡剂2.63kg。首先将二级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后将已经培养好的一级种子移入二级种子罐进行培养。二级种子培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm：搅拌转速198rpm。

至菌浓浓度18％、培养时间32h移入发酵培养基。发酵培养基体积15000L，发酵培养基配方：葡萄糖1875kg、黄豆粉300kg、蛋白胨187.5kg、硝酸钾93.75、磷酸二氢钾1.88kg、碳酸钙93.75kg、六水氯化钴0.018kg、硫酸铵37.5kg、消泡剂12kg，脚料1(菌丝体)242kg(含水率62％)，脚料2(萃取后浓缩废液)600kg(COD为8.2g/L)。先将发酵培养基灭菌，通入无菌空气，冷却至26-32℃，然后将培养好的二级种子1500L移入发酵培养基中进行培养。

发酵培养条件为：

a温度26-32℃。

b压力：0.03-0.10Mpa。

c补入氨水维持pH6.4-6.8。

d当发酵75h后，补入黄豆粉200kg、鱼粉100kg。

e发酵进行到100h后补入PPG，一直到发酵结束。

f发酵过程中，溶氧含量控制在20％以上。

发酵周期248h，效价22000U/mL时终止发酵。

实施例20

一级种子培养：体积200L，一级种子培养基配方：葡萄糖10.0kg、黄豆粉8.0kg、硫酸铵2.5kg、磷酸二氢钾0.3kg、碳酸钙3.6kg、七水合硫酸镁0.3kg、消泡剂0.36kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后用压差法将已经培养好的地中海拟无枝酸菌接种体700mL用压差接种法，接入一级种子罐中进行培养。培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm，搅拌转速245rpm。至菌体浓度20％、培养时间82h移入二级种子培养基。

二级种子培养：体积1750L，二级种子培养基配方：葡萄糖87.5kg、黄豆粉70kg、硫酸铵21.88kg、磷酸二氢钾2.63kg、碳酸钙31.5kg、七水合硫酸镁2.63kg、消泡剂3.15kg。首先将二级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后将已经培养好的一级种子移入二级种子罐进行培养。二级种子培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm：搅拌转速198rpm。

至菌浓浓度20％、培养时间36h移入发酵培养基。发酵培养基体积15000L，发酵培养基配方：葡萄糖2250kg、黄豆粉150kg、蛋白胨75kg、硝酸钾112.5kg、磷酸二氢钾2.25kg、碳酸钙112.5kg、六水氯化钴0.0195kg、硫酸铵45kg、消泡剂18kg，脚料2(萃取后浓缩废液)1200kg(COD为8.2g/L)。先将发酵培养基灭菌，通入无菌空气，冷却至26-32℃，然后将培养好的二级种子1750L移入发酵培养基中进行培养。

发酵培养条件为：

a温度26-32℃。

b压力：0.03-0.10Mpa。

c补入氨水维持pH6.5-7.0。

d当发酵80h后，补入黄豆粉375kg。

e发酵进行到100h后补入PPG，一直到发酵结束。

f发酵过程中，溶氧含量控制在20％以上。

发酵周期250h，效价21010U/mL时终止发酵。

实施例21

22m

首先将一级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后用压差法将已经培养好的地中海拟无枝酸菌接种体500mL用压差接种法，接入一级种子罐中进行培养。培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm，搅拌转速245rpm。至菌体浓度15％、培养时间70h移入二级种子培养基。

二级种子培养：体积1750L，二级种子培养基配方：葡萄糖52.5kg、黄豆粉26.26kg、硫酸铵4.38kg、磷酸二氢钾0.88kg、碳酸钙10.51kg、七水合硫酸镁0.88kg、消泡剂1.06kg。首先将二级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后将已经培养好的一级种子移入二级种子罐进行培养。二级种子培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm：搅拌转速198rpm。

至菌浓浓度15％、培养时间22h移入发酵培养基。发酵培养基体积15000L，发酵培养基配方：葡萄糖750kg、黄豆粉75kg、蛋白胨75kg、硝酸钾112.5kg、磷酸二氢钾0.75kg、碳酸钙37.5kg、六水氯化钴0.0105kg、硫酸铵15kg、鱼粉37.5kg、消泡剂3kg。先将发酵培养基灭菌，通入无菌空气，冷却至26-32℃，然后将培养好的二级种子450L移入发酵培养基中进行培养。

发酵培养条件为：

a温度26-32℃。

b压力：0.03-0.10Mpa。

c补入氨水维持pH6.0-6.5。

d当发酵60h后，补入有黄豆粉50kg、鱼粉25kg。

e发酵进行到100h后补入PPG，一直到发酵结束。

f发酵过程中，溶氧含量控制在20％以上。

发酵周期240h，效价15030U/mL时终止发酵。

实施例22

22m

首先将一级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后用压差法将已经培养好的地中海拟无枝酸菌接种体500mL用压差接种法，接入一级种子罐中进行培养。培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm，搅拌转速245rpm。至菌体浓度15％、培养时间70h移入二级种子培养基。

二级种子培养：体积1750L，二级种子培养基配方：葡萄糖52.5kg、黄豆粉26.26kg、硫酸铵4.38kg、磷酸二氢钾0.88kg、碳酸钙10.51kg、七水合硫酸镁0.88kg、消泡剂1.06kg。首先将二级种子培养基灭菌并冷却，然后通入无菌空气保压，然后将已经培养好的一级种子移入二级种子罐进行培养。二级种子培养条件为：罐压：0.03-0.10Mpa，罐温：26-32℃，空气流量0.5-1vvm：搅拌转速198rpm。

至菌浓浓度15％、培养时间22h移入发酵培养基。发酵培养基体积15000L，发酵培养基配方：葡萄糖750kg、黄豆粉75kg、蛋白胨37.5kg、硝酸钾112.5kg、磷酸二氢钾0.75kg、碳酸钙37.5kg、六水氯化钴0.0105kg、硫酸铵15kg、鱼粉18.75kg、脚料1(菌丝体)242kg(含水率62％)kg、消泡剂3kg。先将发酵培养基灭菌，通入无菌空气，冷却至26-32℃，然后将培养好的二级种子450L移入发酵培养基中进行培养。

发酵培养条件为：

a温度26-32℃。

b压力：0.03-0.10Mpa。

c当发酵进行到45h后补入30％(m/v)硫酸铵溶液。

d当pH降低到6.5，停止补入硫酸铵，补入氨水维持pH6.0-6.5。

e当发酵60h后，补入灭菌后的脚料1 120kg(含水率62％)，脚料2 800kg。

f发酵进行到100h后补入PPG，一直到发酵结束。

g发酵过程中，溶氧含量控制在20％以上。

发酵周期240h，效价31043U/mL时终止发酵。

在上述实施例中，由于发酵培养基中加入脚料，黄豆粉等氮源的加入量可以，在节约氮源的同时能够保证产品产率。实施例16-21中只补充氨水，不补加铵盐补充液，根据最终产物的量判断，均小于实施例11-15和22铵盐的。补充铵盐能够进一步地提升产量。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过在发酵培养基中添加利福霉素提取后脚料，能够提高发酵培养基中的利福霉素的产率。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。