石墨烯栅格、石墨烯栅格的制造方法、结构分析对象物质的结构分析方法

技术领域

本发明涉及石墨烯栅格、石墨烯栅格的制造方法、结构分析对象物质的结构分析方法。

背景技术

冷冻电子显微镜用于蛋白质等物质的结构分析(专利文献1等)。

在基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质(例如蛋白质)的结构分析中，为了捕捉结构分析对象物质，使用由石墨烯或无定形碳构成且贴附有支撑膜的碳栅格。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2005-250721号公报

发明内容

发明所要解决的课题

但是，在用碳栅格捕捉蛋白质等结构分析对象物质的情况下，有可能在碳栅格上发生结构分析对象物质的不均匀分布(局部化)、取向性的偏差等，或者无法捕捉足够数量的结构分析对象物质，从而对结构分析造成障碍。另外，有时难以以高分辨率进行结构分析对象物质的结构分析。

因此，本发明的目的在于，提供一种石墨烯栅格、石墨烯栅格的制造方法、结构分析对象物质，例如，在基于冷冻电子显微镜的结构分析等中，能够抑制或防止结构分析对象物质的不均匀分布、取向性的偏差等，并且能够高效率地捕捉结构分析对象物质，能够以高分辨率进行结构分析对象物质的结构分析。

用于解决课题的手段

为了实现所述目的，本发明的石墨烯栅格是具有在石墨烯表面导入了官能团的结构的石墨烯栅格。

本发明的石墨烯栅格的制造方法(以下，有时简称为“本发明的制造方法”)是由在所述石墨烯表面导入了官能团的物质而形成的石墨烯栅格的制造方法，其特征为，包括：

表面处理工序，使石墨烯表面与卤素氧化物自由基反应而对所述石墨烯表面进行改性；以及

官能团导入工序，向所述改性后的表面导入官能团。

本发明的结构分析对象物质的结构分析方法是使用冷冻电子显微镜进行结构分析对象物质的结构分析的方法，其特征为，包括结构分析用栅格准备工序和结构分析工序，

在所述结构分析用栅格准备工序中，使所述结构分析对象物质结合于所述本发明的石墨烯栅格或通过所述本发明的制造方法制造的石墨烯栅格，或者准备使基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质结合于所述本发明的石墨烯栅格而成的冷冻电子显微镜用栅格、或通过包括结构分析对象物质结合工序的冷冻电子显微镜用栅格的制造方法制造的冷冻电子显微镜用栅格，在所述结构分析对象物质结合工序中，进一步使基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质结合于通过所述本发明的制造方法制造的石墨烯栅格，

在所述结构分析工序中，使用冷冻电子显微镜对与所述石墨烯栅格结合的所述结构分析对象物质进行结构分析。

发明效果

根据本发明，能够提供一种石墨烯栅格、石墨烯栅格的制造方法、结构分析对象物质，例如能够在基于冷冻电子显微镜的结构分析等中，抑制或防止结构分析对象物质的不均匀分布、取向性的偏差等，并且能够高效率地捕捉结构分析对象物质，能够以高分辨率进行结构分析对象物质的结构分析。

附图说明

图1是示意性示出使用气相中的反应进行所述表面处理工序的装置的一个例子的图。

图2是示出参考例中的石墨烯的表面处理工序(氧化反应)前后的XPS测定结果的曲线图。

图3是示出参考例中结合有若丹明B的石墨烯的荧光强度测定结果的曲线图。

图4是在参考例中使用气相中的反应进行了所述表面处理工序的装置的示意图、以及示出所述表面处理工序前后的石墨烯表面的水的接触角的图。

图5是示出实施例中的石墨烯栅格的表面改性工序和官能团导入工序的概要的方案。

图6是示出实施例中的石墨烯栅格的表面改性工序、官能团导入工序和β-半乳糖苷酶的结合(结构分析对象物质结合工序)的概要的方案、和通过负染色法观察结合有β-半乳糖苷酶的石墨烯栅格表面而得到的照片。

图7是使用冷冻电子显微镜观察实施例中制造的在石墨烯栅格表面结合有β-半乳糖苷酶的冷冻电子显微镜用栅格的表面而得到的照片。

图8是使用冷冻电子显微镜对实施例中结合于冷冻电子显微镜用栅格表面的β-半乳糖苷酶进行结构分析而得到的数据。

图9是使用冷冻电子显微镜对实施例中结合于冷冻电子显微镜用栅格表面的β-半乳糖苷酶进行结构分析而得到的数据。

图10是使用冷冻电子显微镜对实施例中结合于冷冻电子显微镜用栅格表面的β-半乳糖苷酶进行结构分析而得到的数据。

图11是通过负染色法观察实施例中的结合有GroEL的石墨烯栅格表面而得到的照片。

图12是使用冷冻电子显微镜对实施例中结合于冷冻电子显微镜用栅格表面的GroEL进行结构分析而得到的数据。

图13是使用冷冻电子显微镜对实施例中结合于冷冻电子显微镜用栅格表面的GroEL进行结构分析而得到的数据。

图14是使用冷冻电子显微镜对实施例中结合于冷冻电子显微镜用栅格表面的GroEL进行结构分析而得到的数据。

图15是使用冷冻电子显微镜对实施例中结合于冷冻电子显微镜用栅格表面的GroEL进行结构分析而得到的数据。

图16是使用冷冻电子显微镜对实施例中结合于冷冻电子显微镜用栅格表面的GroEL进行结构分析而得到的数据。

图17是将实施例中的使用冷冻电子显微镜进行β-半乳糖苷酶或GroEL的结构分析的结果汇总而成的表。

图18是使用冷冻电子显微镜对实施例中结合于冷冻电子显微镜用栅格表面的V1-ATPase进行结构分析而得到的数据。

图19是使用冷冻电子显微镜对实施例中结合于冷冻电子显微镜用栅格表面的GroEL进行结构分析而得到的数据。

图20是使用冷冻电子显微镜对实施例中结合于冷冻电子显微镜用栅格表面的V1-ATPase进行结构分析而得到的数据。

图21是示出石墨烯的表面处理工序(氧化)前后的基于AFM的测定结果的例子的图。

图22是示出实施例中的官能团导入的一个例子的图。

图23是示意性示出使用了液体反应体系的表面处理工序的一个例子的图。

图24是通过负染色法观察在实施例中制造的在石墨烯栅格表面结合有β-半乳糖苷酶的石墨烯栅格表面而得到的照片。

图25是通过负染色法观察实施例中的结合有GroEL的石墨烯栅格表面而得到的照片。

具体实施方式

以下，针对本发明，举例进一步进行具体说明。但是，本发明不受以下说明限定。

本发明的石墨烯栅格例如可以具有下述结构：在石墨烯表面导入选自由羟基、羧基和醛基组成的组中的至少一种取代基，进一步通过所述取代基的反应导入所述官能团。

对于本发明的石墨烯栅格而言，例如，所述官能团可以为选自由羟基(氢氧基)、羧基、醛基(甲酰基)、羰基、醚键、酯键、氨基、亚氨基、磺酰基、磺酰氧基和氟烷基组成的组中的至少一种。

对于本发明的石墨烯栅格而言，例如，所述官能团可以为醚键。

对于本发明的石墨烯栅格而言，例如，所述官能团可以为环氧基。

本发明的石墨烯栅格例如可以为使基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质结合于所述本发明的石墨烯栅格的冷冻电子显微镜用栅格。

本发明的冷冻电子显微镜用栅格可以为结合了基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的石墨烯栅格，也可以为未结合基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的石墨烯栅格。

本发明的石墨烯栅格的制造方法(本发明的制造方法)中，例如，可以在所述官能团导入工序中，导入选自由羟基(氢氧基)、羧基、醛基(甲酰基)、羰基、醚键、酯键、氨基、亚氨基、磺酰基、磺酰氧基和氟烷基组成的组中的至少一种官能团作为所述官能团。

本发明的制造方法中，例如，可以在所述官能团导入工序中导入醚键作为所述官能团。

本发明的制造方法中，例如，可以在所述官能团导入工序中导入环氧基作为所述官能团。

本发明的制造方法中，例如，所述卤素氧化物自由基可以为二氧化氯自由基。

本发明的制造方法中，例如，可以通过所述表面处理工序将所述石墨烯表面氧化，所述石墨烯表面经改性的物质可以为石墨烯表面被氧化的物质。

本发明的制造方法中，例如，可以在所述表面处理工序中对反应体系进行光照射，也可以不对反应体系进行光照射。

本发明的制造方法中，例如，所述表面处理工序的反应体系可以为气体反应体系或液体反应体系。

本发明的制造方法例如可以为包含结构分析对象物质结合工序的冷冻电子显微镜用栅格的制造方法，在该结构分析对象物质结合工序中，进一步使基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质结合于通过所述本发明的制造方法制造的石墨烯栅格。

通过本发明的制造方法制造的冷冻电子显微镜用栅格可以为结合有基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的石墨烯栅格，也可以为未结合基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的石墨烯栅格。

本发明的结构分析对象物质的结构分析方法中，例如，所述结构分析对象物质可以为有机物质。

本发明的结构分析对象物质的结构分析方法中，所述有机物质例如可以为蛋白质。

本发明的石墨烯栅格例如可以为仪器分析用栅格。

本发明的石墨烯栅格例如可以为电子显微镜用栅格。

本发明的石墨烯栅格例如可以为冷冻电子显微镜用栅格。

进而，本发明的石墨烯栅格的用途并不限于仪器分析用栅格、电子显微镜用栅格以及冷冻电子显微镜用栅格，例如，除了生物反应器、传感器(例如酶传感器等生物传感器)、微反应器等用途以外，也可以为能够用于将抗体、各种蛋白质与珠等连结时的检测试剂或亲和柱色谱等的栅格。

本发明的冷冻电子显微镜用栅格可以用于使用了冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的结构分析方法。具体的使用方法没有特别限定，例如可以是与通常的冷冻电子显微镜用栅格相同的使用方法。所述结构分析对象物质也没有特别限定，例如可以为选自由蛋白质、抗体、核酸、病毒、核糖体、线粒体、离子通道、酶和酶复合体组成的组中的至少一种。作为所述结构分析对象物质、亦即所述蛋白质，没有特别限定，可举出例如酶、伴侣蛋白质、铁储藏蛋白质、抗体-抗原复合体、来源于病毒的表面的蛋白质等。作为所述酶，没有特别限定，可举出例如β-半乳糖苷酶、V1-ATPase等。作为所述伴侣蛋白质，没有特别限定，可举出例如GroEL等。作为所述铁储藏蛋白质，没有特别限定，可举出例如铁蛋白等。另外，所述结构分析对象物质例如可以为生物体物质(生物体来源的物质或与其相同的物质)，但并不限定于此，可以是任意的。

在本发明中，根据所述表面处理工序，能够对所述石墨烯表面进行改性。在本说明书中，有时将所述表面处理工序称为“改性处理”或“改性方法”。在通过所述表面处理工序将所述石墨烯氧化的情况下，所述表面处理工序可以说是所述石墨烯的氧化方法。

本发明中，盐没有特别限制，例如可以为酸加成盐，也可以为碱加成盐。形成所述酸加成盐的酸例如可以为无机酸也可以为有机酸，形成所述碱加成盐的碱例如可以为无机碱也可以为有机碱。所述无机酸没有特别限定，可举出例如硫酸、磷酸、氢氟酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、次氟酸、次氯酸、次溴酸、次碘酸、亚氟酸、亚氯酸、亚溴酸、亚碘酸、氟酸、氯酸、溴酸、碘酸、高氟酸、高氯酸、高溴酸和高碘酸等。所述有机酸没有特别限定，可举出例如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸和乙酸等。所述无机碱没有特别限定，可举出例如氢氧化铵、碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐等，更具体而言，可举出例如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钙和碳酸钙等。所述有机碱没有特别限定，可举出例如乙醇胺、三乙胺和三(羟甲基)氨基甲烷等。

以下，针对本发明的实施方式，举例进一步进行具体说明。但是，本发明并不限于以下实施方式。

[1.表面处理工序(石墨烯表面经改性的物质的制造方法)]

如上所述，本发明的石墨烯栅格的制造方法(本发明的制造方法)的特征在于，包括：使石墨烯表面与卤素氧化物自由基反应的表面处理工序；以及向所述经改性的表面导入官能团的官能团导入工序。所述表面处理工序也可以说是石墨烯表面经改性的物质的制造方法。以下，举例对所述表面处理工序进行具体说明。

(1)石墨烯

所述石墨烯为碳同素异形体的一种。作为碳同素异形体，除了石墨烯以外，还可举出例如类金刚石碳(以下有时简称为“DLC”)、碳纳米管、富勒烯、纳米金刚石、石墨、金刚石或碳纤维等。如上所述，本发明的制造方法的特征在于，包括：使石墨烯表面与卤素氧化物自由基反应的表面处理工序；以及向所述经改性的表面导入官能团的官能团导入工序。另外，如上所述，本发明的石墨烯栅格是具有在石墨烯表面导入了官能团的结构的石墨烯栅格。

与其它碳同素异形体相比，石墨烯极薄，因此例如在用于冷冻电子显微镜用栅格等仪器分析用的情况下，具有容易实现高分辨率的优势。具体而言，石墨烯理论上只有1个原子的厚度，因此例如在用于冷冻电子显微镜用栅格的情况下，信噪比容易变高。因此，根据本发明，如上所述，能够以高分辨率进行结构分析对象物质的结构分析。

在本发明中，所述石墨烯可以包含或不包含碳以外的其它元素。作为所述其它元素，可举出例如氢、氧、氮、硫、硼、硅、磷、各种金属元素等。所述石墨烯例如可以仅通过碳原子彼此键合而形成骨架，并在表面键合有所述其它原子。例如，所述石墨烯可以在表面存在羟基、甲基、羧基、醛基、羰基、醚键、酯键等基团。在所述石墨烯包含所述其它元素的情况下，其含有率没有特别限定，例如以原子数计可以为整体的40％以下、20％以下或5％以下，例如以原子数计可以为整体的0.01％以上、0.1％以上或1％以上。

根据本发明的所述表面处理工序，例如，如后所述，能够将石墨烯的表面氧化而导入羟基、羧基等官能团。该机理尚不明确，但推测是由于例如所述石墨烯表面的甲基等被氧化而转化为羟甲基、羧基等。但是，该说明是例示性的推测，本发明不受该说明限定。

(2)卤素氧化物自由基

在本发明中，所述卤素氧化物自由基包含在所述表面处理工序的反应体系中。关于所述卤素氧化物自由基，例如可以通过在所述反应体系中生成而包含在所述反应体系中，也可以使所述反应体系包含另行生成的所述卤素氧化物自由基。所述卤素氧化物自由基的产生方法没有特别限定。关于所述卤素氧化物自由基的产生，在下文叙述具体例。

所述卤素氧化物自由基例如可以为任一种，也可以合用两种以上。所述卤素氧化物自由基例如可以根据改性的对象的石墨烯的种类、反应条件等适当选择。

关于所述卤素氧化物自由基，可举出例如F

(3)反应体系

所述表面处理工序中的所述反应体系为包含所述石墨烯和所述卤素氧化物自由基的反应体系。如上所述，所述反应体系例如可以为气体反应体系，也可以为液体反应体系。在所述表面处理工序中，对于所述反应体系，例如可以进行光照射，也可以不进行光照射。即，即使不对所述石墨烯进行光照射，也能够使所述石墨烯与所述卤素氧化物自由基反应。由于可以不对所述石墨烯进行光照射，因此例如可得到安全性的提高、成本节约等效果。例如，也可以在不同于所述表面处理工序的反应体系的自由基生成用反应体系中通过光照射而产生卤素氧化物自由基，而在所述表面处理工序的反应体系中不进行光照射。需要说明的是，如上所述，所述卤素氧化物自由基的产生方法本身没有特别限定，可以进行光照射，也可以不进行。

(3A)气体反应体系

在所述反应体系为气体反应体系的情况下，例如，在包含所述卤素氧化物自由基的所述气体反应体系中配置所述石墨烯，进行光照射。但是，在本发明中，所述表面处理工序并不限于此。例如，只要能够使所述石墨烯表面与所述卤素氧化物自由基反应，则也可以不进行光照射来进行所述表面处理工序。所述气体反应体系包含例如所述自由基即可，所述气体反应体系中的气相的种类没有特别限制，为空气、氮、稀有气体、氧等。

本发明中，例如可以在所述表面处理工序前或所述表面处理工序的同时对所述气体反应体系导入所述卤素氧化物自由基，也可以在所述气体反应体系中产生所述卤素氧化物自由基。在前者的情况下，例如将包含所述卤素氧化物自由基的气体导入气相即可。在后者的情况下，例如，如后所述，可以通过使在液相的自由基生成用反应体系中产生的所述卤素氧化物自由基转移至气相中而进行导入。

作为具体例，在所述卤素氧化物自由基为所述二氧化氯自由基的情况下，例如可以通过向所述气相导入二氧化氯气体而使所述气相中存在所述二氧化氯自由基。所述二氧化氯自由基例如可以通过电化学方法而在所述气相中产生。

(3B)液体反应体系

所述反应体系为液体反应体系的情况下，例如包含有机相。所述液体反应体系例如可以为仅包含所述有机相的单相反应体系，也可以为包含所述有机相和水相的两相反应体系。在仅包含所述有机相的单相反应体系的情况下，例如，如后所述，可以另行准备包含所述卤素氧化物自由基的产生源的水相，在所述水相中生成所述卤素氧化物自由基后，在所述水相中混合所述有机相，使所述水相的所述卤素氧化物自由基溶解(萃取)于所述有机相中。

(3B-1)有机相

如上所述，在所述有机相中配置有所述石墨烯，例如为包含所述卤素氧化物自由基且配置有所述石墨烯的有机溶剂的相。

所述有机溶剂没有特别限定。所述有机溶剂例如可以仅使用1种，也可以合用多种。在本发明中，所述有机溶剂例如如上所述，可举出卤化溶剂、含氟溶剂等。所述液体反应体系为所述两相反应体系的情况下，所述有机溶剂优选为例如能够形成所述两相体系的溶剂、即与构成所述水相的后述水性溶剂分离的溶剂、相对于所述水性溶剂为难溶性或不溶性的溶剂。

“卤化溶剂”是指例如烃的氢原子中的全部或大部分被卤素替代得到的溶剂。所述卤化溶剂例如可以为烃的氢原子数的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、或90％以上被卤素取代的溶剂。所述卤化溶剂没有特别限定，可以举出例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、四溴化碳和后述的含氟溶剂等。

“含氟溶剂”是所述卤化溶剂中的1种，例如是指烃的氢原子中的全部或大部分被氟原子替代得到的溶剂。所述含氟溶剂例如可以为烃的氢原子数的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、或90％以上被氟原子取代的溶剂。本发明中，如果使用所述含氟溶剂，则例如所述溶剂本身的反应性低，因此具有能够进一步抑制或防止副反应的优点。所述副反应可举出例如所述溶剂的氧化反应、基于所述自由基的所述溶剂的夺氢反应或卤化反应(例如氯化反应)、以及来自于原料化合物的自由基与所述溶剂的反应(例如所述石墨烯的侧链或末端的烃基为乙基时，乙基自由基与所述溶剂的反应)等。所述含氟溶剂难以与水混溶，因此例如适合于形成所述两相反应体系。

所述含氟溶剂的例子，可举出例如下述化学式(F1)～(F6)所表示的溶剂等，其中，例如优选下述化学式(F1)中的n＝4的CF

[化F1-F6]

所述有机溶剂的沸点没有特别限定。所述有机溶剂例如可以根据所述表面处理工序的温度条件来适宜选择。在所述表面处理工序中将反应温度设为高温的情况下，作为所述有机溶剂，可选择高沸点溶剂。需要说明的是，本发明例如如后所述，加热并非是必须的，可以在例如常温常压下进行。在这样的情况下，所述有机溶剂例如不必为高沸点溶剂，从处理容易性的观点出发，可以使用沸点不太高的溶剂。

所述有机相可以仅包含例如所述石墨烯、所述卤素氧化物自由基和所述有机溶剂，也可以进一步包含其它成分。所述其它成分没有特别限定，可举出例如布朗斯特酸、路易斯酸及氧(O

如上所述，所述有机相包含所述卤素氧化物自由基。所述卤素氧化物自由基例如可以通过在所述有机相以外生成，并利用所述有机相进行萃取而包含在所述有机相中。即，在所述反应体系为仅包含有机相的单相反应体系的情况下，例如可以在作为所述反应体系的所述有机相以外另行生成所述卤素氧化物自由基，利用所述有机相对所生成的所述卤素氧化物自由基进行萃取，将包含萃取出的所述卤素氧化物自由基的所述有机相作为所述反应体系供于所述表面处理工序。所述卤素氧化物自由基的生成例如可以如后所述地在另行准备的水相中进行。另一方面，在所述液体反应体系为包含所述有机相和所述水相的两相体系反应体系的情况下，例如可以在所述水相中生成所述卤素氧化物自由基，将生成的卤素氧化物自由基从所述水相中萃取到所述有机相中，将所述水相和包含所述卤素氧化物自由基的有机相作为所述两相反应体系而供于所述表面处理工序。

所述石墨烯被配置在所述有机相中。在所述石墨烯为成型体的情况下，例如，从后述的反应处理的效率的观点出发，所述成型体优选例如以将要进行表面处理的部分浸渍于所述有机相中、不从所述有机相中露出的方式固定于所述有机相中。

(3B-2)水相

所述水相例如为水性溶剂的相。所述水性溶剂是例如与在所述有机相中使用的溶剂分离的溶剂。所述水性溶剂可举出例如H

所述水相例如如后所述，可以包含路易斯酸、布朗斯特酸、自由基产生源等任意成分。所述水相中，这些任意成分例如可以为溶解于所述水性溶剂的状态，也可以为不溶解的状态。在后者的情况下，所述任意成分例如可以为分散于所述水性溶剂的状态，也可以为沉淀的状态。

(4)表面处理工序

如上所述，所述表面处理工序是使所述石墨烯表面与所述卤素氧化物自由基反应的工序。所述表面处理工序中，例如，对于所述反应的反应体系，可以进行光照射，也可以不进行光照射。以下主要说明对所述反应体系进行光照射的方法，但本发明并不限于此。如上所述，只要能够使所述石墨烯表面与所述卤素氧化物自由基反应即可，也可以不进行光照射来进行所述表面处理工序。在该情况下，例如在以下的说明中省略光照射来进行所述表面处理工序即可。如上所述，由于对所述石墨烯不进行光照射，因此可得到例如安全性的提高、成本节约等效果。

在所述反应体系中配置有所述石墨烯，可以对所述石墨烯进行改性。具体而言，根据本发明，可在存在所述卤素氧化物自由基的条件下容易地对所述石墨烯进行改性。根据本发明，例如通过调整所述卤素氧化物自由基的量、光照射的时间的长度等，也能够容易地调整所述石墨烯的改性的程度(例如氧化等改变的程度)。因此，例如，也能够防止因过度氧化等原因而导致的所述石墨烯的分解，例如也能够避免损害所述石墨烯本来所具有的特性。

在所述表面处理工序中，在所述石墨烯表面存在甲基时，甲基(-CH

在所述表面处理工序中，在所述石墨烯表面存在乙基的情况下，乙基(-CH

另外，例如在所述石墨烯表面包含亚甲基(-CH

在所述表面处理工序中，光照射的条件没有特别限制。照射光的波长没有特别限定，下限例如为200nm以上，上限例如为800nm以下，光照射时间没有特别限定，下限例如为1秒以上，上限例如为1000小时，反应温度没有特别限定，下限例如为-20℃以上，上限例如为100℃以下、40℃以下，范围例如为0～100℃、0～40℃。反应时的气氛压力没有特别限定，下限例如为0.1MPa以上，上限例如为100MPa以下、10MPa以下、0.5MPa以下，范围例如为0.1～100MPa、0.1～10MPa、0.1～0.5MPa。作为所述表面处理工序的反应条件，例如可以例示出温度0～100℃或0～40℃、压力0.1～0.5MPa。另外，如上所述，例如即使省略光照射也可以进行所述表面处理工序。根据本发明，例如也可以不进行加热、加压、减压等，而在常温(室温)和常压(大气压)下进行所述表面处理工序或包含其在内的全部工序。“室温”没有特别限定，例如为5～35℃。因此，所述石墨烯例如可以包含耐热性低的石墨烯。另外，根据本发明，例如也可以在不进行不活性气体置换等的情况下在大气中进行所述表面处理工序或包括其在内的全部工序。

所述光照射的光源没有特别限定，可以利用例如太阳光等自然光中包含的可见光。如果利用自然光，则例如能够简便地进行激发。另外，作为所述光源，例如可以代替所述自然光或在所述自然光的基础上还使用氙灯、卤素灯、荧光灯、汞灯、LED灯等光源。所述光照射中，例如进一步还可以适当使用将所需波长之外的波长截止的滤波器。

本发明也可以通过对所述石墨烯，仅对任意区域进行光照射，从而仅对所述区域进行改性处理。这样的选择性光照射的控制方法没有特别限制，例如可以仅对任意区域进行光照射，也可以仅掩盖不进行光照射的区域并对整体进行光照射。

在所述反应体系为所述液体反应体系的情况下，在所述表面处理工序中，例如可以至少对所述有机相进行光照射。在仅由所述有机相构成的单相反应体系的情况下，例如，可以通过对所述单相反应体系进行光照射而实施所述表面处理工序。在包含所述有机相和所述水相的两相反应体系的情况下，例如可以仅对有机相进行光照射，也可以对所述两相反应体系进行光照射。在所述液体反应体系的情况下，例如可以一边使所述液体反应体系与空气接触一边对所述液体反应体系进行光照射，在所述两相反应体系的情况下，可以在所述水相中溶解有氧的状态下进行光照射。

根据本发明，在所述表面处理工序中，例如通过仅在所述卤素氧化物自由基的存在下进行光照射这样极其简便的方法，产生所述卤素的自由基(例如，氯原子自由基Cl·)和氧分子O

根据本发明，例如能够在不使用有毒的重金属催化剂等的情况下得到所述石墨烯表面经改性的物质。因此，如上所述，例如能够在极温和的条件下进行反应，并且能够通过对环境的负荷极小的方法而高效地进行所述石墨烯表面的改性。

作为石墨烯的表面的氧化方法，例如有使用高锰酸钾(KMnO

(5)卤素氧化物自由基生成工序

本发明例如还可以包括生成所述卤素氧化物自由基的卤素氧化物自由基生成工序。所述卤素氧化物自由基生成工序例如可以在所述表面处理工序之前进行，或者与所述表面处理工序同时进行。所述卤素氧化物自由基的生成方法没有特别限制。

所述卤素氧化物自由基生成工序例如可以使用自由基生成用反应体系产生所述卤素氧化物自由基。所述表面处理工序中的反应体系例如可以为所述气体反应体系(气相)，也可以为所述液体反应体系(液相)。所述自由基生成用反应体系例如可以在生成所述卤素氧化物自由基后直接作为所述表面处理工序中的所述液体反应体系使用。

在所述表面处理工序的反应体系为所述气体反应体系的情况下，例如可以在所述表面处理工序的反应体系之外另行准备所述自由基生成用反应体系。所述自由基生成用反应体系例如可以为包含所述卤素氧化物自由基的产生源的水相。所述水相例如包含所述卤素氧化物自由基的产生源，在所述卤素氧化物自由基生成工序中由所述卤素氧化物自由基的产生源生成所述卤素氧化物自由基。所述水相例如为水性溶剂的相，所述水性溶剂与上述相同。在所述水相中产生的所述卤素氧化物自由基为疏水性的情况下，例如，通过制成包含所述有机相和所述水相的两相反应体系，可以使所述卤素氧化物自由基转移到所述有机相。如上所述，当在所述气体反应体系中进行所述表面处理工序的情况下，所述卤素氧化物自由基的生成用反应体系例如可以仅为水相，也可以为水相与有机相的两相反应体系。在所述卤素氧化物自由基为疏水性的情况下，例如，由于能够在所述水相中产生自由基而直接转移至所述气相，所以所述自由基生成用反应体系可以仅为所述水相。

所述表面处理工序的反应体系和所述自由基生成用反应体系例如可以为图1所示的反应体系。具体而言，首先，如图1所示，在培养皿3内配置自由基生成用反应体系5。自由基生成用反应体系5例如可以为包含所述卤素氧化物自由基的产生源的水相。所述卤素氧化物自由基的产生源没有特别限定，例如如后所述。另一方面，在另一培养皿4内配置石墨烯6。将这些培养皿3和4容纳在另一个大的培养皿1中，并且将盖2盖在培养皿1上，以防止内部气体泄漏。然后，对培养皿3内的自由基生成用反应体系5进行光照射。通过该光照射，在培养皿3内产生卤素氧化物自由基的气体，该卤素氧化物自由基的气体流入到培养皿4内而与石墨烯6反应。如此可以进行所述表面处理工序。另外，在图1中，示例了下述情况：自由基生成用反应体系5中的卤素氧化物自由基的产生源为亚氯酸钠水溶液(NaClO

在所述表面处理工序的反应体系为所述液体反应体系、且包含所述水相的情况下，例如所述水相可以为所述自由基生成用反应体系。所述水相例如可以与所述表面处理工序的反应体系为所述气体反应体系时的所述自由基生成用反应体系相同。在所述水相中产生的所述卤素氧化物自由基为疏水性的情况下，例如，通过制成包含所述有机相和所述水相的两相反应体系，可以使所述卤素氧化物自由基转移到所述有机相。

所述卤素氧化物自由基的产生源(自由基生成源)没有特别限制，例如可以根据所述卤素氧化物自由基的种类适当选择。所述卤素氧化物自由基的产生源例如可以使用1种，也可以合用多种。

所述卤素氧化物自由基的产生源例如为包含氧和卤素的化合物，作为具体例，可举出例如亚卤酸(HXO

在所述水相中，所述产生源的浓度没有特别限定。在所述产生源为所述化合物的情况下，其浓度换算为所述卤素氧化物离子浓度时，例如下限为0.0001mol/L以上，上限为1mol/L以下，另外，其浓度换算为所述卤素氧化物离子的摩尔数时，例如下限为所述原料的摩尔数的1/100000倍以上，上限为1000倍以下。在所述产生源为亚卤酸或亚卤酸盐(例如亚氯酸或亚氯酸盐)的情况下，其浓度换算成亚卤酸根离子(例如亚氯酸根离子(ClO

所述水相例如可以还包含路易斯酸及布朗斯特酸中的至少一者，从而使其作用于所述卤素氧化物离子而生成所述卤素氧化物自由基。所述路易斯酸及布朗斯特酸中的至少一者例如为包含所述第IA族元素的路易斯酸及布朗斯特酸中的至少一者。所述卤素氧化物离子例如为亚氯酸根离子(ClO

在所述水相中，所述路易斯酸及所述布朗斯特酸中的至少一者的浓度没有特别限定，例如可以根据所述改性对象的石墨烯的种类等适当设定。所述浓度的下限例如为0.0001mol/L以上，上限为1mol/L以下。

所述布朗斯特酸没有特别限定，例如可以为无机酸，也可以为有机酸，作为具体例，可举出例如三氟甲磺酸、三氟乙酸、乙酸、氢氟酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸、亚磷酸等。所述布朗斯特酸的酸解离常数pK

所述水相例如包含所述卤素氧化物离子和所述布朗斯特酸，例如优选为所述化合物和布朗斯特酸(例如盐酸)溶解于水性溶剂而成的水相。作为具体例，在所述卤素氧化物自由基为二氧化氯自由基的情况下，所述水相例如包含亚氯酸根离子(ClO

在所述水相中，例如所述路易斯酸、所述布朗斯特酸、所述自由基产生源等可以为溶解于所述水性溶剂中的状态，也可以为非溶解的状态。后者的情况下，它们例如可以为分散于水性溶剂中的状态，也可以为沉淀的状态。

所述卤素氧化物自由基生成工序没有特别限定，例如通过使所述水性溶剂中含有所述卤素氧化物自由基的产生源，从而可以由所述卤素氧化物离子(例如亚氯酸根离子)自然地产生所述卤素氧化物自由基(例如二氧化氯自由基)。所述水相例如优选所述产生源溶解于所述水性溶剂中，此外，优选使其静置。在所述卤素氧化物自由基生成工序中，所述水相例如可以通过进一步共存有所述路易斯酸及所述布朗斯特酸中的至少一者而进一步促进所述卤素氧化物自由基的产生。所述卤素氧化物自由基生成工序例如也可以通过对所述水相实施光照射而产生所述卤素氧化物自由基，但是即使不进行光照射，例如仅进行静置也可以产生所述卤素氧化物自由基。

在所述水相中，推测由所述卤素氧化物离子产生所述卤素氧化物自由基的机理例如与后述的图15(液相反应体系中，有机相和水相的两相体系的情况)相同。但是，该说明仅为例示，对本发明没有任何限定。

在所述反应体系为所述液体反应体系、且为包含所述有机相和所述水相的两相反应体系的情况下，如上所述，在产生所述卤素氧化物自由基之后将所述液体反应体系直接供于所述表面处理工序即可。所述反应体系中的所述水相中的所述产生源所产生的所述卤素氧化物自由基难溶于水，因此溶解于所述反应体系中的所述有机相中。例如，对于产生了所述卤素氧化物自由基的所述液体反应体系，也可以进一步进行光照射而进行将所述石墨烯的表面改性的所述表面处理工序。在该情况下，例如可通过对所述液体反应体系进行光照射而连续地进行所述卤素氧化物自由基生成工序和所述表面处理工序。在本发明中，通过在所述两相反应体系中进行所述卤素氧化物自由基生成工序和所述表面处理工序，例如可以得到更好的反应效率。

另一方面，在所述表面处理工序中的所述反应体系为所述液体反应体系、且为仅包含所述有机相的单相反应体系的情况下，例如可以通过所述方法在所述水相中产生所述卤素氧化物自由基，使产生的所述卤素氧化物自由基溶解于(萃取到)所述有机相之后除去所述水相，将包含所述卤素氧化物自由基的所述有机相作为所述单相反应体系而供于所述表面处理工序即可。

在图23中示意性地示出使用了所述两相反应体系的所述卤素氧化物自由基生成工序和所述表面处理工序的一个例子。在图23中，作为所述卤素氧化物自由基，示出了所述二氧化氯自由基作为具体例，但本发明不受这些例子任何限制。如图23所示，就所述反应体系而言，在反应容器中，水层(所述水相)和有机层(所述有机相)这两层分离，彼此仅在界面接触。上层为水层(所述水相)12，下层为有机层(所述有机相)11。图23是截面图，但为了容易观察，省略了水层12和有机层11的阴影线。如图23所示，水层(水相)12中的亚氯酸根离子(ClO

图23中，水层12为上层，有机层11为下层，但是例如在有机层11的密度(比重)低的情况下，有机层11为上层。例如，也可以以在上层的有机层中配置所述石墨烯的方式在所述反应容器中固定化。在该情况下，固定所述石墨烯的固定部例如可以设置在所述反应容器中，也可以设置在所述反应容器的外部。在后者的情况下，可举出例如从外部吊起所述石墨烯并浸渍于所述有机层中的方式等。

在图23中例示了所述两相反应体系，但在本发明的制造方法中，所述表面处理工序也可以在仅有机相的单相反应体系中进行。在该情况下，例如另行准备包含所述卤素氧化物自由基的产生源的水相，在所述水相中生成所述卤素氧化物自由基后将所述有机相混合到所述水相中，使所述水相的所述卤素氧化物自由基溶解于(萃取到)所述有机相中。然后，将所述水相和所述有机相分离，回收所述有机相，配置所述石墨烯，将其作为单相反应体系，单独地在所述卤素氧化物自由基的存在下，进行基于所述光照射的所述表面处理工序。另外，在所述表面处理工序中的反应体系为气体反应体系的情况下，如上所述，可以在所述水相中生成所述卤素氧化物自由基后，在所述气体反应体系中进行所述表面处理工序。

作为石墨烯的表面的氧化方法，例如有使用高锰酸钾(KMnO

在本发明的石墨烯栅格的制造方法中，如上所述，通过所述表面处理工序，例如能够在不分解石墨烯的情况下高效地对所述石墨烯表面进行改性。由此，例如如后所述，能够以高浓度将所述结构分析对象物质牢固地固定于所述冷冻电子显微镜表面，能够抑制或防止所述结构分析对象物质的不均匀分布(局部化，例如凝聚等)、取向性的偏差等。由此，例如与以往方法相比，能够显著地减少对冷冻电子显微镜用的测定条件的最佳化筛选所花费的时间。另外，还能够缩短用于结构分析的数据收集所花费的时间。

[2.石墨烯栅格的制备方法]

如上所述，本发明的石墨烯栅格的制造方法(本发明的制造方法)为由在所述石墨烯表面导入了官能团物质形成的石墨烯栅格的制造方法，其特征为，包括使石墨烯表面与卤素氧化物自由基反应而对所述石墨烯表面进行改性的表面处理工序；以及向所述经改性的表面导入官能团的官能团导入工序。

通过导入所述官能团，能够赋予所述石墨烯各种功能。具体而言，例如如后述的实施例所示，通过所述官能团，容易利用冷冻电子显微镜捕捉结构分析对象物质(例如蛋白质)。此外，例如通过适当选择所述官能团的种类，能够赋予与该官能团的种类相应的任意功能。

所述官能团导入工序例如可以向被氧化(改性)而导入了羟基、羧基、醛基(甲酰基)等取代基的石墨烯表面，通过所述羟基、羧基、醛基等取代基与其它物质的反应(例如缩合反应)而导入官能团。由此，例如能够导入通过与导入至所述石墨烯表面的所述取代基(例如羟基、羧基、醛基等)的反应而能够导入的任意官能团。

作为所述官能团导入工序，可举出例如后述的实施例中记载的例子。具体而言，例如如后述的实施例中记载的那样，可以用2,3-环氧丙基取代导入石墨烯表面的羟基的氢，进而，在所述环氧基与蛋白质或1H,1H-十一氟己胺等之间进行加成反应。需要说明的是，1H,1H-十一氟己胺并不限定于此，也可以为其它任意的胺。所述胺没有特别限定，例如可以为伯胺，也可以为仲胺。进而，本发明并不限定于这些，只要不脱离本发明的范围，则是任意的。

另外，通过所述官能团导入工序能够导入的官能团没有特别限定，例如如上所述，可以导入通过与导入到所述石墨烯表面的所述取代基(例如羟基、羧基、醛基等)的反应而能够导入的任意官能团。在所述官能团导入工序中导入的官能团例如如上所述，可以为选自由羟基、羧基、醛基、羰基、醚键、酯键、氨基、亚氨基、磺酰基、磺酰氧基和氟烷基组成的组中的至少一种。所述氟烷基可以是烷基的氢原子的一部分或全部被氟原子取代的基团，例如可以是烷基的全部氢原子被氟原子取代的全氟烷基，例如可以是三氟甲基。另外，所述官能团例如可以为2个以上官能团的组合，例如可以为三氟甲基与酯键的组合即三氟乙酰基，例如也可以为三氟甲基与磺酰基的组合即三氟甲基磺酰基。需要说明的是，在本发明中，“烷基”的碳原子数没有特别限定，例如可以为1～24、1～18、1～12、1～6等，另外，“烷基”可以为直链状也可以为支链状。对于烷基的至少一个氢原子被取代的基团(例如氟烷基)等也是同样的。可以使作为在所述官能团导入工序中导入的具体的官能团的例如琥珀酰亚胺基、异硫氰基、磺酰氯基、羧酰氯基、环氧乙烷基、烷基氯基、羧酸酐基、马来酰亚胺基、酰肼等官能团与所述石墨烯表面的羟基、羧基、醛基等取代基反应而导入所述石墨烯表面。如此导入的官能团例如可以与氨基、巯基(也称为-SH、巯基、硫醇基)、醛基等基团反应，因此能够结合具有这些基团的化合物(例如蛋白质等)而捕捉。

所述官能团导入工序中的反应条件也没有特别限定，可以任意设定。所述反应条件例如可以与现有的同样或类似的反应的反应条件相同或以其为基准。例如，在通过与羟基或羧基的反应而导入官能团的情况下，可以使用与羟基或羧基中的现有反应的反应条件相同或以其为基准的反应条件。

通过本发明的制造方法制造的石墨烯栅格例如可以用作冷冻电子显微镜用栅格。例如，在基于冷冻电子显微镜进行结构分析时，可以使基于冷电子显微镜的结构分析对象物质结合于通过本发明的制造方法制造的冷冻电子显微镜用栅格(石墨烯栅格)来进行使用。通过本发明的制造方法制造的冷冻电子显微镜用栅格可以是结合了基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的石墨烯栅格，也可以是未结合基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的石墨烯栅格。

[3.石墨烯栅格(冷冻电子显微镜用栅格等)]

如上所述，本发明的石墨烯栅格是具有在石墨烯表面导入了官能团的结构的石墨烯栅格。本发明的石墨烯栅格例如可以用作冷冻电子显微镜用栅格。例如，在基于冷冻电子显微镜进行结构分析时，可以使基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质结合于本发明的冷冻电子显微镜用栅格(石墨烯栅格)来使用。另外，如上所述，本发明的石墨烯栅格例如可以为使基于冷冻电子显微镜的结构分析对象结合于所述本发明的石墨烯栅格的冷冻电子显微镜用栅格。本发明的冷冻电子显微镜用栅格可以是结合了基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的石墨烯栅格，也可以是未结合基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的石墨烯栅格。

本发明的石墨烯栅格的制造方法没有特别限定，例如可以通过所述的本发明的石墨烯栅格的制造方法来制造。如上所述，该制造方法包括所述表面处理工序和所述官能团导入工序。

另外，例如，也可以通过对所述石墨烯，省略所述表面处理工序而进行所述官能团导入工序，从而制造本发明的石墨烯栅格。更具体而言，例如只要未进行所述表面处理工序的所述石墨烯表面具有羟基、羧基等取代基，则通过对这些取代基进行所述官能团导入工序也能够制造本发明的石墨烯栅格。

本发明的石墨烯栅格例如通过使基于冷冻电子显微镜等的结构分析对象物质结合于所述官能团，从而能够抑制或防止所述结构分析对象物质的不均匀分布、取向性的偏差等。所述官能团与所述结构分析对象物质的键合没有特别限定，可举出例如共价键、离子键、金属配位键、主客体相互作用、氢键等，从键合的强度的观点出发，特别优选共价键。

在本发明的石墨烯栅格中，通过使所述官能团与基于冷冻电子显微镜等的结构分析对象物质形成共价键，例如具有如下优点。第一，如果通过共价键将所述结构分析对象物质结合于所述官能团，则即使对冷冻电子显微镜表面进行清洗，所述结构分析对象物质也不容易脱落。因此，通过所述清洗，能够洗掉在所述冷冻电子显微镜表面未形成共价键的不需要的杂质(例如在气-液界面变性的蛋白质等)，能够进行高精度的结构分析。第二，即使所述结构分析对象物质为难以浓缩的物质(例如难以浓缩的蛋白质等)，通过多次反复进行向所述官能团的共价键的形成，能够以高浓度将所述结构分析对象物质导入所述冷冻电子显微镜表面。由此，例如能够显著地缩短用于冷冻电子显微镜用的测定条件的最佳化筛选、结构分析的数据收集所花费的时间。第三，根据共价键能够将所述结构分析对象物质牢固地固定于所述冷冻电子显微镜表面，因此能够抑制或防止所述结构分析对象物质的不均匀分布(局部化，例如凝聚等)、取向性的偏差等。因此，能够高精度且高分辨率地对所述结构分析对象物质进行结构分析。第四，例如通过具有所述第一至第三特征，例如如在后述的实施例中所证实的那样，即使不向所述结构分析对象物质(例如蛋白质)导入标签等，也能够高精度且高分辨率地进行结构分析。因此，不需要向所述结构分析对象物质导入标签等的工序，因此能够在短时间内简便地制造测定样品(结合了所述结构分析对象物质的本发明的冷冻电子显微镜用栅格)。如此，根据本发明，例如与以往相比，能够显著地缩短冷冻电子显微镜用的测定样品制备时间，并且，能够通过比以往更容易的操作来制备所述测定样品。但是，本发明并不限于在所述结构分析对象物质中不导入标签等的方式，也可以向所述结构分析对象物质(例如蛋白质)导入标签等来进行结构分析。

对于以往的冷冻电子显微镜用碳栅格而言，所述栅格与结构分析对象物质的结合力弱，所以如上所述在所述碳栅格上发生所述结构分析对象物质的不均匀分布(局部化)、取向性的偏差等，有可能对结构分析带来障碍。与此相对，如上所述，本发明的石墨烯栅格能够使结构分析对象物质强力地结合。由此，能够抑制或防止所述结构分析对象物质的不均匀分布、取向性的偏差等。

使所述结构分析对象物质与所述官能团结合的方法没有特别限定。例如，可以根据所述官能团与所述结构分析对象物质的组合，适当设定与公知的类似反应的反应条件相同或以其为基准的反应条件。例如，可以在所述结构分析对象物质的溶液(例如水溶液)中以适宜的时间浸渍具有所述官能团的本发明的石墨烯栅格，但并不限于该方法。

所述结构分析对象物质也没有特别限定，例如，可以与通常的冷冻电子显微镜的结构分析对象物质相同，也可以不同。作为所述结构分析对象物质，可举出例如蛋白质、抗体、核酸、病毒、核糖体、线粒体、离子通道、酶和酶复合体等。作为所述蛋白质，可举出例如以物性分类时的膜蛋白质、水溶性蛋白质、糖蛋白质、以功能分类时的酶蛋白质、结构蛋白质、转录因子、转运蛋白质、储存蛋白质、收缩蛋白质、防御蛋白质等，例如除了作为分析的标准蛋白质使用的脱铁铁蛋白以外，还可举出核糖体、蛋白酶体、RNA聚合酶、衣壳、GPCR、光化学系复合体、ATP合成酶、与抗体的复合体等。另外，由它们构成的微管蛋白等也可以成为本发明中的所述结构分析对象物质。此外，作为本发明中的所述结构分析对象物质，还可举出肌肉、胶原蛋白、鞭毛这样的组织本身。另外，例如，也可以使用抗体等作为标记蛋白质，将生命体本身、组织表面等作为本发明中的所述结构分析对象物质。

根据本发明的石墨烯栅格，如上所述，能够抑制或防止所述结构分析对象物质的不均匀分布、取向性的偏差等。另外，根据本发明的冷冻电子显微镜用栅格，对于在以往的冷冻电子显微镜用栅格中难以进行结构分析的物质也能够进行结构分析。例如，由于膜蛋白质等难以结晶化，所以利用以往的冷冻电子显微镜用栅格难以进行三维结构分析。与此相对，本发明的石墨烯栅格由于能够将所述膜蛋白质等结构分析对象物质强力地结合而使结构稳定化，因此能够进行结构分析，例如也能够进行三维结构分析。另外，根据本发明的石墨烯栅格，例如也能够进行蛋白质的单粒子分析等。

本发明的石墨烯栅格的使用方法没有特别限定，例如，也可以与一般的冷冻电子显微镜用栅格的使用方法相同。例如，与通常的冷冻电子显微镜用栅格同样地，通过使用冰包埋法对所捕捉的结构分析对象物质进行显微镜观察，能够进行结构分析。

在本发明中，例如如上所述，即使不对蛋白质附加标签等，也能够以高精度且高分辨率进行结构分析。但是，如上所述，本发明并不限定于在所述结构分析对象物质中不导入标签等的方式，也可以向所述结构分析对象物质(例如蛋白质)导入标签等来进行结构分析。

另外，本发明的石墨烯栅格的用途并不限于冷冻电子显微镜用栅格，能够用于任意的广泛的用途，例如，除了生物反应器、传感器(例如酶传感器等生物传感器)、微反应器等用途以外，还可以用于将抗体、各种蛋白质与珠等连结时的检测试剂或亲和柱色谱等。

实施例

以下，针对本发明的实施例进行说明。但是，本发明不限于以下的实施例。

[参考例1]

如下所述，通过本发明的所述表面处理工序对石墨烯表面进行改性，制造石墨烯表面经改性的物质。

在本参考例中，使用气相中的反应进行了所述表面处理工序。

首先，如图1所示，在直径5cm的培养皿3中加入20mL去离子水，进一步溶解亚氯酸钠NaClO

在本实施例中，作为石墨烯6，使用粉末状的石墨烯(富士胶片和光纯药株式会社：商品名“06-0313”)，制造了石墨烯6的表面经改性的物质。

对于所述石墨烯6，在表面处理工序(氧化反应)前和后分别进行X射线光电子能谱法(XPS)测定，检测C1s(碳原子的1s轨道)的能量峰位置，由此确认氧化反应的进行。图2的曲线图示出了其XPS测定结果。在各图中，横轴为结合能(eV)，纵轴为峰值强度的相对值(cps)。

如上所述，图2示出了石墨烯的表面处理工序(氧化反应)前后的XPS测定结果。如图所示，在反应30分钟后没有大的变化，但在反应60分钟后，观察到C＝C键峰的衰减、C-OH键峰和C-O-C键峰的增大，因此确认到石墨烯表面的氧化。另外，将所述基于XPS的元素分析结果示于下述表1。如表1所示，氧化反应后O原子数的比率增加，由此也确认到石墨烯表面的氧化。

[表1]

石墨烯的元素比率

另外，利用AFM(原子力显微镜)分别观察表面处理工序(氧化反应)前后的所述石墨烯的表面状态。具体而言，使用扫描型探针显微镜(岛津制作所，商品名SPM-9500J3，悬臂：OLYMPUS社制，商品名OMCL-AC200TS-C3)进行了表面形态的评价。将其结果示于图21。如图所示，根据该AFM的评价，通过所述表面处理工序(氧化反应)未观察到所述石墨烯的损伤等，未确认到所述石墨烯的劣化。

另外，推测本实施例中的氧化后的石墨烯表面的结构例如如下述化学式E1所示。但是，该结构是推测的结构的一个例子。

[化E1]

[参考例2]

对于参考例1的石墨烯，通过以下的方法使若丹明B结合，进而测定荧光强度。

首先，在试管内加入6mg的若丹明B。接下来，向其中加入2ml去离子水，进一步加入0.1M乙酸水溶液，使pH为6.5。将这些溶液准备2个，分别加入氧化反应前的石墨烯和氧化反应60分钟后的石墨烯，在室温下搅拌15分钟。各反应后使用3mL去离子水清洗2次，减压干燥24h。然后，分别使用UV-vis光谱仪，以555nm作为激发光，在560～660nm的范围内测定荧光强度。

图3中示出了石墨烯的荧光强度测定结果。在该图中，横轴为波长(nm)，纵轴为峰值强度(相对值)。如图所示，氧化反应后的石墨烯575nm附近的峰值强度增大，因此确认到结合有若丹明B。需要说明的是，由此可以推测，在氧化反应后，在石墨烯的表面导入了羟基或羧基或这两者。

[实施例1]

制造石墨烯栅格，进行使该石墨烯栅格与二氧化氯自由基反应的表面处理工序，对表面进行改性(氧化)，制造表面经改性(氧化)的石墨烯栅格。此外，进行向所述表面经改性(氧化)的石墨烯栅格表面导入官能团的官能团导入工序，制造导入有官能团的石墨烯栅格。进而，使基于冷冻电子显微镜的作为结构分析对象物质的蛋白质接合(结合)于所述导入有官能团的石墨烯栅格。

[石墨烯栅格的制造]

使由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)-石墨烯-Cu这三层构成的片材以Cu面与0.5mol/L的过硫酸铵水溶液的水面接触的方式漂浮，静置30分钟，由此使Cu层溶解。将如此除去Cu层而得到的PMMA-石墨烯片在超纯水中每次漂浮10分钟，共计2次进行清洗。然后，在充满超纯水的膜张紧器(应研商事社制、商品名collodion膜张紧器)的底部排列TEM用的Mo栅格(Quantifoil Micro Tools GmbH社制、商品名QUANTIFOIL)及Au栅格(Quantifoil MicroTools GmbH社制、商品名QUANTIFOIL)。此外，使所述PMMA-石墨烯片漂浮于该膜张紧器的水面，轻轻地将水排出，由此在所述栅格上贴附所述PMMA-石墨烯片。将该栅格在室温下干燥1小时后，在130℃下进行20分钟加热处理。然后，分别将所述栅格依次浸渍于60℃的丙酮中60分钟、室温(约25℃)的氯仿中30分钟、乙酸中3小时、异丙醇中10分钟，进行共计2次，除去PMMA。最后，在100℃下进行10分钟加热处理，制造Mo栅格或Au栅格表面被石墨烯被覆的石墨烯栅格。

[石墨烯栅格与二氧化氯自由基的反应(表面处理工序)]

将由所述Mo栅格或Au栅格制造的所述石墨烯栅格分别在130℃下进行15分钟加热处理。通过与参考例1和图1中说明方法同样的方法，利用二氧化氯自由基(ClO

[官能团导入工序]

根据下述方案1，向所述表面处理工序后的石墨烯栅格表面导入官能团(官能团导入工序)。

[化S1]

具体而言，所述官能团导入工序如下进行。首先，使所述表面处理工序后的石墨烯栅格浸渍于2mmol/L聚乙二醇2-氨基乙基醚乙酸、Poly(ethylene glycol)2-aminoethylether acetic acid(平均分子量2100)DMSO溶液中，在室温下静置过夜。由此，如所述方案1所示，使所述石墨烯栅格表面的环氧化物与所述聚乙二醇2-氨基乙基醚乙酸反应而导入官能团。

进而，使基于冷冻电子显微镜的作为结构分析对象物质的蛋白质接合(结合)于所述进行了官能团导入工序的石墨烯栅格。具体而言，将所述石墨烯栅格在包含5mmol/L的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和5mmol/L的EDC的水溶液中浸渍15分钟后，在包含0.2mg/mL的β-半乳糖苷酶(B-gal)的水溶液中浸渍60分钟，如所述方案1所示，通过与存在于β-半乳糖苷酶(B-gal)中的氨基反应而结合。

[参考例3]

如下所述，通过本发明的所述表面处理工序对石墨烯栅格表面进行改性，制造石墨烯栅格表面经改性的物质。

首先，亚氯酸钠NaClO

如图4的下部所示，在所述表面处理工序(表面的氧化)前和后的石墨烯栅格表面滴加水滴，对该水滴进行照片拍摄，通过目视照片分别测定了水的接触角。其结果，水的接触角在所述表面处理工序前为83°，与此相对，在所述表面处理工序刚结束后为51°。即，通过所述表面处理工序，水的接触角减少，因此确认了所述石墨烯栅格表面的亲水性增加。另外，在所述表面处理工序后经过1小时后，再次用相同的方法测定了水的接触角，其结果，如图所示为59°。即，确认到即使在所述表面处理工序后经过1小时也保持了所述石墨烯栅格表面的亲水性。

[实施例2]

制造石墨烯栅格，进行使该石墨烯栅格与二氧化氯自由基反应的表面处理工序，对表面进行改性(氧化)，制造表面经改性(氧化)的石墨烯栅格。此外，进行向所述表面经改性(氧化)的石墨烯栅格表面导入官能团的官能团导入工序，制造导入有官能团的石墨烯栅格。进而，使基于冷冻电子显微镜的作为结构分析对象物质的蛋白质接合(结合)于所述导入有官能团的石墨烯栅格。其概要如图5以及图6的方案所示。以下，进一步进行具体说明。

[石墨烯栅格的制造]

通过与实施例1中说明的“石墨烯栅格的制造”完全相同的方法，制造Au栅格表面被石墨烯覆盖的石墨烯栅格。

[石墨烯栅格与二氧化氯自由基的反应(表面处理工序)]

通过与实施例1中说明的“石墨烯栅格与二氧化氯自由基的反应(表面处理工序)”完全相同的方法，对由所述Au栅格制造的所述石墨烯栅格进行所述表面处理工序(表面的氧化)。对此，与实施例1同样地进行XPS测定，其结果，在所述表面处理工序后，观察到C＝C键峰的衰减、C-OH键峰及C-O-C键峰的增大，进而O原子数的比率增加，由此也确认到石墨烯表面的氧化。

[官能团导入工序]

使环氧氯丙烷与所述表面处理工序后的石墨烯栅格表面反应，导入官能团(官能团导入工序)。具体而言，首先，用镊子固定所述表面处理工序后的所述石墨烯栅格，将1体积％的环氧氯丙烷(Epichlorohydrin)水溶液(3μL)载置于石墨烯侧的面上，在室温下静置5分钟。然后，使用5μL的HEPES缓冲液(25mM HEPES pH8.0、50mM NaCl、2mM MgCl

进而，使基于冷冻电子显微镜的作为结构分析对象物质的蛋白质接合(结合)于所述进行了官能团导入工序的石墨烯栅格。具体而言，通过将包含0.2mg/mL的β-半乳糖苷酶(B-gal)的所述HEPES缓冲液(3μL)载置于导入了所述2,3-环氧丙基的石墨烯栅格上并在室温下静置5分钟，从而使导入到所述石墨烯栅格表面的2,3-环氧丙基与存在于β-半乳糖苷酶(B-gal)中的氨基反应而结合。然后，使用所述HEPES缓冲液(5μL)清洗3次，洗去剩余的β-半乳糖苷酶(B-gal)。需要说明的是，推测所述官能团导入工序和β-半乳糖苷酶的结合是通过按照图6上部的方案的反应而进行的，但也可能发生除此以外的反应。例如，在图6上部的方案中，所述石墨烯栅格表面的羟基(OH)与环氧氯丙烷反应，但也有羟基以外的取代基(例如羧基等)与环氧氯丙烷反应的可能性。

通过使用了2％乙酸双氧铀水溶液的负染色法，以倍率15,000倍、30,000倍及60,000倍分别对结合了所述β-半乳糖苷酶的石墨烯栅格表面进行观察，其结果，如图6下部的照片所示，可确认在石墨烯栅格表面结合有β-半乳糖苷酶。

[实施例3]

通过与实施例2相同的方法，制造在石墨烯栅格表面结合有β-半乳糖苷酶的电子显微镜用栅格(能够用作冷冻电子显微镜用栅格)。进而，将β-半乳糖苷酶水溶液的浓度变更为0.5mg/mL或1.2mg/mL来代替0.2mg/mL，或者将β-半乳糖苷酶水溶液的浓度变更为0.5mg/mL并进一步进行1M Tris处理，除此以外，通过与实施例2相同的方法，制造了在石墨烯栅格表面结合有β-半乳糖苷酶的电子显微镜用栅格。1M Tris处理是基于如下目的进行的：在通过环氧氯丙烷的官能团导入工序后，将1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH8.0水溶液(3μL)载置于导入了所述2,3-环氧丙基的石墨烯栅格上，在室温下静置5分钟后，用所述HEPES缓冲液(5μL)清洗3次，通过该操作，使具有氨基的大量过剩的Tris与所述石墨烯栅格上的2,3-环氧丙基反应，阻断之后的与β-半乳糖苷酶的氨基的反应。然后，使用液体乙烷对如此制造的结合有各个β-半乳糖苷酶的电子显微镜用栅格进行急速冷冻，使用冷冻电子显微镜(日本电子株式会社制、商品名Cryo ARM 300)以倍率50,000倍进行观察，其结果，如图7所示，可确认β-半乳糖苷酶仅结合于未进行1M Tris处理的石墨烯栅格表面。

进而，使用如上所述制造的、在石墨烯栅格表面结合有β-半乳糖苷酶的电子显微镜用栅格，通过冷冻电子显微镜(日本电子株式会社制、商品名Cryo ARM 300)进行图像数据的收集，基于所得到的数据集，使用结构分析软件RELION(商品名)进行结合于所述表面的β-半乳糖苷酶的结构分析。其结果，如图8～图10所示，由从1000张图像提取的288,402颗粒以

[实施例4]

通过与实施例2相同的方法，对石墨烯栅格进行表面处理工序(基于二氧化氯自由基的氧化反应)和官能团导入工序(基于与环氧氯丙烷的反应的环氧基的导入)。然后，进一步加入40μL的1H,1H-十一氟己胺(1H,1H-Undecafluorohexylamine)并搅拌60分钟使其反应，得到了在石墨烯中导入了氟烷基氨基的栅格。得到的栅格用去离子水清洗2次，在减压下干燥24h。

本实施例中的官能团导入反应推测为图22上部的方案。如图所示，据认为：纳米金刚石表面的羟基的氢被2,3-环氧丙基取代，进而在环氧基与1H,1H-十一氟己胺之间发生加成反应。另外，除了分别不进行表面处理工序(基于二氧化氯自由基的氧化反应)和官能团导入工序(基于与环氧氯丙烷的反应的环氧基的导入)中的一者或两者以外，同样地制备了与1H,1H-十一氟己胺反应的样品，与本实施例的栅格一起分别测定了XPS。将该XPS的测定结果示于图22下部的曲线图及表格。如图所示，仅进行了表面处理工序(基于二氧化氯自由基的氧化反应)和官能团导入工序(基于与环氧氯丙烷的反应的环氧基的导入)的本实施例的栅格(Sample5)在表面观测到氟原子的存在，因此确认到发生了与1H,1H-十一氟己胺的反应(栅格表面上的结合)。

[实施例5]

在石墨烯栅格的制造工序中，使用由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)-石墨烯-Cu-石墨烯这四层构成的片材，使用耐水研磨纸(P3000)除去不在PMMA侧的石墨烯，并且在除去PMMA的工序中，不进行基于丙酮和氯仿的处理，而是进行共计2次每次2小时乙酸中的浸渍，然后浸渍于异丙醇10分钟，进而使用包含0.3mg/mL的GroEL的HEPES缓冲液(25mM HEPES pH8.0、50mM NaCl)代替包含β-半乳糖苷酶的缓冲液，除此以外，通过与实施例2相同的方法，制造了在石墨烯栅格表面结合有GroEL的电子显微镜用栅格(能够用作冷冻电子显微镜用栅格)。需要说明的是，GroEL是伴侣蛋白质的一种，是成为基于冷冻电子显微镜的分析对象的蛋白质。进而，不进行基于环氧氯丙烷水溶液的处理(作为官能团的环氧基的导入)，除此以外，同样地制造了电子显微镜用栅格。对于这2种电子显微镜用栅格，通过使用了2％乙酸双氧铀水溶液的负染色法对表面进行了观察。图11的照片示出了其结果。如图11所示，进行了基于环氧氯丙烷水溶液处理(作为官能团的环氧基的导入)的电子显微镜用栅格(1)观察到与表面结合的GroEL。与此相对，未进行基于环氧氯丙烷水溶液处理(作为官能团的环氧基的导入)的栅格(2)完全未观察到GroEL。

[实施例6]

使用包含3.2mg/mL的GroEL的HEPES缓冲液(25mM HEPES pH8.0、50mM NaCl)代替包含β-半乳糖苷酶的缓冲液，除此以外，通过与实施例2相同的制造方法，制造了在石墨烯栅格表面结合有GroEL的电子显微镜用栅格(能够用作冷冻电子显微镜用栅格)。进而，使用在该石墨烯栅格表面结合有GroEL的电子显微镜用栅格，通过冷冻电子显微镜(日本电子株式会社制、商品名Cryo ARM 300)进行图像数据的收集，基于所得到的数据集，使用结构分析软件RELION(商品名)进行结合于所述表面的GroEL的结构分析。其结果，如图12～图16和19所示，由从531张图像提取的115,424颗粒以

需要说明的是，关于实施例3及6中的使用冷冻电子显微镜(日本电子株式会社制、商品名Cryo ARM 300)进行了β-半乳糖苷酶或GroEL的结构分析的结果，汇总示于图17的表中。

[实施例7]

使用1.0mg/mL的V1-ATPase水溶液代替包含β-半乳糖苷酶的缓冲液，除此以外，通过与实施例2相同的方法，制造在石墨烯栅格表面结合有V1-ATPase的电子显微镜用栅格(能够用作冷冻电子显微镜用栅格)。需要说明的是，V1-ATPase是酶的一种，是成为基于冷冻电子显微镜的分析对象的蛋白质。进而，使用在该石墨烯栅格表面结合有V1-ATPase的电子显微镜用栅格，通过冷冻电子显微镜(日本电子株式会社制、商品名Cryo ARM 300)进行图像数据的收集，基于所得到的数据集，使用结构分析软件RELION(商品名)进行与所述表面结合的V1-ATPase的结构分析。其结果，如图18和图20所示，由提取的约300,000颗粒以约

[实施例8]

通过与实施例2相同的方法，对石墨烯栅格进行了表面处理工序(基于二氧化氯自由基的氧化反应)和官能团导入工序(基于与环氧氯丙烷的反应的环氧基的导入)。如此，制造导入了官能团(环氧基)的石墨烯栅格(下述方案2中的左上)。然后，进一步按照下述方案2，得到导入了马来酰亚胺基的石墨烯栅格(下述方案2中的右上)。进而，按照下述方案2中的下段的方案，使基于冷冻电子显微镜的作为结构分析对象物质的蛋白质(β-半乳糖苷酶)接合(结合)于该石墨烯栅格。

[化S2]

所述方案2的反应具体如下进行。首先，如上所述，通过与实施例2相同的方法，对石墨烯栅格进行表面处理工序(基于二氧化氯自由基的氧化反应)和官能团导入工序(基于与环氧氯丙烷的反应的环氧基的导入)，制造导入了官能团(环氧基)的石墨烯栅格(所述方案2中的左上)。接着，将56mM N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐(所述方案2的上段中央)的pH9.0水溶液(3μL)载置于该导入了官能团(环氧基)的石墨烯栅格，在室温下静置5分钟后，用蒸馏水(5μL)清洗3次，洗去剩余的N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐。如此，通过使导入至所述石墨烯栅格表面的2,3-环氧丙基与存在于N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐中的氨基反应，从而得到导入有马来酰亚胺基的石墨烯栅格(所述方案2中的右上)。

进而，使基于冷动电子显微镜的作为结构分析对象物质的蛋白质(β-半乳糖苷酶)接合(结合)于所述导入有马来酰亚胺基的石墨烯栅格。具体而言，将包含0.5mg/mL的β-半乳糖苷酶(B-gal)的Tris缓冲液(25mM Tris pH7.0、50mM NaCl、2mM MgCl

通过使用2％乙酸双氧铀水溶液的负染色法，以倍率15,000倍对结合有所述β-半乳糖苷酶的石墨烯栅格表面进行观察，其结果，如图24的照片所示，可确认在石墨烯栅格表面结合有β-半乳糖苷酶。

[实施例9]

通过与实施例2相同的方法，对石墨烯栅格进行表面处理工序(基于二氧化氯自由基的氧化反应)和官能团导入工序(基于与环氧氯丙烷的反应的环氧基的导入)。如此，制造导入了官能团(环氧基)的石墨烯栅格(下述方案3中的左上)。进而，如下述方案3所示，使该石墨烯栅格与NH

[化S3]

所述方案3的反应具体如下进行。首先，如上所述，通过与实施例2相同的方法，对石墨烯栅格进行表面处理工序(基于二氧化氯自由基的氧化反应)和官能团导入工序(基于与环氧氯丙烷的反应的环氧基的导入)，制造导入了官能团(环氧基)的石墨烯栅格(所述方案3中的左上)。接着，将42mM NH

进而，使基于冷冻电子显微镜的作为结构分析对象物质的蛋白质接合(结合)于所述进行了官能团导入工序的石墨烯栅格。具体而言，将包含0.3mg/mL的GroEL的HEPES缓冲液(25mM HEPES pH8.0、50mM NaCl)载置于所述导入了2,3-环氧丙基和PEG链的石墨烯栅格上并在室温下静置5分钟，从而使所述导入至石墨烯栅格表面的环氧基与存在于GroEL中的氨基反应而进行结合。然后，使用所述HEPES缓冲液(5μL)清洗3次，洗去剩余的GroEL。如此，得到接合(结合)了基于冷冻电子显微镜的作为结构分析对象物质的蛋白质(GroEL)的石墨烯栅格(所述方案3的右下)。

进而，通过使用2％乙酸双氧铀水溶液的负染色法，以倍率15,000倍对所述结合有GroEL的石墨烯栅格表面进行观察，其结果，如图25下部的照片所示，可确认在石墨烯栅格表面结合有GroEL。

[实施例10]

使用铜基板上的单层石墨烯(ACS材料：商品名“CVCU1S22”)代替由实施例1的所述Au栅格制造的所述石墨烯栅格，除此以外，利用与实施例1中说明的“石墨烯栅格和二氧化氯自由基的反应(表面处理工序)”完全相同的方法，对所述铜基板上的单层石墨烯(石墨烯栅格)进行与二氧化氯自由基反应的表面处理工序，对表面进行改性(氧化)，制造了石墨烯表面经改性(氧化)的石墨烯栅格。进而，按照下述方案4，进行在气相中向所述表面经改性(氧化)的石墨烯表面的羟基导入新的官能团的官能团导入工序，制造了导入有官能团的石墨烯栅格(官能团导入工序)。

[化S4]

[所述表面处理工序后的石墨烯与三氟乙酸酐的反应]

所述方案4上段的反应具体如下进行。首先，在6cm×6cm的玻璃制培养皿内放入盖玻片，在其上载置所述表面处理工序后的铜基板上石墨烯(石墨烯栅格)。进而，在所述玻璃制培养皿的内侧配置装入了三氟乙酸酐(Trifluoroacetic anhydride)(分子量210)(2mL)的3cm×3cm的玻璃制培养皿，盖上盖子后在室温下静置5小时。由此，如所述方案4的上段所示，使所述石墨烯表面的羟基与所述三氟乙酸酐反应而导入三氟乙酰基。如此，制造了导入有三氟乙酰基作为官能团的石墨烯栅格(官能团导入工序)。

[所述表面处理工序后的石墨烯与三氟甲磺酸酐的反应]

所述方案4下段的反应具体如下进行。首先，在6cm×6cm的玻璃制培养皿内放入盖玻片，在其上载置所述表面处理工序后的铜基板上石墨烯(石墨烯栅格)。进而，在所述玻璃制培养皿的内侧配置装入三氟甲磺酸酐(Trifluoromethanesulfonic anhydride)(分子量282)(2mL)的3cm×3cm的玻璃制培养皿，盖上盖子后在室温下静置5小时。由此，如所述方案4的下段所示，使所述石墨烯表面的羟基与所述三氟甲磺酸酐反应而导入三氟甲基磺酰基。如此，制造了导入有三氟甲基磺酰基作为官能团的石墨烯栅格(官能团导入工序)。

对于所述铜基板上石墨烯，在表面处理工序(氧化反应)前后、与三氟乙酸酐的反应后和与三氟甲磺酸酐的反应后，分别进行X射线光电子能谱法(XPS)测定，进行元素分析。将基于所述XPS的元素分析结果示于下述表2。如下述表2所示，与三氟乙酸酐反应后，F原子数的比率增加，与三氟甲磺酸酐反应后，F原子数和S原子的比率增加。因此，确认了石墨烯表面的官能团化。

[表2]

石墨烯的元素比率

如通过以上的实施例所证实的那样，根据本发明，能够在极短时间内简便地制备冷冻电子显微镜用的测定样品。进而，如通过以上的实施例所证实的那样，根据本发明，能够在不附加标签的情况下以极高精度且高分辨率地对β-半乳糖苷酶、GroEL、V1-ATPase这样的多种多样的蛋白质进行结构分析。

以上，参照实施方式说明了本发明，但本发明不限于上述实施方式。对于本发明的构成或详情，能够在本发明的范围内进行本领域技术人员可理解的各种变更。

产业上的利用可能性

如上所述，根据本发明，可以提供能够抑制或防止在基于冷冻电子显微镜的结构分析中结构分析对象物质的不均匀分布、取向性的偏差等的冷冻电子显微镜用栅格、冷冻电子显微镜用栅格的制造方法、结构分析对象物质的结构分析方法。根据本发明，例如在极短时间内制造结合有蛋白质等结构分析对象物质的冷冻电子显微镜用栅格，能够以极高的分辨率进行所述结构分析对象物质的结构分析，因此其产业上利用价值巨大。

符号说明

1 培养皿

2 盖

3 培养皿

4 培养皿

5 自由基生成用反应体系

6 碳同素异形体

11 有机层(有机相)

12 水层(水相)。