一种视网膜色素上皮细胞分离装置及分离方法

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种视网膜色素上皮细胞分离装置及分离方法。

背景技术

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞是位于脉络膜毛细血管和感光细胞外节之间的单层六角形细胞，这些细胞密集地填充有色素颗粒。RPE细胞是视觉转导中所必需的也是构成血视网膜屏障(BRB)的外层，控制代谢物进出循环系统的通道。RPE细胞吞噬和消化光感受器外节脱落的膜，在维持视觉功能和光感受器的存活中起重要作用。视网膜色素上皮的原代培养已被证明保留了许多体内RPE细胞正常的生理功能，包括血视网膜屏障功能，吞噬光感受器外段的能力，以及以极化方式运输病毒蛋白的能力。原代RPE细胞分离技术是研究视疲劳、视网膜损伤、视网膜病变等眼部相关疾病和亚健康潜在机制和发病机制的重要工具，并能够研究RPE细胞结构和功能的变化及其对外部BRB的影响，并能进行药物或功能食品前期的筛选。

目前，主要使用幼年小鼠进行RPE细胞的分离，因为它们的RPE细胞与Bruch膜的附着力较弱，可以通过酶解或者机械分离法获得。但无论是哪种方法，其分离步骤都需要通过物理方法。RPE细胞附着在眼罩上，在现有技术中，通常会采用刮刀刮取眼罩获取RPE细胞，或者使用注射液形成一定冲击力的水流冲刷眼罩获取RPE细胞。

但是，采用刮刀和注射液冲刷都会容易造成RPE细胞的破损，导致获得的RPE细胞产量大大降低。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中采用刮刀和注射液冲刷都会容易造成RPE细胞的破损，导致获得的RPE细胞产量大大降低的缺陷，从而提供一种视网膜色素上皮细胞分离装置及分离方法。

为了解决上述问题，本发明提供了一种视网膜色素上皮细胞分离装置，包括：

主体，所述主体内具有空腔，所述空腔内具有磷酸缓冲盐溶液，所述主体的一端具有开口；

分离组件，所述分离组件包括连接杆和分离件，所述分离件内具有放置眼罩的腔体，所述腔体内设置有滤网，所述腔体通过滤网与所述空腔连通，所述分离件设置在所述空腔内并浸泡在磷酸缓冲盐溶液内，所述连接杆的一端设置在所述空腔内与所述分离件固定连接，所述连接杆的另一端伸出所述开口，所述分离件具有靠近所述开口和远离所述开口的两种状态，所述连接杆的另一端适于在外力驱动下使所述分离件在两种状态下进行切换。

进一步的，所述分离件包括分离上盖和分离下盖，所述连接杆与所述分离上盖固定连接，所述分离上盖和所述分离下盖分别设置有第一弧形滤网和第二弧形滤网，所述分离上盖与所述分离下盖固定连接，所述第一弧形滤网设置在所述第二弧形滤网内，所述第一弧形滤网的外壁与所述第二弧形滤网的内壁抵接，所述第一弧形滤网与所述第二弧形滤网围合为所述腔体，所述眼罩设置在所述腔体内并与所述第二弧形滤网的弧形面贴合，所述眼罩上的视网膜色素上皮细胞适于所述分离件在两种状态下切换时，从所述第一弧形滤网和所述第二弧形滤网流出至空腔内。

进一步的，所述分离组件还包括固定盖，所述固定盖扣合在所述主体的开口处，所述连接杆的一端贯穿所述固定盖与所述分离件固定连接。

进一步的，所述连接杆的另一端上设置有压簧，所述压簧的一端与所述连接杆固定连接，所述压簧的另一端与所述固定盖固定连接。

进一步的，所述连接杆包括第一杆段和第二杆段，所述第二杆段的一端与所述分离上盖固定连接，所述第二杆段的另一端与所述第一杆段的一端可拆卸连接，所述第一杆段的另一端伸出所述开口。

进一步的，所述第一杆段的一端具有连接部，所述连接部内具有连接孔，所述第二杆段的另一端与所述连接孔插接。

进一步的，所述分离下盖上设置有卡扣，所述分离下盖通过所述卡扣与所述分离上盖卡接。

进一步的，所述连接杆的另一端上设置有按压部。

进一步的，所述主体为透明结构，所述主体上设置有刻度。

本发明还提供了一种视网膜色素上皮细胞分离方法，包括以下步骤：

S1：摘除小鼠的眼球，放置在D-Hank’s液中进行解剖，取出含有视网膜色素上皮细胞的眼罩；

S2：将眼罩依次移入第一酶解液和第二酶解液中，在第一酶解液中去除视网膜色素上皮细胞表面残留的玻璃体和视网膜，在第二酶解液中使视网膜色素上皮细胞与Bruch膜之间的连接变得松散；

S3：加入10％胎牛血清的DMEM-F12培养基终止消化，随后将眼罩放置在权利要求1至9任一项所述的视网膜色素上皮细胞分离装置中分离件的腔体内，通过缓慢多次按压连接杆，使分离件在靠近主体开口和远离主体开口的两种状态下进行切换，腔体内的眼罩受到冲击力，眼罩上的视网膜色素上皮细胞从眼罩上进行分离，通过滤网流入空腔内的磷酸缓冲盐溶液中；

S4：将采集完视网膜色素上皮细胞的主体进行离心，离心后将主体内的溶液转移至培养基中即可。

本发明具有以下优点：

1.本发明公开了一种视网膜色素上皮细胞分离装置，通过在主体的空腔内加入磷酸缓冲盐溶液，并将放置有眼罩的分离件设置在主体内并浸泡在磷酸缓冲盐溶液中，分离件与连接杆连接，按压连接杆使分离件进行上下移动，使眼罩受到磷酸缓冲盐溶液的冲击力，使视网膜色素上皮细胞与眼罩进行分离，并通过滤网流入磷酸缓冲盐溶液中，从而可以起到快速分离视网膜色素上皮细胞的目的，也防止了对视网膜色素上皮细胞造成破损，进一步的，不需要采用显微镜进行分离，提高了效率的同时还降低了分离难度。

2.此结构的视网膜色素上皮细胞分离装置，分离上盖和分离下盖上分别设置有第一弧形滤网和第二弧形滤网，第一弧形滤网与第二弧形滤网围合为腔体，眼罩放置在腔体中，将滤网设置为弧形是为了使眼罩与滤网进行贴合，在分离过程中，冲击力可作用在眼罩的每一个地方，从而可增大视网膜色素上皮细胞的分离数量，同时，弧形滤网可一定程度上减少阻力，使工作人员更省力。

3.此结构的视网膜色素上皮细胞分离装置，固定盖扣合在主体的开口处，可防止空气中的灰尘、杂物进入主体内污染视网膜色素上皮细胞。

4.此结构的视网膜色素上皮细胞分离装置，在连接杆上设置压簧，压簧的两端分别与连接杆和固定盖连接，从而使工作人员更方便的按压连接杆，使分离件进行上下往复运动。

5.此结构的视网膜色素上皮细胞分离装置，第二杆段的一端与分离上盖固定连接，另一端与第一杆段可拆卸连接，从而可在每次分离时更换分离件，可有效的防止视网膜色素上皮细胞被污染。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中视网膜色素上皮细胞分离装置的示意图；

图2为本发明实施例1中分离件的爆炸图；

图3为本发明实施例1中分离件的截面图；

图4为本发明实施例1中分离下盖的主视图；

附图标记说明：

1、主体；2、磷酸缓冲盐溶液；3、分离上盖；4、分离下盖；5、第一弧形滤网；6、第二弧形滤网；7、固定盖；8、压簧；9、第一杆段；10、第二杆段；11、连接部；12、卡扣；13、按压部；14、刻度。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

实施例1

如图1至图4所示，本实施例公开了一种视网膜色素上皮细胞分离装置，包括：主体1和分离组件。主体1内具有空腔，空腔内具有磷酸缓冲盐溶液2，主体1的一端具有开口。分离组件包括连接杆和分离件，分离件内具有放置眼罩的腔体，腔体内设置有滤网，腔体通过滤网与空腔连通，分离件设置在空腔内并浸泡在磷酸缓冲盐溶液2内，连接杆的一端设置在空腔内与分离件固定连接，连接杆的另一端伸出开口，分离件具有靠近开口和远离开口的两种状态，连接杆的另一端适于在外力驱动下使分离件在两种状态下进行切换。

具体的，在本实施例中，主体1为离心管，离心管的空腔内具有磷酸缓冲盐溶液2，离心管的上方具有开口。连接杆的下端与分离件固定连接，连接杆的下端与分离件通过开口设置在离心管内，并使分离件浸泡在磷酸缓冲盐溶液2内，分离件内具有放置眼罩的腔体，腔体内具有滤网，腔体通过滤网与空腔连通，磷酸缓冲盐溶液2可通过滤网进入腔体内，使眼罩浸泡在磷酸缓冲盐溶液2中。连接杆的上端伸出开口，分离件具有靠近开口和远离开口的两种状态，连接杆的上端适于在外力驱动下使分离件在两种状态下进行切换。通过缓慢按压连接杆的上端，使连接杆带动分离件向下移动，缓慢拉拽连接杆的上端，使连接杆带动分离件向上移动，防止速度过快、力量太大导致视网膜色素上皮细胞破损或眼罩破损，驱动连接杆进行上下往复运动，带动分离件进行上下往复运动，通过冲击力将眼罩上的视网膜色素上皮细胞脱离，并通过滤网流入离心管内。

进一步的，主体1为透明结构，主体1上设置有刻度14。

进一步的，分离件包括分离上盖3和分离下盖4，连接杆与分离上盖3固定连接，分离上盖3和分离下盖4分别设置有第一弧形滤网5和第二弧形滤网6，分离上盖3与分离下盖4固定连接，第一弧形滤网5设置在第二弧形滤网6内，第一弧形滤网5的外壁与第二弧形滤网6的内壁抵接，第一弧形滤网5与第二弧形滤网6围合为腔体，眼罩设置在腔体内并与第二弧形滤网6的弧形面贴合，眼罩上的视网膜色素上皮细胞适于分离件在两种状态下切换时，从第一弧形滤网5和第二弧形滤网6流出至空腔内。

具体的，如图2和图3所示，分离上盖3与连接杆固定连接，分离上盖3与分离下盖4上分别设置有第一弧形滤网5和第二弧形滤网6，第一弧形滤网5和第二弧形滤网6相互对应，第一弧形滤网5和第二弧形滤网6均凸出分离上盖3和分离下盖4底面，分离上盖3固定设置在分离下盖4的上端，分离上盖3的下端面与分离下盖4的上端面贴合，第一弧形滤网5可插设在第二弧形滤网6中，第一弧形滤网5的外壁与第二弧形滤网6的内壁抵接，第一弧形滤网5的底部和第二弧形滤网6的底部之间围合成腔体，眼罩可设置在腔体内。因眼罩为弧形结构，弧形滤网可方便眼罩贴合在弧形滤网上，在分离时可使眼罩的每个地方充分受到冲击力，从而可增大视网膜色素上皮细胞的分离数量，同时，弧形滤网可一定程度上减少阻力，使工作人员更省力的移动连接杆。驱动连接杆使离上盖与分离下盖4进行上下往复运动时，眼罩上的视网膜色素上皮细胞会穿过第一弧形滤网5和第二弧形滤网6进入主体1内。

在本实施例中，腔体的直径与眼罩的直径相同，眼罩可更好的贴合在第二弧形滤网6上。

进一步的，分离组件还包括固定盖7，固定盖7扣合在主体1的开口处，连接杆的一端贯穿固定盖7与分离件固定连接。

具体的，固定盖7扣合在主体1的开口处可将主体1进行密封，防止灰尘等进入主体1内将视网膜色素上皮细胞污染，同时，固定盖7还可对连接杆起到限位导向的作用，防止连接杆在往复运动时碰触到主体1内壁，使眼罩受到撞击力造成破损。

进一步的，连接杆的另一端上设置有压簧8，压簧8的一端与连接杆固定连接，压簧8的另一端与固定盖7固定连接。

进一步的，连接杆包括第一杆段9和第二杆段10，第二杆段10的一端与分离上盖3固定连接，第二杆段10的另一端与第一杆段9的一端可拆卸连接，所述第一杆段9的另一端伸出开口。

具体的，如图1和图2所示，连接杆包括第一杆段9和第二杆段10，第一杆段9的下端与第一弧形滤网5固定连接，第一杆段9的上端与第二杆段10的下端可拆卸连接，第二杆段10的上端贯穿固定盖7设置在固定盖7外侧，第二杆段10的上端设置有压簧8，压簧8的两端分别与第二杆段10和固定盖7连接，按压第二杆段10，第二杆段10带动第一杆段9和分离件向下移动；减小对第二杆段10的压力，在压簧8弹力的作用下第二杆段10带动第一杆段9和分离件向上移动。通过将第二杆段10与第一杆段9可拆卸连接，可使得在分离后将第二杆段10和分离件进行拆卸，更换新的第二杆段10和分离件，从而可有效的防止视网膜色素上皮细胞被污染。

进一步的，第一杆段9的一端具有连接部11，连接部11内具有连接孔，第二杆段10的另一端与连接孔插接。

进一步的，如图1至图4所示，分离下盖4上设置有卡扣12，分离下盖4通过卡扣12与分离上盖3卡接。

进一步的，连接杆的另一端上设置有按压部13，按压部13可方便工作人员按压第二杆段10。

实施例2

本实施例提供了一种视网膜色素上皮细胞分离方法，包括以下步骤：

S1：摘除小鼠的眼球，放置在D-Hank’s液中进行解剖，取出含有视网膜色素上皮细胞的眼罩。

具体的，(1)选择18～21天内的小鼠，在本实施例中，选取的小鼠品种为C57，为小鼠在麻醉后采用断头处死，使用弯头镊摘除小鼠的眼球，可尽量保留视神经用于抓取眼球进行解剖。

(2)将所获小鼠的眼球放入D-Hank’s液中，去除眼球外的结缔组织和肌肉，避免结缔组织细胞、肌肉细胞等其他组织细胞污染视网膜色素上皮细胞。

(3)为避免残留的组织污染细胞，需要将眼球移入0.01％EDTA+0.125％中性蛋白酶，37℃消化10～30min，使眼球变得柔软，弹性降低。本实施例中的中性蛋白酶，其具有温和的蛋白酶水解活性，不会损坏细胞膜的完整性和视网膜色素上皮细胞的活性，又能使眼球变得柔软，弹性降低，更有利于解剖。

(4)随后将眼球转移至新的D-Hank’s液中进行眼球解剖，依次分离角膜、晶状体、玻璃体和视网膜，获得含有视网膜色素上皮细胞的眼罩。

S2：将眼罩依次移入第一酶解液和第二酶解液中，在第一酶解液中去除视网膜色素上皮细胞表面残留的玻璃体和视网膜，在第二酶解液中使视网膜色素上皮细胞与Bruch膜之间的连接变得松散。

具体的，(1)眼罩用新的D-Hank’s液漂洗2～3次，并使用移液枪吸干残留的D-Hank’s液，将眼罩移入第一酶解液中，37℃培养10～30min，从而去除RPE表面残留的玻璃体和视网膜。在本实施例中，第一酶解液为：0.01％EDTA+0.125％透明质酸酶+0.125木瓜蛋白酶(400U活力)，木瓜蛋白酶十分温和，相较于其他酶而言就有更好的解离视网膜功能，而透明质酸酶可以有效去除残留的玻璃体，选择木瓜蛋白酶和透明质酸酶按该比例组合后的第一酶解液能够温和、高效、快速的保留视网膜色素上皮细胞活力，去除其他无关组织。

(2)随后，将眼罩用新的D-Hank’s液漂洗2～3次，并使用移液枪吸干残留的D-Hank’s液后，将眼罩移入第二酶解液中，37℃培养10～20min，使视网膜色素上皮细胞与Bruch膜之间的连接变得松散。在本实施例中，第二酶解液为：0.01％EDTA+0.125％胶原酶I+0.125％中性蛋白酶，胶原酶I有助于上皮细胞的分离，加上温和的中性蛋白酶，其有助于将视网膜色素上皮细胞解离成单个细胞，本实施例中的第二酶解液能够高效、温和、快速的酶解视网膜色素上皮细胞，并确保其活力损失较少，从而有利于下一步的RPE细胞分离。

S3：加入10％胎牛血清的DMEM-F12培养基终止消化，随后将眼罩放置在实施例1所述的视网膜色素上皮细胞分离装置中分离件的腔体内，通过缓慢多次按压连接杆，使分离件在靠近主体1开口和远离主体1开口的两种状态下进行切换，腔体内的眼罩受到冲击力，眼罩上的视网膜色素上皮细胞从眼罩上进行分离，通过滤网流入空腔内的磷酸缓冲盐溶液2中。

具体的，在第二酶解液中加入10％胎牛血清的DMEM-F12培养基，用于终止第二酶解液对眼罩的消化，随后将眼罩取出并放置在分离件内，并使眼罩与第二弧形滤网6贴合，通过缓慢多次按压第二杆段10，第二杆段10带动第一杆段9和分离件向下移动；减小对第二杆段10的压力，在压簧8弹力的作用下第二杆段10带动第一杆段9和分离件向上移动，多次缓慢的按压第二杆段10，使分离件进行上下的往复运动，使分离件内的眼罩受到冲击力，眼罩上的视网膜色素上皮细胞从眼罩上进行分离，并从第一弧形滤网5和第二弧形滤网6中流入至空腔内的磷酸缓冲盐溶液2中。

S4：将采集完视网膜色素上皮细胞的主体1进行离心，离心后将主体1内的溶液转移至培养基中即可。

具体的，将分离组件从主体1上拆卸，随后将主体1放置在离心机上，并将主体1的开口封闭，对主体1进行离心，离心后剩余在管底的物质即为视网膜色素上皮细胞，随后，将主体1内的磷酸缓冲盐溶液2倒出，并往主体1内加入DMEM-F12+5～10％血清+青链霉素混合液，最后将视网膜色素上皮细胞连同DMEM-F12+5～10％血清+青链霉素混合液转移至培养基中即可，在37℃，5％ CO2，饱和湿度条件下培养5天后开始观察。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。