微流体芯片、系统及其使用方法

技术领域

本发明总体上涉及用于细胞分选的微流体芯片，更具体而言，涉及一种基于介电泳固有特性的微流体芯片。

背景技术

单细胞分选在精密医学应用(如基因组学或下一代测序)中变得越来越重要。最先进的癌症检测系统，如CellSearch，OncoDiscover，或CellMax，从患者样本中捕获和分离循环肿瘤细胞(CTCs)。随后对CTC数量的量化可以提供关于患者状态的重要信息。在单细胞核糖核酸测序平台中，例如在市场上可获得的10×基因组学解决方案或其他最新方案中，确保仅对目标细胞进行测序,这对于获得准确结果至关重要。因此，根据测序平台的机制，可能需要在将样本加入测序平台之前进行可靠的细胞分选。

传统上使用的细胞分选方法包括基于密度梯度的方法以及荧光激活细胞分选(FACS)和磁激活细胞分选(MACS)。在FACS和MACS中，样本必须先制备好，并用荧光染色剂或磁性微珠正确标记，才能成功分选。介电泳激活细胞分选(DACS)提供了一种基于介电泳(DEP)固有特性的替代方法，无需任何预先标记即可分选细胞。DEP是一种电动现象，在空间上不均匀的电场中，可通过极化方式选择性地操纵介电剂，例如哺乳动物细胞。已公开报道的微流体 DACS结构主要集中在通过将电极定位在微流体通道中来分选细胞，其根据细胞的介电特性利用DEP来改变细胞的流动轨迹，从而将它们引导到不同的输出通道中。因为单独分选的细胞类型的数量直接对应于出口的数量,所以这些设计会受到输出通道数量的限制。其他不太常见的基于DEP的细胞分选方法包括采用场流分级来分选不同的细胞类型。

这些技术方案面临的另一个限制是它们不能很容易地提供关于分选细胞数量的信息。额外的细胞计数结构，如微流体库尔特计数器，已被证明能可靠地检测单个细胞，并可用于计数流经出口通道的细胞数量，但代价是增加了整个系统的复杂性。

由真菌、细菌等微生物引起的植物感染性病害是影响农作物生产的主要因素之一，给农民和种植者造成了巨大的经济损失。在众多病害的名单中，菌核病茎腐病(SSR)因其宿主范围广、危害大而显得尤为重要。SSR由坏死营养型真菌病原体菌核病菌引起，影响全球400 多种植物，包括油菜、大豆、向日葵和胡萝卜等几种经济上重要的作物。SSR，也就是俗称的白霉菌，对世界第二大油料作物油菜产业的破坏性特别大。SSR造成的产量损失可能高达 50％，导致严重的财务损失并使其成为油菜生产的最大威胁。真菌产生的微小孢子在风流中传播到整个田地，成为引发SSR流行病的接种物的主要来源。目前，使用杀真菌剂的化学控制是SSR管理的主要策略。尽管这种方法可能非常有效，但在没有病害风险迹象时常规性使用杀真菌剂，在经济上是低效的。理想的情况是，农民必须在特定的时间范围内并且仅在必要时施用杀真菌剂，也就是说，当孢子出现在田间，但在症状出现之前，农民使用杀真菌剂更为有效。然而，由于SSR的爆发很难预测，农民通常在没有获得任何SSR发病风险的客观信息的情况下，常规性地施用杀真菌剂，但这一做法耗费时间，大幅降低利润，并影响环境。目前预测SSR发展的方法是不精确的。风险评估检查表和基于天气的预测模型是为此目的开发的最早预警系统。虽然简单且针对特定领域，但风险评估检查耗时耗力，且不包括任何空气传播接种物的测量。另一方面，基于天气的系统则缺乏领域特异性，完全依赖于天气参数。

发明内容

在第一方面，本发明提供一种用于在含有可极化介质混合物的样本中选择和检测某个可极化介质的微流体芯片，包括:一个衬底；设置在所述衬底上的至少三个电极，相邻电极之间具有一个间隙，从而形成多个间隙；设置在所述衬底上的一个阱阵列，其具有位于多个间隙中的多个阱；设置在所述阱阵列上的一个顶层；以及设置在所述顶层和阱阵列之间的微流体通道。

在第二方面，本发明提供一种从液体样本所含有的可极化介质混合物中选择和检测某种可极化介质的方法，该方法采用一种微流体芯片，其包括:一个衬底；设置在所述衬底上的至少三个电极，相邻电极之间具有一个间隙，从而形成多个间隙；设置在所述衬底上的一个阱阵列，其具有位于多个间隙中的多个阱；设置在所述阱阵列上的一个顶层；以及设置在所述顶层和阱阵列之间的微流体通道，该方法包括使液体样本流过所述微流体芯片，在相邻电极之间施加电压以产生介电泳(DEP)力，从而捕获可极化介质，以及测量相邻电极之间的电阻抗。

在第三方面，本发明提供一种制造微流体系统的方法，包括形成一个微流体芯片，在一个衬底上形成多个电极，在所述衬底上形成一个阱阵列，将所述电极连接到一个控制器。所述控制器包括一个函数发生器和一个阻抗分析器。所述控制器能够与移动电话装置通信，传输检测结果。

术语“可极化介质”指的是粒子或离散体，例如细胞或花粉粒，其能够响应电场而具有感应偶极子。

术语“代谢产物”是指真核细胞、病毒或细菌产生的蛋白质和有机分子。

术语“芯片”或“微流体芯片”是指具有一个衬底和一个或多个流体通道的结构。

附图说明

图1显示了微流体芯片的横向截面图。

图2显示了微流体芯片的俯视图。

图3示出了微流体芯片和流体控制系统。

图4示出了微流体系统，包括微流体芯片、控制器和流体控制系统。

图5示出了微流体系统。

图6是待测试的微流控芯片。

图7是图6的一部分(方框部分)的放大显微图像，示出了阱和叉指形电极(IDEs)，包括10个分区，每个分区包含1000个阱。

图8是图7的一部分(方框部分)的放大显微图像，示出了阱和IDE结构的细节。图8也对应图2，是芯片的俯视图。

图9是一种微流体平台的示意图，示出了每个分区可以单独操作或者与相邻分区结合来捕获特定的细胞类型。

图10是显示在微流体芯片上利用DEP捕获细胞的示意图。

图11A是显示在不同流速和15伏的固定DEP下所获得的分区占用状态的曲线图。

图11B是示出在不同流速和15伏的固定DEP下获得的分区占用状态分布的曲线图。

图11C是显示在不同流速和15伏的固定DEP下获得的所有引入细胞的捕获状态分布的图。

图12A是显示在不同的DEP信号振幅和0.8μL/分钟的固定流速下获得的分区占用状态的曲线图。

图12B是显示在不同的DEP信号振幅和0.8μL/分钟的固定流速下获得的分区占用状态分布的曲线图。

图12C是显示在不同DEP信号振幅和0.8μL/分钟的固定流速下获得的所有细胞的捕获状态分布的图。

图13是恶性乳腺细胞(MDA-MB-231)和良性乳腺细胞(MCF-10A)的CM因子相对于频率的曲线图。

图14是实际拍摄的荧光图像，DEP参数设置成用于单独捕获10A细胞。

图15是实际拍摄的荧光图像，DEP参数设置成用于捕获231细胞和10A细胞。

图16A是显示频率为1兆赫时分选细胞在两个分区中的分布的图，以及试剂沿着微流体通道通过分区A和分区B的流动的示意图。

图16B是示出在两个分区中250兆赫频率下分类细胞的分布的曲线图。

图16C是示出了频率在分区A中为1兆赫、在分区b中为3兆赫的分类细胞的分布的曲线图

图16D是示出了频率在分区A中为250兆赫、在分区b中为1兆赫的分类细胞的分布的曲线图

图17是具有单独电极配置的微流体芯片的示意图。

图18A是孢子占据率相对于所施加流速的函数曲线图，其中阱具有20微米直径，并且在300千赫下采用20伏的正弦DEP信号。

图18B是孢子占据率相对于所施加流速的函数曲线图，其中阱具有15微米直径，并且在300千赫下采用20伏的正弦DEP信号。

图18C是显示孢子占据率相对于阱深的函数曲线图，阱的直径是20微米，并且在300 千赫下施加的DEP信号是20伏。

图18D是显示孢子占据率作为阱深的函数曲线图，阱的直径为15微米，并且在300千赫下施加的DEP信号为20伏。

图19A是通过介电泳力捕获在阱内的核盘菌孢子的氦离子显微镜(HIM)图像。

图19B是直径为15微米的阱中单个孢子的HIM图像。

图20A是函数曲线图，显示在阱阵列的一列中所捕获的单个孢子数量下的阻抗模相对于频率的函数关系。

图20B是示出阻抗相位相对于频率的曲线图。

图20C是在等效电路模型下的奈奎斯特图。

图20D是在5千赫和20千赫下归一化阻抗模的校准曲线。

图20E是当孢子在阱中被捕获时，在5千赫和20千赫的归一化阻抗模的校准曲线。

图20F是50千赫和20千赫下归一化阻抗相位的校准曲线。

图20G是等效电路模型的示意图。

图21A是函数曲线图，显示在阱阵列的一列中所捕获的单个孢子数量下的阻抗模相对于频率的函数关系阱。

图21B是示出阻抗相位相对于频率的曲线图。

图21C是等效电路模型下的奈奎斯特图。

图21D是在5千赫和20千赫下归一化阻抗模的校准曲线。

图21E是当孢子在阱中被捕获时，在5千赫和20千赫下的归一化阻抗模的校准曲线。

图21F是在50千赫和20千赫下归一化阻抗相位的校准曲线。

图22显示出在阱阵列的某个列中捕获孢子的情况。

图23A是悬浮在两种不同溶剂DEPB1和DEPB2中的HEK 293细胞在10千赫至20千赫频率范围内的最小俘获电压(峰-峰)的曲线图。

图23B是HEK 293细胞的克劳修斯-莫索蒂因子的实验光谱图。

图23C是用于HEK 293细胞的单壳模型的图示。

图24A是悬浮在两种不同溶剂DEPB1和DEPB2中的核盘菌孢子在10千赫至20千赫频率范围内的最小捕获电压(峰-峰)的曲线图。

图24B是针对核盘菌孢子的克劳修斯-莫索蒂因子的实验光谱图。

图24C是用于核盘菌孢子的椭圆形双壳模型的图示。

具体实施例

虽然细胞捕获和细胞计数平台的结合已经提供了可靠的结果，但是每个设备都被设计成单独执行其各自的任务。设计一个平台，而不受其中功能各异的硬件的限制，可以提供将更多功能集成到单个芯片中的灵活性。

本发明的微流体芯片和微流体系统提供了微流体平台和无标记定量过程的独特集成。微流体芯片利用阱阵列和介电泳(DEP)来分类和捕获阱中的可极化介质。一旦可极化介质被捕获，就可以进行非法拉第电化学阻抗谱(nF-EIS)测量来量化和识别可极化介质。

微流体芯片(也称为微流体平台)包括具有形成在电极顶部的多个阱的阱阵列。电极促进介电泳驱动的可极化介质的捕获。优选地，阱与电极之间的间隙对齐。电极可以是成对的叉指形电极，每个叉指形电极具有多个叉指。操作电极以在芯片的不同部分捕获具有不同性质的可极化介质。

优选地，微流体芯片具有很多分区，这些分区可以具有不同的阱尺寸，或者可以简单地在不同分区的电极上施加不同电压，从而实现对介电泳驱动的可极化介质的捕获。

通过使用由可单独寻址的电极形成的多分区设计方案，芯片可以捕获大量不同类型的可极化剂。多分区方案允许快速和直接地进行修改，从而对包含不同细胞类型的复杂样本进行细胞分类，因为不同类型细胞在不同分区中被捕获，这样就无须对每种细胞类型设置单独的输出通道。分区的数量、每个分区的大小和阱的大小可以容易地修改，便于平台容易地调整到适用于期望的目标样本。优选地，选择阱的尺寸，使得只有一个可极化介质占据一个阱。

相同的单独可寻址电极可用于测量相邻电极之间的阻抗。通过测量电极之间的阻抗，可以确定被可极化介质占据的阱的数量。然后可以通过将每对电极之间占据的阱的数量相加来确定介质的总数，从而对其进行量化。

可极化介质优选为生物介质，例如细胞、细菌、病毒、孢子、真菌或其他生物介质。可极化介质也可以是花粉、灰尘、分子和蛋白质。粉尘的例子包括煤尘、水泥粉尘、面粉厂粉尘和大气粉尘。微流体芯片可用于对包含各种不同生物介质的样本进行分类，例如将癌细胞与非癌细胞区分开来。生物介质的属性可以通过常规实验来确定。另外一方面，普通生物介质的属性是众所周知的，包括各种细胞类型的介电特性等，这些属性可用于确定生物介质捕获所需要的适当电压。

一旦可极化介质或生物介质在阱中被捕获，可以进行阻抗测量，以逐列量化和/或识别介质。优选地，阻抗测量使用nF-EIS技术，这是一种无标记检测技术，在溶液中没有氧化还原物质的情况下，其测量电极-电解质系统响应于所施加的交流电势的电流。微流体芯片设计成能够单独寻址阱阵列的每一列。每列中的介质数量可以通过nF-EIS来确定。

图1示出了用于分选介质和计数介质的微流体芯片2的横向截面示意图。芯片包括衬底 4，例如玻璃。电极6设置在衬底4上。在电极6上形成图案化绝缘层，从而形成阱阵列8，其中的阱12限定了阱阵列中的凹陷空间。阱12与电极6之间的间隙对齐。微流体通道14 通过用顶层10封闭微流体装置的顶部而形成。

图2示出了微流体芯片的俯视图，其中显示出了多个阱22。阱的布局可以是适合捕获介质的任何构造。图2示出了阱的网格布置，其中阱以行和列布置。优选地，阱的布局可以是六角形或其它形状，只要能够使得介质直接从阱上通过。

图17示出了具有多个电极182的微流体芯片180，这些电极可以单独操作。用于捕获可极化介质的阱184形成在电极182上，采用六角形布局。图中示出了微流体通道186，其具有沿着阱顶部的流动路径。

衬底可以是塑料、玻璃、氧化铝、石英或基底上的二氧化硅层(例如硅晶片上的二氧化硅)或其它合适的绝缘衬底材料。电极可以由金属之类导电材料制成，例如铝、金、铜、碳、钛、银、铂、钯、合金或它们的混合物。可以先将电极材料溅射在衬底上，再利用光刻胶进行图案化，最后对电极材料进行蚀刻，从而形成电极。

优选地，电极是共面的，包括独立形成的多个电极。优选地，每个电极或电极叉指的长度与微流体通道的宽度相同或基本相同。电极叉指宽度与电极间隙的比例例如可以是从1:5 到5:1。电极叉指宽度和电极间隙最好尽可能小，仅受标准光刻和蚀刻技术的限制；可以使用湿法蚀刻，但是诸如离子蚀刻、剥离光刻和电子束光刻的其他技术也是可能的。电极厚度可以是10至1000纳米，优选50至500纳米，最优选60,70,80,90,100,110,120, 130,140,150,160,170,180,190,200,225,250,275,300,325,350,375,400, 425,450或475nm。电极宽度可以是1至1000微米(μm)，优选5至500微米，最优选 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90, 100,150,200,250,300,350,400,或450μm。相邻电极的间隙可以是1至1000微米 (μm)，优选1至100微米，最优选1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5, 6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0,10.5,11.0,11.5,12.0,12.5, 13.0,13.5,14.0,14.5,15.0,20.0,25.0,30.0,35.0,40.0,45.0,50.0,60.0, 70.0,80.0,或90.0μm。作为示例，电极宽度可以为14和20微米，间隙为6微米。1-2 微米的电极宽度和/或间隙也是可能的。电极的宽度和间隙是根据阱的大小来选择的，而阱的大小则由感兴趣的可极化介质的大小来决定。

电极的数量可以是2至1000个，优选2至500个，最优选5,10,15,20,25,30, 35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,100,120,140,160,180,200, 220,240,260,280,300,320,340,360,380,400,420,440,460,或480个。电极的数量最好是偶数。

优选地，阱是圆形或椭圆形的。阱的深度和直径是基于感兴趣的可极化介质的尺寸来选择的。阱的深度可以是1至100微米，优选5至50微米，最优选6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,20,30,35,40,或45μm。阱的宽度或直径优选5至100微米，更优选5至 50微米，最优选6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,20,30,35,40,或45μm。阱也可以用其体积来表述。阱不一定是圆形或椭圆形的，也可以是三角形、矩形或不规则形状。

阱优选由生物相容的材料形成，例如环氧树脂、水凝胶、聚二甲基硅氧烷、聚氨酯和聚乙二醇。这些阱可以使用光刻技术形成，例如光致抗蚀剂技术，例如SU-8 2015(KayakuAdvanced Materials Inc.)。阱也可以由光致抗蚀剂材料本身形成。激光微加工是形成阱的另一种可能的方法。

阱的数量可以是2至1，000，000个，更优选100至10，000个，最优选1000,2000,3000,4000,5000,6000,7000,8000,9000,or 10,000个。阱可以被划分成多个分区，每个分区具有不同尺寸的阱。当需要对大量不同的可极化介质类型进行分类时，分区结构能实现直接的多级分类，而无需为每个额外的介质增加输出通道的数量。由于设计简单，分区的数量和大小以及阱的大小可以很容易地改变，便于将平台调整到适应所需的目标样本。分区的数量可以是1到20个，更优选地是2,3,4,5,6,7,8,9,10,12,14,16,或18 个。图9示出了一种微流体芯片，其中不同的电压被施加到不同的分区，以便捕获不同的介质。在图9中，有10个分区，分区1-5的相邻电极之间具有第一电压，分区6的相邻电极之间具有第二电压，分区7-10的相邻电极之间具有第三电压。

通过封闭阱阵列的上部，可以限定并形成微流体通道。用于封盖阱阵列的顶层可以独立形成，然后再结合到阱阵列上。优选地，一个或多个微流体通道使用阴模和聚二甲基硅氧烷 (PDMS)之类聚合物形成。微流体通道也可以使用不会干扰分选过程的其它合适材料形成。顶层可以采用与阱阵列类似的材料形成，包括玻璃、环氧树脂、水凝胶、聚二甲基硅氧烷、聚氨酯和聚乙二醇等。微流体通道可以通过将顶层结合到芯片(衬底、电极和阱)以限定通道来形成。各部分可以使用硅烷化、粘合剂或其他合适的技术结合在一起。输入腔和输出腔形成在微流体通道的端部，并且可以连接到一个或多个输入管和一个或多个输出管。

图3示出了具有微流体芯片32的流体控制系统30。样本瓶34容纳液体样本。液体样本流入微流体芯片，微流体芯片对液体样本中存在的介质进行分类和定量。马达36和马达头 38提供将液体样本引入微流体芯片的驱动力。马达由控制器40控制。平台42支撑微流体芯片。马达可以是泵，例如注射泵。

可以调节样本通过微流体芯片的流速，以提高微流体芯片的细胞捕获效率。流速也可以基于芯片的表面积或电极施加的DEP力来选择。流速优选为0.01μL/分钟至100μL/分钟，更优选0.1至10μL/分钟，最优选0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1, 1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0和 9.0μL/分钟。优选地，流速和阱的构造和尺寸降低了每个阱捕获多于一个可极化介质的可能性，同时保持高捕获效率。

图4示出了微流体系统40。该系统包括微流体芯片42，其通过电连接46连接到控制器 44。流体样本通过输入管48导向微流体芯片，再经由输入腔50进入微流体芯片。输入管通过输入连接器52连接到微流体芯片。在样本中的介质被分类和识别后，流体从微流体芯片经由输出腔56流到输出管54。输出管通过输出连接器58连接到微流体芯片。输入和输出连接器可以由塑料、金属或其他合适的材料制成。图3所示的流体控制系统60控制流体流速。流体控制系统通过操作泵62，将液体样本移入并通过微流体芯片。流体控制系统也可以电连接到控制器并由控制器控制。

图5示出了微流体系统70。该系统包括微流体芯片72，其通过电连接76连接到芯片支架74。芯片支架具有开关78，用于控制微流体芯片的电极。芯片支架通过电连接 82连接到控制器80。控制器包括函数发生器84，用于在电极之间产生DEP力。控制器包括示波器86，用于测量施加的信号。控制器还包括阻抗分析器88、中央处理器90和存储器91。控制器的各个部分可以通过存储在存储器中的软件或可编程芯片或通用计算机来实现。计算机处理器可以分析阻抗测量数值，以确定在阱中捕获的可极化介质的量。控制器优选地连接到显示监视器92，显示监视器92可以通过导线94或通过无线方式来连接。所述控制器能够与移动电话装置通信，传输分析检测结果。

DEP信号幅度可以基于所选样本和样本中待分选的可极化介质而改变。例如，峰峰值电压(Vpp)可以是1至100伏，更优选5至50伏，最优选6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,20,25,30,35,40,或45伏。还可以改变DEP信号的频率来捕获可极化的介质。频率可以是1至10，000千赫，更优选100千赫至1，000千赫，最优选125,150,175,200, 225,250,275,300,325,350,375,400,425,450,475or 500,550,600,650, 700,750,800,850,900,或950kHz。

控制器可用于控制电极电压。控制器可以被编程为单独操作每个电极，或者分段操作电极。控制器优选地包括存储DEP力的存储器，该力适于捕获特定的可极化介质。控制器还可以通过计算两个电极之间存在可极化介质和没有可极化介质时的阻抗差值，来确定样本中存在的可极化介质的数量，和/或识别可极化介质。当可极化介质被描述为“存在于”电极之间时，应当理解，可极化介质并不一定直接处在电极之间，也可以是位于电极上方。

使得芯片能够在阱中捕获细胞的捕获机制是基于介电泳(DEP)力。当一个可极化的介质 (如细胞)进入一个不均匀的电场时，它将受到一个DEP力(F

括号中的分数项是克劳修斯-莫索蒂因子(CM因子)，决定了介质是对电场梯度最大的区域产生正作用力(pDEP)还是对电场梯度最小的区域产生负作用力(nDEP)。请注意，与电泳不同，F

对于生物样本，如哺乳动物细胞，其介电特性与细胞质电阻或细胞膜电容等生理特性密切相关。由于癌细胞和健康细胞具有显著不同的特性，混合样本中的不同细胞类型将受到 F

对于给定的可极化介质，可以通过测量使用缓冲溶液时的电阻，然后将其与阱中填充了可极化介质情况下的阻抗测量值进行比较，确定与填充了可极化介质的阱相关的阻抗，从而确定可极化介质所导致的阻抗。图20G描绘了一种等效电路模型。Rm模拟溶液电阻，它与溶液电容(Cs)平联。恒相元件(CPE)模拟电极处的双电层，所有这些都与寄生电容Cp并联，寄生电容Cp反映了了由连接电缆、芯片支架和衬底引入的寄生效应。简化的等效电路已经过深入研究，通常用于描述叉指形电极传感器中的电极-电解质界面。通过将实验数据拟合到等效电路，验证了捕获的介质将主要引起Rm、Cs和CPE的变化，从而导致系统的总阻抗变化。捕获的介质数量的变化可以有效地调节系统的阻抗响应，从而可以量化可极化介质。优选地，阻抗在一个频率范围内测量，例如从1千赫到1兆赫。

在可极化介质被分类到阱中之后，微芯片的一个或多个分区的可极化介质可以从阱中释放出来，进行额外的分析。可极化介质可以是癌细胞之类单细胞，可以使用单细胞测序技术进行测序。还可以对细胞进行分析，以测量蛋白质浓度、特定的核糖核酸浓度或其他细胞特性。还可以采用质谱分析法分析可极化介质，分辨出感兴趣的化合物。

实施例1:利用多分区电活性阱平台进行选择性单细胞分选

实施例1描述了一种电活性阱平台，以及证明该平台分选细胞能力的实验。该平台由 10，000纳升的阱组成，这些阱设置在叉指形电极(IDEs)的顶部，便于捕获介电泳驱动的细胞。通过使用由10个可单独寻址的叉指形电极形成的多分区设计，该平台可以捕获大量不同的细胞类型。由于不同的细胞类型在不同的分区中被捕获，分区设计允许进行快速和直接的修改，以对复杂的样本进行分类，因而无需对每种细胞类型设置单独的输出通道。用良性 (MCF-10A)和恶性(MDA-MB-231)乳腺细胞的混合样本获得的实验结果显示，目标与非目标的分类准确率超过95％。

设计方案和工作原理。

微流体平台(图6)被设计和制造成总共具有10个可单独寻址的分区。每个分区包含一个叉指形电极(IDE)结构，其中包括20个厚度为100纳米(下面10纳米的铬加上面90纳米的金)的叉指形共面纳米电极。纳米电极的宽度为14微米，彼此之间有6微米间隙，相邻分区之间也是同样间距的的间隙。在每个IDE分区的顶部，用1000个由SU-8光刻胶制成的阱组成50×20的阱矩阵，这样，一个芯片的总阱数为10000个(图7)。这些阱以类似于六角形的方式设置，以使得水平流过芯片的细胞总是通过最少数量的阱。如图8所示，这种特定的设置方式使得细胞捕获无关乎目标细胞的初始y位置。微流体通道将流体和细胞流均匀地分布在整个芯片上，并连接输入和输出的端口。

阱的尺寸基于样本中所包含的细胞的大小来确定。据公开报道，本实施例中的靶细胞系MDA-MB-231和MCF-10A的直径通常在11至19μm之间。培养的细胞显示MDA-MB-231细胞的平均直径为14微米，MCF-10A细胞的平均直径为17微米。基于这些结果，制造了阱直径和深度为20微米的芯片。虽然可以采用更大的阱尺寸，或者采用细胞直径与阱直径之间的更大比率，并且仍然能实现可靠的细胞捕获，但是，只有基于目标细胞的尺寸来设计阱，才能够实现单独的单细胞捕获。

DEP辅助细胞捕获的实验设置。

为了评估微流体平台的细胞捕获性能，利用具有20微米阱直径的芯片设计了两组实验，检查对流速和施加电压的依赖性。所有实验在三个不同的芯片上重复三次。在装载细胞之前，通过以10微升/分钟的流速缓慢注射250微升乙醇来灌注芯片，以去除阱内的气泡。随后，将250微升DEP缓冲液流过该通道以除去过量的乙醇。然后，在不同的流速和DEP捕获电压条件下，将重悬在DEP缓冲液中的5.5μL活性MDA-MB-231细胞的均匀样本引入芯片。细胞经过计数，浓度制备成200细胞/μL，这样，每次注入的细胞样本中总共有1100 个细胞。这个数字比每个分区的阱数高10％，选择这个数字是考虑到样本转移和样本引入芯片过程中可能产生细胞损失。为了提高可见性，细胞在装载前10分钟用荧光染料吖啶橙染色。在整个样本通过芯片后进行洗涤步骤，以75μL/min的流速注射DEP缓冲液3分钟，以除去未被阱捕获的任何细胞。在洗涤步骤中，DEP信号保持开启，以确保捕获的细胞不会离开它们各自的阱。

流速对细胞捕获性能的影响。

在第一组实验中，以0.5μL/min、0.8μL/min和1μL/min的不同流速引入细胞样本，同时施加的正弦捕获信号保持在15伏的峰峰值电压和1MHz的频率。最初的测试运行显示，阱主要处于以下占据状态之一:0细胞状态(其中没有细胞被捕获并且阱是空的)，1细胞状态(其中单个细胞被特定阱捕获)，以及不太可能的2细胞和3细胞状态(以此类推)。如图11A所示，在0.8μL/分钟的流速下观察到最高的阱占有率，1细胞状态的阱有636个，2 细胞状态的阱有130个。此外，在最低测量流速下，2细胞和3细胞状态的阱出现率最高，分别为145个和26个。对于0.8μL/min和更高的流速(小于5％的相对差异)，占据状态在所有捕获细胞上的分布是相似的(图11B)。在较低的流速下，发现3细胞状态以显著增加的速率出现(p＝0.0005，单向方差分析)。图11C示出了相对于引入细胞总数的总捕获效率。在0.8μL/min的流速下，未捕获细胞的百分比最小化为18.00％，而处于单细胞捕获状态的细胞的百分比最大化为57.85％。鉴于这是已经观察到的单细胞捕获的最佳条件，因此在所有后续实验中都使用0.8μL/min的流速。

信号幅度对细胞捕获性能的影响。

第二组实验检查了细胞捕获和所施加的DEP信号幅度之间的相关性。将细胞样本以0.8 μL/min的恒定流速导入芯片，同时将DEP信号幅度设置为10伏、15伏和20伏。如图12A所示，信号幅度为15伏的实验显示空阱的数量为228个(p＝0.027)，明显低于其他电压，同时具有最高数量的处于1细胞状态的阱，达到636个。虽然图12B中所示的结果表明，以所希望的1细胞状态捕获的细胞百分比随着信号幅度的减小而增加，但是这种趋势被较低电压下被捕获细胞数量的总体减少所抵消(图12C)。由此可见，在更高的电压下更有可能观察到2细胞和3细胞状态。虽然与当前单细胞捕获实验的目标无关，但这种效应可能会引起其他实验的兴趣。在测试的所有信号中，15伏的信号幅度提供了最高百分比的1细胞状态捕获，为57.85％，而未捕获细胞(即0细胞状态)的百分比最低，为18.00％。

DEP辅助细胞分选实验设置。

为了用临床相关的混合样本评估平台的细胞分选性能，设计了几个实验。DEP力的方向取决于CM因子的频率响应，因此在给定的频率下，不同的细胞类型会有所不同。因此，通过对频率进行调节，使得仅有一种细胞类型被吸引到阱中，会促进基于DEP的细胞分选。在第一个实验中，选择DEP信号设置，以便能够捕获在施加信号的分区中所引入的所有细胞(图10)。与此相反，第二个实验旨在通过调整DEP信号频率来区分两种细胞类型，以便在阱中只捕获一种类型的细胞。最后，进行第三个受控实验，将不同的DEP信号应用于两组不同的分区。施加到第一组分区的信号仅促使单个细胞类型的DEP捕获，而施加到另一组分区的信号则促使两种类型细胞均被捕获。

MDA-MB-231和MCF-10A细胞以下称为231细胞和10A细胞，以100细胞/μL的最终浓度制备两种细胞的混合样本。为了能够进行光学检测，用mEmerald绿色荧光蛋白转导的231细胞和用红色荧光细胞接头PKH26染色的10A细胞以1∶1的比例结合。细胞以0.8μL/min 的流速注入芯片，同时施加振幅为15伏的DEP信号。为了确定成功进行DEP分选所需的频率范围，计算并绘制了两种细胞类型的CM因子的实部(图13)。用单壳模型和另有公开报道的介电参数对细胞进行建模。请注意，临床上常见的相关细胞系的介电特性通常得到了很好的研究。如果混合样本中的一种或多种细胞类型具有未知的特性，则可能需要预先进行实验来辨识它们。

对于正数值范围内，10A细胞获得的曲线完全高于231细胞的曲线，这表明在捕获231 细胞的同时，不太可能不捕获10A细胞。根据该图，选择了250千赫的频率来专门用于捕获 10A细胞(图14)。10A细胞显示为浅灰色(较亮的点)。在这个频率下，10A细胞的CM值慢慢接近其最大值，而231细胞的CM值仍然很小，因此不太可能被捕获。此外，选择1兆赫的频率用于控制测量，因为在该值下，两条曲线都接近它们各自的最大值，从而使得两种类型细胞都被捕获(图15)。10A细胞显示为浅灰色，231细胞显示为深灰色(较暗的点)。

选择性单细胞分选的准确性。

前面描述的实验在不同的芯片上用选定的频率进行了三次。在不同的分区占用率和样本注入时间条件下进行测量，以提供与注入时间和占用率无关的性能分析。

图16A和图16B分别示出了在1兆赫和250千赫的频率下捕获的细胞类型的百分比。在 1兆赫的控制频率下，76.72％的捕获细胞是10A细胞。在预测具有最大的10A细胞捕获率的 250千赫频率下，超过95％的捕获细胞是10A细胞。这证明了该平台作为可靠的细胞分选设备的可行性。其他细胞类型的细胞捕获所需的频率可以用适当的多壳模型来计算。

图16C和图16D展示了该平台的多分区性能。使用具有相似CM响应的两个频率，例如1 和3兆赫，实验表明两种细胞类型的捕获百分比在两个分区中相似(相对差异小于1％)，这也是意料之中的。然而，相对于在第一个分区中施加先前所计算的250千赫的10A细胞捕获频率，在第二个分区中应用1兆赫的频率后显示231细胞的捕获量增加超过18％。这是在选择有利于231细胞和10A细胞捕获的频率之前对10A细胞进行预过滤的结果。在多个分区上组合不同的频率能够实现更先进的过滤方案，并且可以用于对很难解析DEP响应的细胞样本进行分类。

器件制造。

细胞分选芯片是在500微米厚4英寸直径的熔融石英基板上，采用标准光刻技术制造的。剥离图案化用于制造金质纳米电极。首先，在热的溶液(H

为了制造微流体通道，在直径为4英寸的原始硅片上制造负母模。母模为20微米厚，使用上述SU-8 2015软光刻步骤制造。随后，将碱和固化剂的质量比为10∶1的 PDMS(Sylgard 184硅氧烷弹性体套件，Dow Inc.)倾倒在模具上，并在100℃的烘箱中固化 30分钟。之后，小心地将聚合的PDMS从基底上移除，并用一次性活检冲头(Robbins InstrumentsInc.)制作微流体通道的入口和出口孔洞。最后，用异丙醇和氨水清洗PDMS 结构。

器件粘合和组装。

硅烷化用于将由PDMS结构形成的微流体通道不可逆地结合到包含阱的切割芯片上。为此，首先在反应离子刻蚀机(Trion Technology，Inc.)中用氧等离子体处理和活化显示微通道的PDMS一侧。随后，将同一侧浸入含有99％(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)的液体溶液中45秒，然后用milli-Q水洗涤并用氮气干燥。随后，PDMS微通道和阱芯片被仔细对准，并慢慢地相互拼接起来。为了确保整个装置的密封，随后将其放置在热板上，同时在顶部用0.2千克的标准校准砝码施加压力，并在150℃下烘烤1小时。最后，将21G不锈钢针插入先前在PDMS形成的入口和出口孔洞中，然后连接聚四氟乙烯(PTFE)管(ElveflowMicrofluidics)，从而形成微流体入口和出口连接器。

细胞培养和制备。

MDA-MB-231-Em细胞维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、10μg/mL嘌呤霉素和0.5mg/mL遗传霉素(Gibco)的RPMI-1640中，存放于37℃和5％CO2气氛的加湿培养箱中。MCF-10A细胞在添加5％马血清、100单位/毫升青霉素和100毫克/毫升链霉素(Gibco)、500纳克/毫升氢化可的松、20纳克/毫升人表皮生长因子(hEGF)、0.01毫克/毫升人胰岛素和100纳克/毫升霍乱毒素的DMEM/F12培养基中培养。使用的所有其他化学品都是分析级的，来自密理博适马公司(Millipore Sigma)。

细胞染色。

在实验准备阶段，用2微克/毫升多西环素诱导MDA-MB-231-Em细胞24小时，然后用0.25％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸从培养皿底部分离。根据制造商的方案，使用0.25％胰蛋白酶- 乙二胺四乙酸分离MCF-10A细胞，并使用用于一般细胞膜标记的PKH26红色荧光细胞连接物试剂盒(Millipore Sigma)染色。简而言之，用1毫升DMEM/F12洗涤细胞一次，然后重悬在1毫升稀释剂中。向细胞悬浮液中加入2×PKH26染料溶液，并在室温下用温和地移液孵育5分钟。将细胞在2mL胎牛血清中孵育1分钟，然后在室温下以400G离心10分钟。染色的细胞在5毫升完全培养基中冲洗3次，以在成像前除去多余的染料。

DEP缓冲液。

通常，细胞培养基和相关缓冲液具有高电导率，阻止哺乳动物细胞的正DEP反应。为了便于捕获和分选，将细胞重悬于电穿阱研究中使用过的无菌过滤、低电导率DEP缓冲液(10 mM HEPES、3mM NaOH、285mM蔗糖和1.5mM氯化镁)中。用电导率仪(奥克顿CON 6+)验证缓冲液的电导率，显示平均读数为500μS/cm。细胞在这种缓冲液中的生存能力已经被其他人验证过了。使用的所有其他化学品都是分析级的，并且是从西格玛-奥尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)获得的。

仪器和实验装置。

为了将微流体芯片电连接到外部测量设备，定制的芯片支架具有弹簧加载的POGO引脚 (pogo-pins)(Mill-Max Mfg.Corp.)，连接到芯片上的焊盘。支架配有一组开关，可以控制信号施加到哪些分区。用连接到入口管道的注射泵将细胞溶液和缓冲液注入微流体通道。为了便于DEP捕获，连接到双通道10×放大器(泰博电子9250)的函数发生器(RigolDG822)通过芯片支架向电极施加正弦信号。使用数字示波器(泰克TDS 2012B)监控施加的信号。为了实现成像和视频记录，芯片支架被放置在与电荷耦合器件照相机(索尼ICX825ALA) 集成的立式荧光显微镜(Amscope FM820TMF143)的观察台上。

实施例2:使用纳米电极激活阱阵列高效捕获和定量分析空气传播的真菌病原体核盘菌

实施例2描述了一种用于捕获和定量分析菌核病菌孢子的多流体装置，菌核病菌孢子是农作物最有害的传染病之一菌核茎腐病的病原体。该装置基于一种微流体设计方案，其中包含纳米级厚度的铝电极结构，该电极结构与皮升阱阵列集成在一起，通过介电泳驱动进行孢子捕获，并采用阻抗传感在芯片中进行定量检测。实施例2显示了大于90％的高效孢子捕集率，其采用有效的阻抗传感方法，可以对阵列中的每一列进行孢子定量，并在5千赫频率下达到2％/孢子的灵敏度，在20千赫频率下达到1.6％/孢子的灵敏度，从而能够进行单孢子检测。

该装置的设计和工作原理。

微流体装置被设计和制造成具有总共20个铝纳米电极(100纳米厚、20微米宽和6微米间隙)，并且在其上制造由SU-8抗蚀剂制成的190个阱的阵列。每个电极可以单独寻址，每对电极之间放置10个阱。为了将孢子流聚集到电极所处的装置中心，微流体通道被设计成具有宽度收窄的缩颈，并且阱阵列中相邻列上的阱在y轴方向上错开，以确保每个孢子的流动路径上总有一个阱。用于实现DEP捕获的非均匀电场是通过向电极施加正弦电压产生的，在将孢子捕获到阱中的过程中，电极可以被配置为叉指形电极结构。

电极配置由定制芯片支架中的开关从外部控制。一旦孢子被捕获，可以进行非法拉第电化学阻抗谱(nF-EIS)测量，以逐列定量孢子；nF-EIS是一种无标记检测技术，可用于在溶液中没有氧化还原物质的情况下测量电极-电解质系统对外加交流电位的响应电流。在nF- EIS测量过程中(图17)，纳米电极可以单独控制，能够实现逐列测量，并提供了确定每一列的孢子占有率的能力。

DEP辅助下的孢子捕获。

为了评价该装置捕获核盘菌孢子的性能，设计了两组实验。在第一组实验中，检查已捕获孢子的分布情况与所施加流速的函数关系。测试了阱直径为20和15微米的装置。在装载孢子之前，乙醇以2μL/min的流速缓慢注入装置，以去除阱内的气泡。之后，将DEP缓冲液以相同的流速引入通道10分钟。随后，以0.2μL/min的固定流速将10μL低浓度(大约4.4×104孢子/mL)的染色核盘菌孢子泵入装置。

当孢子悬浮液流动时，将20伏和300kHz的正弦信号施加到电极上，以实现正DEP捕获。全部孢子(10μL)被泵送完后，执行清洗步骤，将流速增加到15μL/min，持续2分钟，同时保持DEP信号开启，以去除SU-8表面上剩余的孢子。还检查了0.4和0.8μL/min 的流速，并对每个流速进行了三次独立实验。在阱直径为20微米、流速为0.2μL/min(图 18A)的装置中，孢子占据率高达91.23％，超过70％的阱被至少两个孢子占据。不出所料，孢子占据率随着流速的增加而降低，当流速为0.4和0.8μL/min时，孢子的平均占据率分别为83.11％和71.86％。实验还验证了，当流速从0.2μL/min增加到0.8μL/min时，单个孢子占据的百分比从16.49％增加到24.38％。孢子的平均速度随着流速的增加而增加，作用在孢子上的拉力也随之增加，因而在相同的DEP信号振幅下捕获的孢子数量减少了。在具有15 微米阱直径的装置中观察到了相同的趋势(图18B)，并且在洗涤步骤之后几乎不存在三孢子占据情况。

两个装置之间的占据率水平的差异可归结于两个主要原因:由于较小的缩颈而导致的通道横截面积的减小和由于较小的阱而导致的电场的较大衰减。在阱直径为20和15微米的装置中，微流体通道的缩颈分别为420和320微米。根据连续性方程，当微通道的横截面积减小时，在恒定的流速下，孢子的平均速度增加。因此，对于相同的流速，孢子在阱直径为15 微米的装置中流动快约32％。此外，SU-8是绝缘体，随着阱的直径减小，电场衰减更大，从而获得DEP效应。在第二组实验中，在0.2μL/min的恒定流速下，评估了阱深对捕获孢子占据分布的影响。除了先前描述的显示阱深为10微米的芯片，还制造了阱深为5和20微米的器件。DEP信号振幅和频率、孢子浓度和注射量保持与先前实验相同。正如预期的那样，在具有20微米阱直径和5微米阱深度的装置中观察到高孢子占据率(92.35％)(图18C)。另一方面，在具有15微米阱直径和5微米阱深度的装置中，平均占据率为79％，其中，超过45％的阱被两个孢子占据(图18D)。

在具有5微米阱深度的装置的清洗步骤中，观察到一些孢子从阱中逸出，特别是那些已经有两个或更多孢子的阱。这个问题通过在洗涤步骤中将电压提高到22伏得到了解决。值得注意的是，当阱的深度为20μm时，两种阱直径的孢子捕获效率急剧下降。这可归因于电场梯度的变化强度随着离电极表面距离的增加而降低。使用市场上可买到的软件(COMSOL Multiphysics)进行数值模拟来研究这种效应。模拟域和电极产生的电场如图22所示，其中电场强度|E|用图表示。平方电场的梯度

这意味着随着阱深的增加，DEP俘获效率将呈指数下降，这在实验中可以清楚地观察到。还需要着重指出的是，所有设备都测试了仅依靠重力载入孢子的情形。在这种情况下，所有的阱都是空的，这表明DEP力是将孢子捕获到阱中的主导力量。图19A和19B显示了使用DEP在阱内捕获的孢子。基于这些结果，很明显该装置可以使用DEP有效地将孢子捕获到阱中。直径为20微米、深度为5微米的设备提供了更高的捕获效率和应对孢子大小变化的灵活性。相对于20微米阱直径的装置，15微米阱直径和5微米阱深度的装置每个阱的平均孢子数量更少，同时可以通过例如降低流速来提高总体捕获效率，但其代价是捕获时间增加。

菌核病菌孢子的阻抗定量。

捕获孢子后，利用nF-EIS对其进行定量。在此过程中，纳米电极被单独操作，通过将来自阻抗分析器的交流电势施加到位于每个阱下方的相应电极对，对阱阵列中的每一列进行阻抗测量。为了测试定量方法的性能，以0.2μL/min的流速将低浓度孢子(大约2×10

其中Z

最后，还注意到阻抗相位也可以用来量化孢子，尤其是在中频范围内。标准化阻抗相位的校准曲线(N＝3)如图20F所示。在50千赫时，R

器件制造。

使用标准光刻工艺在直径为4英寸的500微米厚玻璃基板上制造微流体装置。首先用溶液(3:1，H

为了获得微流体通道，使用厚度为18μm的SU-8 2015在4英寸直径的原始硅晶片上制造用于聚二甲基硅氧烷(PDMS)模制的母模。将10∶1质量比的PDMS碱和固化剂(SYLGARD184硅氧烷弹性体套件)倾倒在母模上，并在100℃的烘箱中固化1小时。随后，剥离聚合的PDMS，使用一次性活检冲头(罗宾斯仪器公司)在通道上形成入口/出口孔，随后用异丙醇和Milli-Q水清洗。微流体通道由PDMS形成，与实施例1中描述的过程相同。

孢子生产和试剂。

获得核盘菌孢子的过程已在先前的公开报告中描述过。总之，被称为菌核的致密菌丝块被埋在湿沙中，并在10℃下孵育，直到它们果原性萌发形成孢囊。用真空泵在滤纸片上捕获由孢囊释放的孢子。为了在溶液中制备孢子，将滤纸片切成小片(约2mm×10mm)并插入含有 1.5mL电阻率为18.2mω/cm的超纯水的2mL离心管中。随后，使用数字涡流混合器(费希尔科学公司)以1500转/分的转速将该管振荡45s。然后从试管中取出纸片，用20微米网目的细胞过滤器过滤溶液。在DEP实验中，孢子被重悬在DEP加载缓冲液中，该缓冲液由1％ w/v牛血清白蛋白(BSA)组成，溶于Milli-Q水中，以避免孢子的非特异性结合。此外，选择 DEP缓冲液是因为它对孢子无毒性，且电导率低，可减少焦耳热，有利于DEP捕获。使用吖啶橙(Thermo Fisher Scientific)对孢子进行染色，以便于识别和成像。

将禾本科真菌培养物保持在PDA平板上，进而在含有1％蔗糖的合成贫营养肉汤培养基中培养真菌，诱导孢子形成(KH2PO4 1g，KNO3 1g，MgSO4 601HZ 7H2O 0.5g，KCl0.5g，葡萄糖0.2g，蔗糖0.2g)，在摇床(150转/分)上室温中培养7天，获得大分生孢子。通过 20微米细胞过滤器过滤液体培养物并进一步离心分离孢子。使用的所有其他化学品都是分析级的，并且是从适马-奥尔德里奇公司获得的。

孢子固定。

使用4％多聚甲醛和含有0.1％Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水(PBS)固定孢子并进行 HIM成像。首先，孢子被引入设备，并使用DEP捕捉。此后，将1毫升多聚甲醛溶液泵入装置中，静置15分钟。第二，引入1×PBS 10分钟以冲洗阱。最后，通过引入分级浓度的乙醇将捕获的孢子脱水，分级浓度为20％时脱水5分钟、40％时脱水5分钟、60％时脱水5分钟和80％时脱水5分钟。

仪器和实验装置。

基于弹簧引脚的定制芯片支架被用于将微流体装置电连接到所有测量设备。支架上的一组开关允许我们控制施加到每个电极上的信号。微流体通道内溶液中孢子的流动是使用注射泵产生和控制的。在DEP实验期间，使用函数发生器(Rigol DG822)通过双极10倍放大器 (Tabor Electronics 9250)经由芯片支架将正弦信号施加到电极上。示波器(泰克TDS 2012B)也用于监控施加的信号。在DEP拍摄过程中，该设备被放置在一台立式荧光显微镜 (Amscope FM820TMF143)的观察台上，该显微镜集成了一个用于成像和视频记录的电荷耦合器件摄像机(索尼ICX825ALA)。使用由软件LabOne控制的高精度阻抗分析仪(MFIA苏黎士仪器公司)进行nF-EIS测量。

实施例3:通过使用微流体平台测量介电泳捕获电压，对核盘菌空气传播接种物进行介电分析

生物细胞的介电参数是固有属性，通常用作细胞无标记分离和分化的生物标志物。这些介电属性通常用细胞的相对介电常数和电导率来描述，当结合起来时，给出了频率相关的介电谱，称为复介电常数。由于大多数细胞具有复杂的异质结构，多壳理论通常用于将它们建模为由同心壳组成的粒子，通常为球形或椭圆形。假设每个壳的介电特性彼此不同，并且在每个壳内是均匀的。

当电介质特性未知时，调谐介电泳滤波器成为一项麻烦且耗时的任务，因为必须确定每种粒子的DEP响应，以便有效分离不同的物质。这通常通过反复测试用于产生所需非均匀电场的交流信号的电压、振幅和频率的不同组合来实现。此外，由于DEP响应随介质的电导率而变化，因此必须对每种介质重复迭代测试。

为了弥补这些局限性，采用介电泳方法并使用微流体平台实验性地确定了核盘菌孢子在不同电导率的介质中的介电特性。使用真实的椭球双壳模型对孢子进行建模，根据该模型，通过找到能够平衡作用在微通道中流动的孢子上的DEP力和斯托克曳力的最小电压，在很宽的频率范围(10千赫至20兆赫)内，估算出孢子的介电特性。在用孢子进行实验之前，为了验证方法和分析的有效性，测定了人胚胎肾(HEK)293细胞的介电特性。

结果和讨论

工作原理和理论

对菌核病菌孢子介电特性的实验测定基于对最小捕获电压的测量，该电压能够使得作用在微流体通道中流动的孢子上的DEP力和斯托克阻力达到平衡。这些测量是在很宽的频率范围内进行的。作用在可极化粒子(如细胞或孢子)上的DEP力来自非均匀电场和粒子感应偶极子之间的相互作用，这取决于粒子和周围介质的介电特性。DEP力可以是正的，也可以是负的，这取决于粒子是被吸引向最大电场梯度区域还是被排斥。作用在半径为r的粒子上的时间平均的DEP力F

其中，ε

当粒子在pDEP下被捕获时，其受到的X方向的力F

其可以使用泊松方程进一步变化为，

其中，V是施加到IME的正弦电压的幅度。当然，在nDEP下，X方向上的形式与公式4相同。DEP力的这个分量与作用在粒子上反过来阻止粒子在x方向上移动的斯托克阻力相平衡。水平斯托克阻力由下式给出：

F

其中，η是流体粘度，v

通过在不同频率下测量该最小俘获电压V，可以获得CM因子的实部的频谱，由此可以估算介电特性。为了验证该方法，首先用HEK 293细胞进行实验，因为该细胞系的介电特性在文献中是公知的。随后，进行菌核菌孢子的实验。通过使用市售软件(COMSOLMultiPhysical 5.6)的数值模拟获得了壁校正因子、局部流速和电场的空间梯度的值。

HEK-293细胞的介电特性

在装载细胞之前，为了去除微通道中的气泡，使用乙醇对装置进行灌注，乙醇以5微升 /分钟的流速注射10分钟。随后，再将缓冲液DEPB1以0.3μL/min的流速缓慢泵入微通道 10分钟。此后，以大约6.1x10

在从10千赫到20兆赫的宽频率范围内记录最小DEP俘获电压，并对每个频率进行五次测量，以应对细胞尺寸的变化。对于以大约6.2x10

在哪里r

在表2中示出了用缓冲剂DEPB1和DEPB2实验获得的四种介电性质的数值。这些结果与其他研究人员报道的结果非常一致。正如所预期的，无论缓冲液的导电率如何，细胞内部的介电常数(ε

表1。用于计算HEK 293细胞CM因子实部的参数。

注：电场梯度公式中的y值表示从阱的底部起算的高度，相关数值即为该高度位置的电场梯度。

表2。实验获得的HEK 293细胞的介电特性。数值代表三个独立实验的平均值。

核盘菌孢子的介电特性。孢子载入微流体装置的过程与上述细胞实验的方式相同。两种缓冲液DEPB1和DEPB2的捕获电压如图24A所示。两种缓冲液中的孢子浓度测量为约7.2x10

使用如图24C所示的椭圆形双壳模型来分析核盘菌孢子的介电特性，因为该模型更准确地表示了它们的真实形状。假设孢子是椭圆形的，具有两个对应于孢子膜和孢子壁的同心壳。因此，总共有6个介电参数需要确定。半轴a

椭球体的CM因子方程也不同于球体的CM因子方程，

根据同心多壳理论，椭球双壳模型的有效复介电常数为：

其中

其中，s是用于积分的任意距离。利用以上定义的方程式，在细胞实验中采用的相同数值计算过程也可用于孢子。因此，基于图24A所示的测量电压，并且使用公式7，可以计算出每种缓冲液的CM因子实部的频谱(图24B)。

计算中使用的参数如表3所示。为了简化起见，在公式7中使用的半径值r是体积与椭球状孢子的体积相等的球体的半径。对于孢子实验，通道的高度也降低至15μm。利用电场的频率，孢子在水平方向被极化，并且沿沟道的x方向，换句话说，孢子的x

不出所料，CM因子实部的光谱表明，电导率依赖于孢子的DEP响应。当采用DEPB2时，在应用频率范围内没有观察到nDEP响应，尽管最佳拟合曲线的趋势似乎表明交叉频率远低于10千赫。低于10千赫频率下的俘获被发现是不稳定的，因此在计算中没有考虑这个区域。在较高的缓冲液电导率(DEPB1)下，观察到孢子的nDEP响应，根据最佳拟合曲线发现交叉频率为28.4千赫。孢子的DEP反应与已发表的报告非常一致。为了估计介电特性，实验的CM因子应用到公式9中，其中

主要目标是确定孢子的介电特性，以便可以先验地估计其对已知电导率媒介的介电泳响应，而不必进行长时间的迭代实验。这可以大大加速介电泳过滤器的设计，尤其是当要过滤多种物质时。在实验中，选择了低电导率媒介，因为这是DEP过滤器的标准。这主要是因为低电导率媒介提高了细胞、孢子或任何可极化微粒相对于媒介的介电对比度。随着媒介电导率的增加，CM光谱降低，捕获粒子变得更加困难。

表3。用于计算核盘菌孢子CM因子实部的参数。

注：电场梯度公式中的y值表示从阱的底部起算的高度，相关数值即为该高度位置的电场梯度。

表4。实验获得的菌核病菌孢子的介电特性。数值代表三个独立实验的平均值。

通过测量宽频率范围内的最小捕获电压，确定了核盘菌孢子的DEP响应和介电特性。此外，使用基于多壳理论的真实双壳模型对孢子进行建模。该结果可以加速DEP滤波器的设计，用于核盘菌孢子的预报。

器件制造。使用标准光刻工艺在直径为4英寸500μm厚的熔融石英基板上制造微流体装置。首先将基板浸入溶液(3:1，H

细胞和孢子生产。核盘菌孢子的生产方案在以前的报告中已经有详细描述。

DEP缓冲液。将细胞和孢子重悬在具有两种不同电导率的DEP缓冲液中。DEPB1(10mM HEPES、3mM NaOH、285mM蔗糖和1.5mM氯化镁)电导率测得为370μS/cm。DEPB2是通过用去离子水稀释DEPB1(1:8)获得的，测得的电导率为50μS/cm。在每次实验之前，用电导率仪(奥克顿CON 6+)测量缓冲液的电导率。低电导率缓冲液减少焦耳热，有利于DEP捕获孢子和细胞。

透射电镜(TEM)样本制备。首先用2.5％戊二醛和2％多聚甲醛在0.1M磷酸盐缓冲液 (pH7.2–7.4)中化学固定孢子，并放置过夜。随后，用分级浓度的乙醇(50％、70％、90％、100％)对孢子进行脱水，每次脱水间隔为15分钟。此后，用环氧丙烷洗涤孢子20分钟，然后渗透并包埋在纯骨刺树脂中过夜，并在70℃下固化。使用超微粉碎机获得70纳米至90纳米厚度的切片。然后用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色切片。用透射电子显微镜Morgagni 268(飞利浦/FEI)获得图像。

需要说明的是，在本专利申请的权利要求和说明书中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。