一种地龙细胞外基质支架及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种地龙细胞外基质支架及其制备方法和应用。

背景技术

烧伤、创伤及糖尿病足溃疡等造成的皮肤缺损是临床常见病症。这类患者由于皮肤完整性的破坏，不但要遭受身体和心理的痛苦，还会面临体液丢失、细菌感染和内脏损伤等风险，严重者甚至可能危及生命。因此，研发快速有效地促进皮肤创面愈合的方法和药物具有重要意义。

地龙，俗称蚯蚓，是我国一种传统中药材。它富含氨基酸、有机酸、脂肪酸及其酯类等营养成分，具有通络，平喘，利尿等功效。更引人注目的是，地龙具备很强的组织再生能力。当它身体的一部分受到损害时，可以通过产生全新的组织细胞，完整修复受损的部位。已有大量研究证实，地龙提取物可以促进成纤维细胞、施万细胞、成骨细胞等的增殖和迁移，进而加速皮肤创面愈合、神经组织再生和骨组织再生。因此，地龙在创面修复领域具有重要应用价值。

细胞外基质（extracellular matrix, ECM）是指细胞周围由多种大分子组成的三维纤维网络。它的成分主要包括胶原蛋白、弹性蛋白、氨基聚糖等结构性和功能性分子。最新研究表明，ECM不仅起到物理支持的作用，还在细胞增殖、迁移、分化等生物学活动的调节中发挥了至关重要的作用。比如，组织受到损伤时，ECM可以通过信号分子转导和力学性能转变等，诱导其中的细胞向特定功能方向转化，从而促进组织再生和恢复机体完整性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种地龙细胞外基质支架及其制备方法和应用，以实现对地龙的细胞外基质支架的成功制备，填补地龙细胞外基质支架在创面愈合中应用的空白，还可以扩大地龙的应用价值。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种地龙细胞外基质支架的制备方法，包括以下步骤：

S1、将地龙饥饿处理后，采用液氮处理地龙；

S2、将地龙置于三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）和曲拉通X-100（TritionX-100）的混合溶液中，摇床反应2h；

S3、更换新鲜的混合溶液，摇床反应12~16h，洗涤，获得地龙细胞外基质支架。

根据上述技术手段，通过采用Tris、EDTA和TritionX-100的混合溶液处理地龙，有效实现了地龙细胞外基质支架的成功制备，且经过试验证明相比于传统敷料，制备的地龙细胞外基质支架可有效促进皮肤创面愈合，具有更佳的促组织再生功能，同时，地龙细胞外基质支架的天然三维网状结构可以有效负载活性细胞（如成纤维细胞等，参见图5及图6）或药物（如生长因子、抗菌剂等），发挥促进血管化、加速再上皮化、抗感染等特定功能作用。

其中，由于既往地龙的应用主要是其干燥后躯体、粉末或提取物，本发明创新地采用脱细胞方法制备了地龙细胞外基质支架，不但可以去除异种异体细胞的免疫原性，而且该支架可以在保护皮肤创面和提供物理支撑的同时，通过生物调控作用原位诱导细胞的粘附、增殖、分化等，促进组织的修复和再生，是一种地龙全新的应用，且试验证明了它能够负载活性细胞，以及促进创面愈合。

优选的，所述混合溶液中三羟甲基氨基甲烷（Tris）的质量浓度为0.5~0.9%。

优选的，所述混合溶液中三羟甲基氨基甲烷（Tris）的质量浓度为0.7%。

优选的，所述混合溶液中乙二胺四乙酸（EDTA）的质量浓度为0.1~0.5%。

优选的，所述混合溶液中乙二胺四乙酸（EDTA）的质量浓度为0.3%。

优选的，所述混合溶液中曲拉通X-100（TritionX-100）的质量浓度为0.5~1.5%。

优选的，所述混合溶液中曲拉通X-100（TritionX-100）的质量浓度为1%。

优选的，所述S1中，具体包括：将地龙饥饿处理12~36h后，用水清洗，然后采用液氮处理地龙，静置30min。

优选的，所述S1中，将地龙饥饿处理24h。

优选的，所述S2中，具体包括：将地龙置于三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）和曲拉通X-100（TritionX-100）的混合溶液中，在常温、转速为250rpm的条件下摇床反应2h。

优选的，所述S3中，具体包括：更换新鲜的混合溶液，在常温、转速为250rpm的条件下摇床反应12~16h，取出反应后的地龙，置于摇床上，在常温、转速为100rpm的条件下用水清洗3~8次，每次3~10min，获得地龙细胞外基质支架。

优选的，所述S3中，在常温、转速为100rpm的条件下用水清洗5次，每次5min，获得地龙细胞外基质支架。

本发明还提供一种地龙细胞外基质支架，采用本发明所述的制备方法制备得到。

本发明还提供一种如本发明所述的制备方法制备得到的地龙细胞外基质支架的应用，所述地龙细胞外基质支架应用于创面愈合的药物中。

本发明的有益效果：

本发明的地龙细胞外基质支架制备方法，通过采用三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）和曲拉通X-100（TritionX-100）的混合溶液处理地龙，有效实现了地龙细胞外基质支架的成功制备，且经过试验证明制备的地龙细胞外基质支架可有效促进皮肤创面愈合，且相比于其他来源获得的细胞外基质支架，地龙细胞外基质支架具有更佳的促组织再生性能，同时，地龙细胞外基质支架的天然三维网状结构可以有效负载活性细胞（如成纤维细胞等）或药物（如生长因子、抗菌剂等），发挥促进血管化、加速再上皮化、抗感染等特定功能作用，地龙细胞外基质支架生物相容性好、无免疫原性，具有制备工艺简单、可操作性强和适合规模化大批量生产的优点；本发明实现了对地龙的细胞外基质支架的成功制备，改变了既往仅针对地龙提取物进行应用开发的思路，创新地提出了地龙新的应用方法，填补了地龙细胞外基质支架在创面愈合中应用的空白，发掘和扩大了地龙的应用价值，在医药技术领域，具有推广应用价值。

附图说明

图1为制备的地龙细胞外基质支架的实物图；

图2为H&E染色地龙细胞外基质支架的微观结构图；

图3为DAPI染色地龙细胞外基质支架的微观结构图；

图4为地龙脱细胞前/后的细胞数目结果对比图；

图5为染色地龙细胞骨架和细胞核的结果对比图；

图6为成纤维细胞数目的结果图；

图7为创面愈合率结果对比图。

具体实施方式

以下将参照附图和优选实施例来说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书中所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。

需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。

实施例1

一种地龙细胞外基质的制备方法，包括以下步骤：

S1、将地龙饥饿处理24h后，用去离子水清洗3次，置于10cm培养皿中，采用液氮浇灌处死地龙；

S2、30分钟后，待地龙恢复室温后置于0.7%Tris、0.3%EDTA和1% TritionX-100的混合溶液中，置于摇床上，在温度为25℃、转速为250rpm的条件下摇床反应2h；

S3、更换新鲜的混合溶液，再在温度为25℃、转速为250rpm的条件下摇床反应12h，取出反应后的地龙，置于摇床上，在温度为25℃、转速为100rpm的条件下，用去离子水清洗5次，每次5min，获得地龙细胞外基质支架，地龙细胞外基质支架冻干后在-80℃的条件下保存。

本实施例1中制备的地龙细胞外基质支架如图1所示。

从图1中观察可知，实施例1中制备的地龙细胞外基质支架呈现透明凝胶状，从而证明了地龙体内细胞已去除，保留结构成分主要为细胞外基质。

实施例2

S1、将地龙饥饿处理24h后，用去离子水清洗3次，置于10cm培养皿中，采用液氮浇灌处死地龙；

S2、30分钟后，待地龙恢复室温后置于0.5%Tris、0.2%EDTA和0.5% TritionX-100的混合溶液中，置于摇床上，在温度为25℃、转速为250rpm的条件下摇床反应2h；

S3、更换新鲜的混合溶液，再在温度为25℃、转速为250rpm的条件下摇床反应16h，取出反应后的地龙，置于摇床上，在温度为25℃、转速为100rpm的条件下，用去离子水清洗5次，每次5min，获得地龙细胞外基质支架，地龙细胞外基质支架冻干后在-80℃的条件下保存。

实施例3

S1、将地龙饥饿处理36h后，用去离子水清洗3次，置于10cm培养皿中，采用液氮浇灌处死地龙；

S2、30分钟后，待地龙恢复室温后置于0.8%Tris、0.4%EDTA和1% TritionX-100的混合溶液中，置于摇床上，在温度为25℃、转速为250rpm的条件下摇床反应2h；

S3、更换新鲜的混合溶液，再在温度为25℃、转速为250rpm的条件下摇床反应12h，取出反应后的地龙，置于摇床上，在温度为25℃、转速为100rpm的条件下，用去离子水清洗5次，每次8min，获得地龙细胞外基质支架，地龙细胞外基质支架冻干后在-80℃的条件下保存。

检测分析

1）地龙细胞外基质支架的表征

1.1H&E染色观察

将正常的地龙及实施例1中制备得到的地龙细胞外基质支架分别置于4%多聚甲醛中固定过夜，石蜡包埋后切片，采用苏木精-伊红染色法（H&E）进行组织染色，于显微镜下进行观察和比较分析，结果如图2所示。

从图2中分析可知，正常的地龙组织结构由表及里可见到上皮细胞、环肌细胞、纵肌细胞等，而实施例1中制备得到的地龙细胞外基质支架的组织中未见到明显的细胞存在，而是主要为细胞外基质的胶原纤维、弹性蛋白纤维等组成的三维纤维网状结构，从而证明了本发明的地龙细胞外基质支架的制备方法是有效的，地龙脱细胞基质支架制备成功，且其具备的三维网状结构有利于细胞粘附、增殖及迁移，可以促进创面愈合。

1.2细胞核染色观察

将正常的地龙及实施例1中制备得到的地龙细胞外基质支架分别置于4%多聚甲醛中固定过夜，石蜡包埋后切片，置于二甲苯中脱蜡15分钟，再依次置于无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、50%乙醇中水化反应各5分钟，PBS清洗3次后，采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液进行染色，于荧光显微镜下进行观察，结果如图3所示，并进行细胞数目的检测，结果如图4所示。

从图3和图4综合分析可知，正常的地龙组织中可见大量染为蓝色的细胞核和大量的细胞，而实施例1中制备得到的地龙细胞外基质支架的组织中则未见到任何蓝色荧光和细胞，从而再次证明了本发明的地龙细胞外基质支架的制备方法是有效的，地龙细胞外基质支架制备成功。

2）地龙细胞外基质支架的生物相容性测试

将实施例1中制备得到的地龙细胞外基质支架制成10×4mm大小，采用紫外线消毒30分钟，置于24孔板中，PBS清洗3次；缓慢向吸水溶胀后的地龙支架表面加入500μL密度为2×10

从图5和图6综合分析可知，培养1天后，可见到地龙细胞外基质支架中有较多成纤维细胞粘附生长；培养5天后，支架中成纤维细胞数目较第1天显著增多（P<0.01），且细胞在支架中扩展良好，呈典型的梭形形态，从而证明了本发明的地龙细胞外基质支架的生物相容性良好，其天然三维网状结构可以有效负载活性细胞（即成纤维细胞等），且细胞可以在其中有效粘附和增殖，有利于创面愈合。

3）地龙细胞外基质支架对创面愈合的测试

具体包括以下步骤：

（1）BALB/C小鼠全层皮肤缺损创面模型的制备：实验动物予以1%戊巴比妥钠腹腔注射(100mg/kg，0.01ml/g)麻醉；小鼠固定于俯卧位，背部术区备皮后，常规70%乙醇消毒；用打孔器于背部两侧各造一直径为4mm的全层皮肤缺损创面；取BALB/C小鼠10只，实验组和对照组各5只小鼠，均按上述方法制备创面模型；

（2）实验组：将实施例1中制备的地龙细胞外基质支架制成6×4mm大小，采用紫外线消毒30分钟，PBS清洗3次，每次3分钟；将吸水溶胀后的支架覆盖于小鼠背部创面上，再用透气贴膜固定；对照组：采用同等大小的医用纱布覆盖创面，再用透气贴膜固定；

（3）术后立即对创面拍照记录，并作为第1天的初始创面面积，然后于第3、7天打开各组小鼠创面检查愈合情况，并拍照记录；术后第7天拍照后，小鼠即采用断颈法处死；

（4）利用Image J软件对第1、3、7天各组创面照片进行分析，计算残余创面面积（创缘所包围的面积），并按以下公式计算创面愈合率：

创面愈合率%= （初始创面面积-残余创面面积）/ 初始创面面积

结果如图7所示。

从图7中分析可知，术后第3天及第7天，与对照组相比，实验组的创面愈合率均显著性增高，差异有统计学意义（P<0.01），从而证明了本发明制备的地龙细胞外基质支架可以显著促进创面愈合，且相比于传统敷料，具有更佳的促组织再生功能，适用于临床创面治疗。

综上所述，本发明的地龙细胞外基质支架，经试验证明，具有以下三方面突出优点：第一，与单纯应用地龙提取物相比，地龙细胞外基质支架可以有效保护创面，提供物理支持；第二，与传统敷料相比，地龙细胞外基质支架可以显著促进皮肤创面愈合，具备更佳的促组织再生性能；第三，地龙细胞外基质支架的天然三维网状结构可以有效负载活性细胞（如成纤维细胞等）或药物（如生长因子、抗菌剂等），发挥特定功能作用而满足相应的临床需求，且具有制备工艺简单、可操作性强和适合规模化大批量生产的优点。

以上实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。