LFD-RPA可视化快速检测日本血吸虫核酸的引物、探针、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种LFD-RPA可视化快速检测日本血吸虫核酸的引物、探针、反应体系、试剂盒及检测方法。

背景技术

血吸虫病是一类古老的蠕虫病，主要分布于热带和亚热带。据估计，目前血吸虫病流行于全球78个国家和地区，有约8亿人处于感染风险，4.4亿人感染血吸虫，每年约有28万死亡病例，对人类危害极大。感染人体的血吸虫主要有日本血吸虫(S.japonicum)、曼氏血吸虫(S.mansoni)、湄公血吸虫(S.mekongi)、间插血吸虫(S.intercalatum)、埃及血吸虫(S.haematobium)以及马来血吸虫(S.malayensis)6种。我国仅有日本血吸虫病流行。经过70年的防治，目前我国血吸虫病防治工作取得显著成就，全国于2015年达到传播控制标准，居民感染率和感染度均处于较低水平。但我国湖南、湖北、江西、安徽和江苏等地血吸虫病流行因素仍然存在，且受洪水等自然灾害、南水北调工程的影响，巩固血防成果仍面临巨大挑战。在快速、有效检测手段的迫切需求下，以聚合酶链式反应(Polymerase chainreaction，PCR)为代表的核酸扩增技术快速发展，目的在于检测不同感染度以及在感染后不同时期内固定不变的特异性血吸虫核酸片段。传统的核酸检测方法包括常规PCR、巢式PCR(Nested PCR)、实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR)等，但因这些技术依赖昂贵仪器、需高温循环、成本高、耗时长等缺点，使其大多限制于条件优良的实验室内，难以广泛应用于现场及野外检测。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification,RPA)是Piepenburg等在2006年研发的一种全新核酸等温扩增技术，目前已在血吸虫病及其他寄生虫病检测方面有所报道。它是以T4噬菌体体内核酸复制机制为原理，以多种蛋白及酶参与的一种新型核酸等温扩增技术，可在37～42℃条件下，20min内将痕量核酸扩增至可检测水平，具有较高的敏感性和特异性，且操作简单，可在非实验室条件下实现对核酸的快速检测。由于其高敏感性，也可检出处于母胞蚴、子胞蚴及尾蚴感染阶段的中间宿主，优于传统检测方式。该技术不仅适用于DNA模板，也可实现对RNA的扩增。此外，其扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳检测，也可以与侧流层析试纸条、核酸染料等多种方法相结合实现可视化，但核酸染料对核酸扩增具有抑制作用。Piepenburg等建立了可以直接肉眼观察最终扩增结果的侧流层析试纸条-RPA(lateral flow RPA，LF-RPA)检测方法，适用于现场快速检测。总之，RPA技术具有引物设计简单、耗时短、温度要求低、成本低、不受检测条件及场地限制等优点，被认为是将来有望替代PCR的核酸检测新技术，是未来分子生物学检测发展的新趋势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种可视化快速检日本血吸虫核酸的检测方法，该方法具有敏感性高、检测快速、简单便携、无需借助昂贵仪器即可肉眼观察检测结果、适用于实验室及现场血吸虫病的早期诊断、鉴定和筛查的特点。

为解决上述技术问题，本发明根据登录号为AF412221.1的日本血吸虫SjG55A亚克隆基因序列，设计并提供了以下技术方案。

第一方面，本发明提供一对LFD-RPA可视化快速检测日本血吸虫核酸的特异性RPA引物，所述RPA引物的核苷酸序列为：

上游引物：5'-CCAATAAGGGCCGCTGACAGTTTATAGAGA-3'；(如SEQ ID NO.1所示)；

下游引物：5'-Biotin-CAACTACCAACGGTCAGTAGCTTCATGAGC-3'；(如SEQ ID NO.2所示)。

作为一个优选的实例，所述引物中，下游引物(RPA-PR)的5'端为生物素化修饰。

本发明提供的特异性RPA引物，比PCR引物较长，最佳长度为30～35bp；5’端避免聚G(鸟嘌呤)，可争取C(胞嘧啶)；3’端的C、G有助于聚合酶的稳定结合，提升引物的扩增性能；GC含量40-60％。

第二方面，本发明提供一种LFD-RPA可视化检测日本血吸虫核酸的探针，所述探针序列特异性结合于如SEQ ID NO.4所示的引物扩增序列之间，探针序列长度为46～52nt(本发明3中为49nt),探针的5'端为荧光素或地高辛修饰(本发明中为荧光素，FAM)，距离5'端的30～35nt(本发明中为30nt)的中部位置标记一个dspacer(四氢呋喃，THF),作为核酸外切酶的识别位点，探针的3'端为磷酸化修饰。THF距离3'末端一般为15个碱基左右(本发明为19nt)。

具体地，本发明提供一种LFD-RPA可视化检测日本血吸虫核酸的RPA-nfo探针，所述探针的核苷酸序列为：

5'-FAM-CACCACACACTCACCATAATGTTTGAAGAA(THF)TAATAAGTAAATATTGC-C3Spacer-3'。(如SEQ ID NO.3所示)。

具体地，所述探针的核苷酸序列中，5'端为荧光素修饰(FAM)，第31个碱基为四氢呋喃残基(THF)，3'为磷酸化修饰(C3-spacer)。

本发明还提供前述的引物及探针的组合。前述的引物及探针，其扩增的特异性片段为日本血吸虫类似非长末端逆转录转座子SjR2的G55A亚克隆基因序列(GenbankNo.AF412221.1)的第152-386bp间的序列，大小为235bp，扩增序列为：

CCAATAAGGGCCGCTGACAGTTTATAGAGACTTAAATAAATAAATAAAATACACCACACACTCACCATAATGTTTGAAGAATTAATAAGTAAATATTGCCAAGTTCTAAAGAATGATGTTTCTGAAGCCCAGTCTTGTTTAGTTTAGTTCAGTCCATCACAAACAATACCTTCAGGTTAGAGGTGATCAAACTAAAATATGACAAGCTCATGAAGCTACTGACCGTTGGTAGTTG(如SEQ ID NO.4所示)。

本发明还提供前述的引物及探针的组合用于制备成LFD-RPA可视化快速检测日本血吸虫核酸的试剂盒的应用。

第三方面，本发明提供一种LFD-RPA可视化快速检测日本血吸虫核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：如SEQ ID NO.1～2所示的RPA引物对，和如SEQ ID NO.3所示RPA-nfo探针。优选的，所述试剂盒还包括RPA扩增反应体系试剂。RPA扩增反应体系试剂是指除了引物对、探针及模板之外的RPA扩增反应体系中的所有试剂组分。所述RPA扩增反应体系试剂包含：RPA反应缓冲液、RPA扩增试剂、醋酸镁、双蒸水。其中，RPA扩增试剂是指依赖重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的作用，实现目的基因扩增的试剂。所述RPA扩增试剂的组分包括：噬菌体重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、dNTP以及外切酶。

优选的，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条(LFD)。

优选的，所述试剂盒还可以包括阴性对照品。在一种实施方式中，所述阴性对照品为双蒸水。

优选的，所述试剂盒还可以包括阳性对照品。在一种实施方式中，所述阳性对照品为日本血吸虫基因组DNA。

第四方面，本发明公开一种非诊断目的的LFD-RPA可视化检测日本血吸虫核酸的方法，其步骤为：

1)提取待测样本中的总DNA；

2)RPA扩增：将如SEQ ID NO.1～2所示的RPA引物对、如SEQ ID NO.3所示RPA-nfo探针、RPA反应缓冲液、总DNA模板及醋酸镁混合于含RPA扩增试剂的反应管中配置成RPA反应体系，反应温度设为20～50℃，反应时间为5～30min，进行RPA扩增；设置双蒸水为阴性对照，日本血吸虫基因组DNA为阳性对照；

3)LFD检测RPA扩增产物：采用侧流层析试纸条(LFD)检测RPA扩增产物；将扩增产物稀释后，滴加于侧流层析试纸条样品垫上，然后将侧流层析试纸条样品垫垂直插入试纸条缓冲液中，室温反应5～10min。肉眼观察结果，当试纸条检测线及质控线均显色(出现紫色条带)，表明RPA扩增产物为阳性，样本中含有血吸虫DNA；若只质控线显色，表明RPA无目标扩增产物，样本中无血吸虫DNA；若质控线未显色，表明实验结果无效。

作为一个具体的实施例，所述RPA扩增试剂组分包括：噬菌体重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、dNTP以及外切酶。

作为一个具体的实施例，所述反应缓冲液为Rehydration Buffer。

作为一个具体的实施例，所述侧流层析试纸条为Milenia Genline Hybridetect-1试纸条。

作为一个具体的实施例，所述RAP反应体系通常为50ul反应体系：向含RPA组分的冻干粉中加入29.5μl Rehydration Buffer，2～2.5μl 10μM的上游引物、2～2.5μl 10μM的下游引物，2～2.5μl 10μM的醋酸镁、1～5μl DNA模板，用双蒸水补足到50μl。

优选的，RPA扩增的较佳条件为：反应温度为39℃，反应时间为20min。

优选的，LFD检测RPA扩增产物的较佳条件为：将扩增产物稀释100倍后，取10μl滴加于侧流层析试纸条样品垫上，然后将试纸条样品垫垂直插入100μl试纸条缓冲液中，室温反应5min，肉眼观察结果。

本发明提供的上述方法可以应用于科研和教学中对不同来源样本的快速筛选和分类。从候选样本中筛选并确认出符合要求的日本血吸虫感染的样本(比如中间宿主)以用于进一步的研究。

为实现对日本血吸虫核酸的敏感、快速及简便的检测，本发明经过大量的前期筛选工作，选取了SjR2基因的G55A亚克隆序列，设计了新型的RPA引物及探针，结合RPA技术及侧流层析试纸条法建立了日本血吸虫核酸可视化快速敏感检测方法，并对其检测日本血吸虫核酸的敏感性、特异性及循环核酸早期检测可行性进行初步评价。本发明中通过引入荧光标记的探针及生物素标记的引物，在RPA反应过程中，产生大量一端FAM标记、另一端生物素标记的双链DNA产物。RPA反应液滴加于金标试纸条并随试纸条层析移动时，标记有FAM和生物素的扩增产物与纳米金偶联抗体及检测线上的配体形成复合物使纳米金聚集显色，出现检测线。试纸条上的质控线包被有二抗，可与游离的FAM探针及FAM抗体标记的纳米金粒结合而显色，出现质控线，以指示结果的有效性。

本发明以日本血吸虫类似非长末端逆转录转座子SjR2的G55A亚克隆序列为靶序列，设计了新型的RPA扩增引物及RPA-nfo探针，将重组酶聚合酶扩增与侧流试纸条结合，建立了LFD-RPA可视化快速检测血吸虫核酸的方法。本发明公开的LFD-RPA方法在20～45℃反应5min即可肉眼检出血吸虫阳性条带，在39℃，20min的最佳反应条件下，其最低可检出10fg日本血吸虫成虫基因组DNA，比以G55A为靶标自行建立的RPA跑胶检测方法(检出限100fg)及PCR方法(检出限1pg)敏感性更高。本发明的方法检测埃及血吸虫、华支睾吸虫、卫氏并殖吸虫、曼氏血吸虫基因组DNA时基本无交叉反应，提示可以用于日本血吸虫的检测、和其他吸虫的鉴别诊断。

本发明最低可成功检出1500只阴性钉螺中仅有1只阳性钉螺DNA样本中的SjG55A片段，显示了该方法用于检测中间宿主中痕量血吸虫DNA的可行性及优良性能，具有中间宿主的识别价值。

综上，本发明的有益效果为：本研究提供的LFD-RPA检测方法及试剂盒操作简单，无需特殊仪器设备(如荧光检测仪、电泳仪、电化学DNA传感器等)，反应温度范围宽，常用温度与室温接近，反应快速，可肉眼观察结果，具有较强的血吸虫病防治现场应用潜力。该方法能检测出阳性、阴性钉螺混合后的日本血吸虫核酸片段，具有检测价值，有望用于血吸虫感染中间宿主的检测。

附图说明

图1为实施例2中LFD-RPA检测日本血吸虫基因组DNA的反应温度优化的试纸条显色结果图。其中，1～7：左侧反应温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃；右侧均为对照灭菌双蒸水。

图2为实施例2中LFD-RPA检测日本血吸虫基因组DNA的反应时间优化的试纸条显色结果图。其中，1～7：左侧反应时间分别为0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min；右侧均为灭菌双蒸水。

图3为实施例3中LFD-RPA检测日本血吸虫基因组DNA的特异性评价的试纸条显色结果图。其中，1～10：分别为日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、阳性钉螺、阴性钉螺、阳性双脐螺、阴性双脐螺、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫基因组DNA；11：灭菌双蒸水。

图4为实施例3中LFD-RPA检测质粒DNA的敏感性评价的试纸条显色结果图。其中，1～7：基因组DNA浓度分别为10

图5为实施例3中LFD-RPA检测日本血吸虫基因组DNA的敏感性评价的试纸条显色结果图。其中，1～7：基因组DNA浓度分别为1ng/ul、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl、0.1fg/ul；8：灭菌双蒸水。

图6为实施例4中LFD-RPA检测混合钉螺DNA的效果评价的试纸条显色结果图。其中，1：日本血吸虫成虫基因组DNA；2-9：钉螺DNA混合比例分别为1:10、1:50、1:100、1:500、1:1000、1:1500、1:2000、1：2500；10：灭菌双蒸水。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：模板DNA、引物及探针的制备

1)模板DNA制备：采用组织DNA抽提试剂盒(

2)引物及探针设计：以G55A基因片段为靶序列，采用Primer primer 5软件结合BLAST设计RPA引物及探针，扩增产物长度为235bp。所有引物及探针DNA由上海生工生物科技有限公司合成。

上游引物(RPA-PF)为：5'-CCAATAAGGGCCGCTGACAGTTTATAGAGA-3'；

下游引物(RPA-PR)为：5'-Biotin-CAACTACCAACGGTCAGTAGCTTCATGAGC-3'

探针(RPA-nfo probe)：5'-FAM-CACCACACACTCACCATAATGTTTGAAGAA(THF)TAATAAGTAAATATTGC-C3 Spacer)；其中，5'端为荧光素修饰(FAM)；[THF]是四氢呋喃(tetrahydrofuran)残基，为核酸外切酶的识别位点；3'为磷酸化修饰(C3-spacer)，用以阻断DNA链的延伸。

实施例2：LFD-RPA检测日本血吸虫基因组DNA方法的建立及条件优化

1)LFD-RPA检测方法的建立：

参照

采用Milenia GenLine HybriDetect 1侧流层析试纸条检测RPA扩增产物。将扩增产物稀释100倍后，取10μl滴加于试纸条样品垫上，然后将试纸条样品垫垂直插入100μl试纸条缓冲液中，室温反应5min，肉眼观察结果。

当试纸条检测线及质控线均出现红色条带，表明RPA扩增产物为阳性，若只质控线显色，表明RPA无目标扩增产物；若质控线未显色，表明实验结果无效。

2)LFD-RPA检测日本血吸虫反应温度及时间条件优化结果：

在反应20min条件下，LFD-RPA在所设置的25、30、35、40、45梯度温度条件下质控线均出现条带，但50℃并未出现，其中30～45℃范围内检测线条带均较明显，且35～45℃范围内检测线条带颜色最深(图1)，表明30～45℃为RPA适合反应温度区间，35～45℃为最佳反应温度，因此选择RPA试剂盒推荐的39℃作为后续实验扩增温度。

在39℃扩增温度条件下，扩增5min即达到可检出的产物水平；5～30min内，阳性条带随着反应时间的增加逐渐增强，20min基本达到饱和(图2)。为满足低浓度模板的检测效率并提高时效性，同时避免非特异性扩增反应的产生，选择20min作为后续性能评价的反应时间。

实施例3：LFD-RPA检测日本血吸虫敏感性及特异性评价

选择39℃，20min作为RPA扩增条件，将日本血吸虫基因组DNA模板设置为质粒浓度分别为10

选择39℃，20min作为RPA扩增条件，将日本血吸虫基因组DNA模板设置为1ng/ul、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl等7个浓度梯度，设置阴性对照，以此评价LFD-RPA检测敏感性。

以曼氏血吸虫、埃及血吸虫、卫氏并殖吸虫、华支睾吸虫、阳性钉螺、阴性钉螺、阳性双脐螺、阴性双脐螺基因组DNA各1ng为模板，评价LFD-RPA检测的特异性。

结果显示：在质粒敏感性评价中(图4)，10

实施例4：LFD-RPA检测混合钉螺的效果评价

采用优化的实验条件，对模拟混合钉螺DNA进行LFD-RPA检测，考察该方法检测中间宿主钉螺中日本血吸虫核酸的可行性及性能。

对阳性钉螺和阴性钉螺不同比例的样本进行检测，钉螺DNA混合比例分别为1:10、1:50、1:100、1:500、1:1000、1:1500、1:2000、1：2500。按照比例进行样本混合，提取DNA，评价该检测技术其阳性中间宿主的检出价值。

结果显示，如图6，LFD-RPA检测分别在钉螺混合比例为1：1500之后试纸条不再出现红色条带，均1:10、1:50、1:100、1:500、1:1000、1:1500混合比例时，出现肉眼可见红色条带，试纸条上均可见阳性检测线，且条带颜色深度随阳性钉螺DNA被稀释比例的增加而变淡，而阴性钉螺组无检测线。结果显示了本发明用于中间宿主中痕量阳性钉螺内血吸虫核酸检测的可行性及优良性能。

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所（国家热带病研究中心）

<120> LFD-RPA可视化快速检测日本血吸虫核酸的引物、探针、试剂盒及方法

<130> CPC-NP-21-102514

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 正向引物(正向引物)

<400> 1

ccaataaggg ccgctgacag tttatagaga 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 反向引物(反向引物)

<400> 2

caactaccaa cggtcagtag cttcatgagc 30

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 探针(探针)

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> n为四氢呋喃

<400> 3

caccacacac tcaccataat gtttgaagaa ntaataagta aatattgc 48

<210> 4

<211> 235

<212> DNA

<213> 日本血吸虫SjG55A(SjG55A)

<400> 4

ccaataaggg ccgctgacag tttatagaga cttaaataaa taaataaaat acaccacaca 60

ctcaccataa tgtttgaaga attaataagt aaatattgcc aagttctaaa gaatgatgtt 120

tctgaagccc agtcttgttt agtttagttc agtccatcac aaacaatacc ttcaggttag 180

aggtgatcaa actaaaatat gacaagctca tgaagctact gaccgttggt agttg 235