一种鉴定缢蛏、近江蛏及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法及应用

技术领域

本发明涉及水产生物技术中的贝类分子标记和杂交种鉴定技术领域，具体而言，涉及一种鉴定定缢蛏、近江蛏及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法及应用。

背景技术

缢蛏(Sinonovacula constricta)是我国传统四大海水养殖贝类之一，在我国从辽宁到广西沿海均有养殖，全国养殖年产量高达86万吨，年产值超300亿元。近江蛏(Sinonovaula rivularis)是2007年在福建闽江口海域发现的新种，隶属于双壳纲(Bivalve)，灯塔蛤科(Pharellidae)，缢蛏属(Sinonovacula)，是一种河口埋栖型贝类，具有生长快、经济价值高、对环境友好等特点，已在福建沿海地区推广养殖，具有良好的养殖前景。因近江蛏外部形态、生态习性与缢蛏极为相似，贝壳上被以黄色壳皮亦具有斜行的凹沟，曾一度被认为是缢蛏。但与缢蛏相比，近江蛏具有生长速度快、耐低盐能力强但不耐高盐，适宜生活在低盐水域(盐度5.2-7.8)，甚至在淡水中仍能存活4天以上。鉴于缢蛏、近江蛏各自的优良性状及良种培育的需求，我们已成功开展了缢蛏和近江蛏的杂交试验，获得了缢蛏×近江蛏杂交子一代，生长对比试验表明杂交种具有生长更快、耐盐能力强的优势。由于缢蛏和近江蛏外部形态特征极为相似、不易区分，尤其幼贝和蛏肉无法辨别，而其杂交种更是难以区分。为了准确鉴别缢蛏、近江蛏及其杂交子代，养殖生产和食品加工行业亟需一种简单高效、快速准确的鉴定方法。

关于缢蛏、近江蛏种间鉴别的方法已有一些相关报道，而有关二者近缘种间杂交的研究国内外尚未见报道。

《台湾海峡》2007年2月第26卷第1期，黄瑞等所著“缢蛏属一新种”，通过外部形态壳长与壳高比、生态习性、精子细胞形态等方面鉴别缢蛏和近江蛏。

《水产学报》2011年1月第35卷第1期，黄瑞等所著“近江蛏精子超微形态结构观察及与缢蛏精子的比较”，通过扫描电镜和透射电镜分别观察了近江蛏和缢蛏成熟精子的超微形态结构，发现近江蛏和缢蛏精子在超微形态结构上差异很大，认为从精子形态差异可鉴别近江蛏和缢蛏；

《水生生物学报》2013年7月第37卷第4期，翁朝红等所著“线粒体COⅠ和16S rRNA片段确定近江蛏和缢蛏属的分类地位”，通过对二者的线粒体基因COⅠ和16S rRNA部分序列进行测序和分析，发现近江蛏和缢蛏之间的序列差异和遗传距离均已达到种间差异水平，可对两个物种进行准确鉴别。

上述方法虽然各有优点，但也都存在明显的不足。如外部形态测量和生态习性判别法，缢蛏和近江蛏有生态重叠区，都会受生境条件影响而发生贝壳形态变化，而且此方法对幼贝、蛏肉及杂交子代均难以辨别和鉴定；成熟精子超微形态结构鉴定法，采样时间受到限制，即需在繁殖季节采集成熟精子才可鉴别，亦无法对雌性和杂交子代进行鉴别，并且鉴定方法依赖价格昂贵的仪器(扫描电镜和透射电镜等)；线粒体基因COⅠ和16S rRNA技术鉴别法，需进行DNA测序和序列分析，价格高、操作较为繁琐、周期长，且无法用于杂交子代鉴定。因此探索操作简便、准确可靠的缢蛏、近江蛏及其杂交子一代鉴定方法意义重大。

发明内容

本发明要解决其中一个技术问题是提供了一种鉴定缢蛏、近江蛏及其杂交子一代的微卫星引物，以填补该领域的技术空缺。

为了解决上述问题，本发明提供了一种鉴定缢蛏、近江蛏及其杂交子一代的微卫星引物，所述的微卫星引物为comp149438_c0或comp147145_c0，分别包括：

(1)comp149438_c0：

F：5’-ATGATGACGACGATGACAAGAGC-3’，如SEQ ID NO:1所示；

R：5’-CTTTAATGCGGCAGGATTAGTGT-3’，如SEQ ID NO:2所示；

(2)comp147145_c0：

F：5’-ATGCTTCATAGAAAAGTCAGT-3’，如SEQ ID NO:3所示；

R：5’-AACATCAACAGCTTGCTAATA-3’，如SEQ ID NO:4所示。

本发明要解决的其中一个技术问题是，提供一种缢蛏、近江蛏及其杂交子一代的鉴定方法，以解决常规方法对幼贝、蛏肉及杂交子代均难以辨别和鉴定、需在繁殖季节采集成熟精子才可鉴别，亦无法对雌性和杂交子代进行鉴别以及鉴别的成本高、步骤复杂的问题。

一种缢蛏、近江蛏及其杂交子一代的鉴定方法，包括以下步骤：

S1：采集缢蛏、近江蛏、缢蛏×近江蛏杂交子一代的斧足样品，在乙醇溶液中保存；

S2:利用酚/氯仿/异戊醇方法提取待测缢蛏、近江蛏、缢蛏×近江蛏杂交子一代斧足的基因组DNA，然后用所述的微卫星引物comp149438_c0或comp147145_c0对所述基因组DNA进行PCR扩增，将得到的扩增产物进行电泳和染色；

S3：comp149438_c0：若在160～170bp区间出现1条带，则该待测样品为缢蛏；若在190～200bp区间出现1条带，则该待测样品为近江蛏；若同时在160～170bp和190～200bp区间各出现1条带，则该样品为缢蛏×近江蛏杂交子一代；

comp147145_c0：若在290～320bp区间出现2条带，则该待测样品为缢蛏；若在240～260bp区间出现1条带，则该待测样品为近江蛏；若同时在290～320bp和240～260bp区间各出现1条带，则该样品为缢蛏×近江蛏杂交子一代。

作为优选的方案，所述步骤S1中，所述乙醇溶液的浓度为95％或100％。

作为优选的方案，所述步骤S2中，所述PCR扩增的扩增体系为：总体积25μL，其中各组分成分及浓度分别为：DNA模板1μL，浓度为50ng/μL；12.5μL 2×Taq Master Mix；上下游引物各1μL，浓度为10μM；并最终用灭菌水补足至25μL。

作为优选的方案，所述步骤S2中，所述的扩增产物进行电泳和染色包括：将所述扩增产物经过8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，220V恒电压电泳3h，然后用Super GelBlue染色5min，置于UV紫外灯下观察、拍照。

作为优选的方案，所述步骤S3中，所述comp149438_c0的PCR扩增程序为：94℃预变性5min，35个循环：94℃变性45s，64.5℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃延伸10min。

作为优选的方案，所述步骤S3中，所述comp147145_c0的PCR扩增程序为：94℃预变性5min，35个循环：94℃变性45s，61.1℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃延伸10min。

本发明要解决的其中一个技术问题是，提供一种鉴定缢蛏、近江蛏及其杂交子一代的试剂盒，所述试剂盒含有所述的微卫星引物comp149438_c0或comp147145_c0。

本发明要解决的另一个技术问题是，提供所述微卫星引物comp149438_c0或comp147145_c0或所述试剂盒在鉴定缢蛏、近江蛏及其杂交子一代的应用。

与现有技术相比，本发明的主要优点是：

1、方法简单、操作便捷，对检测条件要求低，无需昂贵的仪器和DNA测序，一天内即可对缢蛏、近江蛏和杂交子代进行准确鉴别；

2、采样时间不受限制，对样品质量也要求不高，可对任何发育时期的缢蛏、近江蛏和杂交子代进行精准鉴别；

3、结果直观准确、一目了然，不需要复杂的序列比对和计算。

附图说明

图1为实施例1中微卫星引物comp149438_c0(A)和comp147145_c0(B)在缢蛏和近江蛏部分个体中的扩增图谱(图中，M为DNA分子量标准Marker，1-10为缢蛏个体，11-20为近江蛏个体)。

图2为实施例2中微卫星引物comp149438_c0(A)和comp147145_c0(B)在缢蛏、近江蛏、缢蛏×近江蛏杂交子一代部分个体中的扩增图谱(图中，M为DNA分子量标准Marker，1-6为近江蛏♂×缢蛏♀杂交子一代个体，7-12为近江蛏♀×缢蛏♂杂交子一代个体，13-18为近江蛏个体，19-24为缢蛏个体)。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明利用该方法对缢蛏、近江蛏及缢蛏×近江蛏杂交子一代各60个个体进行了分析，并发现鉴定效果显著。

本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现：

本发明从48对缢蛏微卫星引物中筛选出2对微卫星引物对缢蛏、近江蛏、缢蛏×近江蛏杂交子一代各60个个体的基因组DNA进行PCR扩增，通过扩增图谱可以简单高效地鉴别缢蛏、近江蛏、缢蛏×近江蛏杂交子一代。

本发明适用于缢蛏、近江蛏、缢蛏×近江蛏杂交子一代鉴定的微卫星引物为comp149438_c0和comp147145_c0，其正、反向引物序列如下：

(1)comp149438_c0：

F：5’-ATGATGACGACGATGACAAGAGC-3’，如SEQ ID NO:1所示；

R：5’-CTTTAATGCGGCAGGATTAGTGT-3’，如SEQ ID NO:2所示；

(2)comp147145_c0：

F：5’-ATGCTTCATAGAAAAGTCAGT-3’，如SEQ ID NO:3所示；

R：5’-AACATCAACAGCTTGCTAATA-3’，如SEQ ID NO:4所示。

本发明的第二个目的是提供一种区分缢蛏、近江蛏、缢蛏×近江蛏杂交子一代的鉴定方法，包括如下步骤：

S1：样品采集：将采集到的缢蛏、近江蛏及缢蛏×近江蛏正反杂交子一代活体置于解剖盘中，剪取少量斧足样品，置于95％乙醇中保存，用于后续DNA提取；

S2：DNA提取：利用酚/氯仿/异戊醇方法提取缢蛏、近江蛏及缢蛏×近江蛏正反杂交子一代斧足样品的DNA；用1％琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整性，微量核酸检测仪测定其纯度，检测合格的DNA稀释至50ng/μL，置于-20℃冰箱保存备用。

PCR扩增：

利用上述微卫星引物comp149438_c0(F：5’-ATGATGACGACGATGACAAGAGC-3’；R：5’-CTTTAATGCGGCAGGATTAGTGT-3’)进行PCR扩增。PCR扩增体系为：总体积25μL，其中各组分成分及浓度分别为：DNA模板1μL(50ng/μL)，12.5μL 2×Taq Master Mix(Takara试剂)，上下游引物各1μL(10μM)，灭菌水补至25μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，35个循环：94℃变性45s，64.5℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃延伸10min。

利用上述微卫星引物comp147145_c0(F：5’-ATGCTTCATAGAAAAGTCAGT-3’；R：5’-AACATCAACAGCTTGCTAATA-3’)进行PCR扩增。PCR扩增体系为：总体积25μL，其中各组分成分及浓度分别为：DNA模板1μL(50ng/μL)，12.5μL 2×Taq Master Mix(Takara)，上下游引物各1μL(10μM)，灭菌水补至25μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，35个循环：94℃变性45s，61.1℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃延伸10min。

电泳和染色：将PCR扩增产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，220V恒电压电泳3h，然后用Super GelBlue染色5min，置于紫外灯下观察、拍照。

S3：comp149438_c0：若在160～170bp区间出现1条带，则该待测样品为缢蛏；若在190～200bp区间出现1条带，则该待测样品为近江蛏；若同时在160～170bp和190～200bp区间各出现1条带，则该样品为缢蛏×近江蛏杂交子一代。

comp147145_c0：若在290～320bp区间出现2条带，则该待测样品为缢蛏；若在240～260bp区间出现1条带，则该待测样品为近江蛏；若同时在290～320bp和240～260bp区间各出现1条带，则该样品为缢蛏×近江蛏杂交子一代。

本发明从48对缢蛏微卫星引物中筛选出2对能够在缢蛏、近江蛏中通用的微卫星引物comp149438_c0和comp147145_c0，并且该引物可以通过扩增条带大小区分两种蛏，同时该引物扩增的带型清晰、重复性好、可靠性强，并在两者间的杂交子一代鉴定中具有重要应用价值。

以下提供具体的实施案例对本发明上述的技术方案进行展开的描述：

实施例1

微卫星引物comp149438_c0和comp147145_c0在缢蛏和近江蛏中的扩增分析：

本实施例的实验材料均于2022年9月采集，缢蛏为浙江省宁海县长街镇沿海野生种群(平均壳长52.45±3.70mm)，近江蛏为福建省漳州市沿海野生种群(平均壳长52.19±3.20mm)。实施步骤如下：

S1：样品采集：将采集到的缢蛏、近江蛏活体置于解剖盘中，剪取少量斧足样品，置于95％乙醇中保存，用于后续DNA提取；

S2：DNA提取：利用酚/氯仿/异戊醇方法提取缢蛏和近江蛏斧足样品的DNA；用1％琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整性，微量核酸检测仪测定其纯度；检测合格的DNA原液稀释至50ng/μL，置于-20℃冰箱保存备用。

PCR扩增：

合成微卫星引物comp149438_c0(F：5’-ATGATGACGACGATGACAAGAGC-3’；R：5’-CTTTAATGCGGCAGGATTAGTGT-3’)。基于提取的缢蛏和近江蛏基因组DNA，利用微卫星引物comp149438_c0进行PCR扩增。PCR扩增体系为：总体积25μL，其中各组分成分及浓度分别为：DNA模板1μL(50ng/μL)，12.5μL 2×Taq Master Mix(Takara)，上下游引物各1μL(10μM)，灭菌水补至25μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，35个循环：94℃变性45s，64.5℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃延伸10min。

合成微卫星引物comp147145_c0(F：5’-ATGCTTCATAGAAAAGTCAGT-3’；R：5’-AACATCAACAGCTTGCTAATA-3’)。基于提取的缢蛏和近江蛏基因组DNA，利用微卫星引物comp147145_c0进行PCR扩增。PCR扩增体系为：总体积25μL，其中各组分成分及浓度分别为：DNA模板1μL(50ng/μL)，12.5μL 2×Taq Master Mix(Takara)，上下游引物各1μL(10μM)，灭菌水补至25μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，35个循环：94℃变性45s，61.1℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃延伸10min。

电泳和染色：将PCR扩增产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，220V恒电压电泳3h；电泳结束后，将凝胶从玻璃板上取下放入盛有Super GelBlue染色液的托盘中，染色5min，然后置于紫外灯下观察、拍照，具体结果如图1所示。

S3：comp149438_c0：从图1A中可以看出，在160～170bp区间出现1条带，则该待测样品为缢蛏；若在190～200bp区间出现1条带，则该待测样品为近江蛏。两者之间没有等位基因重叠区，可以明显区分缢蛏和近江蛏。

comp147145_c0：从图1B中可以看出，若在290～320bp区间出现2条带，则该待测样品为缢蛏；若在240～260bp出现1条带，则该待测样品为近江蛏。两者之间没有等位基因重叠区，可以明显区分缢蛏和近江蛏。

实施例2

微卫星引物comp149438_c0和comp147145_c0在缢蛏、近江蛏和缢蛏×近江蛏杂交子一代的扩增分析：

本实施例的缢蛏、近江蛏实验材料于2022年9月采集，缢蛏为浙江省宁海县长街镇沿海野生种群(平均壳长52.45±3.70mm)，近江蛏为福建省漳州市沿海野生种群(平均壳长52.19±3.20mm)。然后以宁海缢蛏和漳州近江蛏为亲本进行杂交试验，成功培育出了缢蛏×近江蛏正、反杂交子一代群体，经7个多月中间培育和池塘养殖获得杂交子代幼贝个体(平均壳长32.05±3.10mm)。

实施步骤如下：

S1：样品采集：将采集到的缢蛏、近江蛏和缢蛏×近江蛏正、反杂交子一代活体置于解剖盘中，剪取少量斧足样品，置于95％乙醇中保存，用于DNA提取；

S2：DNA提取：利用酚/氯仿/异戊醇方法提取缢蛏、近江蛏和缢蛏×近江蛏正、反杂交子一代斧足样品的DNA；用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，微量核酸检测仪测定其纯度；检测合格的DNA原液稀释至50ng/μL，置于-20℃冰箱保存备用。

PCR扩增：

合成微卫星引物comp149438_c0(F：5’-ATGATGACGACGATGACAAGAGC-3’；R：5’-CTTTAATGCGGCAGGATTAGTGT-3’)。基于提取的缢蛏、近江蛏、缢蛏×近江蛏正、反杂交子一代的基因组DNA，利用微卫星引物comp149438_c0进行PCR扩增。PCR扩增体系为：总体积25μL，其中各组分成分及浓度分别为：DNA模板1μL(50ng/μL)，12.5μL 2×Taq Master Mix(Takara)，上下游引物各1μL(10μM)，灭菌水补至25μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，35个循环：94℃变性45s，64.5℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃延伸10min。

合成微卫星引物comp147145_c0(F：5’-ATGCTTCATAGAAAAGTCAGT-3’；R：5’-AACATCAACAGCTTGCTAATA-3’)。基于提取的缢蛏、近江蛏和缢蛏×近江蛏正、反杂交子一代的基因组DNA，利用微卫星引物comp147145_c0进行PCR扩增。PCR扩增体系为：总体积25μL，其中各组分成分及浓度分别为：DNA模板1μL(50ng/μL)，12.5μL 2×Taq Master Mix(Takara)，上下游引物各1μL(10μM)，灭菌水补至25μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，35个循环：94℃变性45s，61.1℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃延伸10min。

电泳和染色：将PCR扩增产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，220V恒电压电泳3h；电泳结束后，将凝胶从玻璃板上取下放入盛有Super GelBlue染色液的托盘中，染色5min，然后置于紫外灯下观察、拍照，具体结果如图2所示。

S3：comp149438_c0：从图2A中可以看出，缢蛏在160～170bp区间出现1条带，近江蛏在190～200bp区间处出现1条带，两者之间没有等位基因重叠区，可以明显区分缢蛏和近江蛏。而缢蛏×近江蛏正、反杂交子一代同时在160～170bp和190～200bp区间各出现1条带。由此可见，微卫星引物comp149438_c0能够直观、快速、准确地鉴别出缢蛏、近江蛏和缢蛏×近江蛏正、反杂交子一代。

comp147145_c0：从图2B中可以看出，缢蛏在290～320bp区间出现2条带，近江蛏在240～260bp区间处出现1条带，两者之间没有等位基因重叠区，可以明显区分缢蛏和近江蛏。而缢蛏×近江蛏正、反杂交子一代同时在290～320bp和240～260bp区间各出现1条带。由此可见，微卫星引物comp147145_c0能够直观、快速、准确地鉴别出缢蛏、近江蛏和缢蛏×近江蛏正、反杂交子一代。

虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。