一种多肽hLFT-68及其应用和药物、相关外用敷料或护肤品

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种来源于人乳的抗菌肽hLFT-68促创面愈合活性及其应用。

背景技术

抗菌肽在自然界中分布广泛，作为一种备受关注的新型抗生素，其在微生物、动植物体内的发现日益增多，展现出广阔的治疗应用前景。相较于传统抗生素，抗菌肽具有不易使微生物产生耐药性的特性，这是其明显优势。母乳作为婴儿最佳的天然食物，不仅富含蛋白质和多肽，而且兼具抗菌肽的优势和人乳优质安全的蛋白来源两个关键特性。来源于人乳中稳定存在的内源性抗菌肽，其存在本身就解决了抗菌肽进入人体后易被进一步水解的问题，显示出作为抗菌药物的良好潜力。除此之外，相较于其他抗菌肽，人乳源性的抗菌肽具有低免疫原性的特点，这可以更好地减少抗菌肽的副作用和对人体的免疫反应。

创面愈合过程涉及一系列复杂的生理变化，通常可将其分为四个主要阶段：凝血期、炎症期、增殖期和重塑期。仅通过单一的抗菌治疗，仅仅能够确保创面处于无菌的环境，并不能有效增强整个皮肤组织的修复进程。因此，开发同时具备抗菌、抗炎、促增殖和迁移等多种功能的治疗制剂已成为创面愈合研究的重点领域。抗菌肽，作为一类具有天然抗菌活性的生物活性物质，近年来还被发现具有抗炎功能，能够抑制创面愈合的炎症期。此外，抗菌肽还有促进细胞增殖和迁移的能力，可以增强创面愈合的增殖期，进而缩短创面愈合时间。因此，由于抗菌肽具有广谱抗菌性以及抗炎、促增殖和迁移等多重生物活性，使其成为最具潜力的一种新型伤口治疗制剂，并已引起了广泛的关注和研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种人乳源性抗菌肽hLFT-68，在促进皮肤细胞增殖、创面愈合、组织修复和/或抗炎的药物和/或护肤品中的应用。

为实现上述目的，本发明以所述多肽hLFT-68为促创面愈合、抗炎、皮肤修复的有效成份。

其具有序列表SEQ ID NO：1中氨基酸序列；简写：IAENRADAV，其氨基酸序列为Ile-Ala-Glu-Asn-Arg-Ala-Asp-Ala-Val，多肽hLFT-68为促进皮肤细胞增殖、创面愈合、组织修复和/或抗炎的活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。

抗菌肽hLFT-68具有促进皮肤伤口愈合、组织修复、降低伤口炎症的功能。所有实验结果充分证明了抗菌肽hLFT-68在促进皮肤创面愈合方面的生物活性。这种肽类化合物可以作为预防感染、促进伤口愈合和减轻炎症反应的药物和/或护肤品，并有望应用于新型治疗性凝胶或软膏和医用面膜中。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

首次验证了上述多肽具有较好的促人成纤维细胞增殖活性、抗炎活性和促创面愈合活性，因此作为促进皮肤细胞增殖、创面愈合、组织修复和/或抗炎的药物和/或护肤品或者传统治疗伤口的凝胶或软膏的添加剂具有良好的应用前景。

附图说明

图1抗菌肽hLFT-68促人成纤维细胞增殖活性，其中*P＜0.05 vs 100％。

图2抗菌肽hLFT-68对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(Raw264.7细胞)分泌TNF-α的影响，其中

图3抗菌肽hLFT-68促小鼠创面愈合率，其中

图4抗菌肽hLFT-68作用于小鼠创面的炎症评分，其中

图5为抗菌肽hLFT-68作用于小鼠创面愈合情况的照片。

具体实施方式

实施例1多肽的抗菌活性

委托上海杰肽生物科技有限公司通过固相法合成多肽hLFT-68，纯度为95.46％；简写：IAENRADAV，其氨基酸序列为Ile-Ala-Glu-Asn-Arg-Ala-Asp-Ala-Val。

SEQ ID No.1的信息

(a)序列特征

*长度：9氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

(b)分子类型：蛋白

序列描述：

SEQ ID No.1：Ile-Ala-Glu-Asn-Arg-Ala-Asp-Ala-Val(简称为：hLFT-68)

分别以革兰氏阳性菌大肠杆菌、革兰氏阴性菌金黄色葡萄球菌为靶标菌种，考察多肽hLFT-68的抗菌活性。

(1)菌株及复苏

大肠杆菌(Escherichia coli K12)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)均分别以甘油保藏法保存于-80℃，实验前将两种菌分别接种到液体LB培养基和TSB培养基中，于37℃条件下培养12h使菌种复苏，重复上述复苏操作2-3次，使菌株恢复活力。

(2)MIC测定

分别取对数期大肠杆菌与金黄色葡萄球菌液分别用LB培养基和TSB培养基(空白培养基)进行稀释，配制成1×10

(3)实验结果

抗菌肽hLFT-68对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为12.8mg/ml，结果表明抗菌肽hLFT-68对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑制活性。

实施例2多肽的促细胞增殖活性

(1)细胞培养

使用含体积浓度10％胎牛血清与1％双抗(青霉素的终浓度为100μg/ml，链霉素为50μg/ml)的DMEM基础培养基培养细胞(Procell(Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.)，CM-H103)。人真皮成纤维细胞(Procell，CP-H103)复苏后，将细胞培养瓶放入37℃含体积含量5％CO

(2)CCK8法检测抗菌肽对人成纤维细胞增殖的影响

取培养至第3～4代的对数期生长的人成纤维细胞消化，用与之前相同的新培养基重悬制成细胞悬液，并作为实验细胞。将刚才的细胞悬液用与之前相同的新培养基稀释到1.5×10

增殖活性(％)＝[A(实验组)-A(空白孔)]/[A(对照组)-A(空白孔)]×100

(3)实验结果

2、20、200μg/ml浓度抗菌肽hLFT-68对人成纤维细胞增殖活性的影响如图1所示。结果表明抗菌肽hLFT-68能有效促进人皮肤细胞的增殖。

实施例3多肽的抗炎活性

(1)细胞培养

使用含体积浓度10％胎牛血清的DMEM基础培养基培养细胞。Raw264.7细胞(Procell，CL-0190)复苏后，24h后换液(换与之前相同的新培养基)，待细胞生长到80％左右融合后进行传代，使用细胞刮轻轻将细胞刮离培养瓶，离心重悬后，分三瓶进行传代，传代周期为1～2d，取第3代作为实验细胞。

(2)模型制备

光镜下观察细胞胞质透明，胞膜清晰规整，说明细胞生长良好。以每孔5×10

(3)ELISA法检测抗菌肽对RAW264.7细胞TNF-α的影响

吸取上清，并以4000rpm/20min/4℃离心分离细胞颗粒与其他复合物。后根据小鼠TNF-αELISA试剂盒(Ruixinbio(Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.,LTD)，RX202412M)说明书进行操作，用ELISA法测定细胞上清液TNF-α浓度。

(4)实验结果

100μg/ml浓度抗菌肽hLFT-68对RAW264.7细胞TNF-α分泌的影响如图2所示。结果表明抗菌肽hLFT-68能显著降低RAW264.7细胞的炎症因子TNF-α，说明hLFT-68具有抗炎活性。

实施例4多肽的促创面愈合活性

(1)预饲养与分组

适应性喂养C57BL/6雄性小鼠(年龄6-8周，n＝30)，动物房保持通风、干燥、室温22-25℃，湿度50-70％，保持12小时昼夜节律，空气流通，自由饮水摄食，一周后进入实验。将30只小鼠随机分为3个组，分别为空白组、抗菌肽组、EGF组。每组10只。其中空白组为阴性对照，EGF组为阳性对照(表皮细胞生长因子)。

(2)模型制备与干预

小鼠注射0.12ml质量浓度10％水合氯醛麻醉，俯卧位固定于垫巾上。背部毛用电推子去除，将脱毛膏均匀涂抹于皮肤上。5分钟后用棉签轻柔擦去脱毛膏及残余毛发。用酒精清洗皮肤后，使用直径为8mm的穿刺活检器在每只小鼠背部的皮肤上创建2个全层皮肤缺损创面。之后对应组别每个创面滴加50μl 10

空白组：创面表面滴加50μl PBS缓冲液，每日早晚2次。

抗菌肽组：创面表面滴加50μl 0.5mg/ml抗菌肽hLFT-68(配制溶液为PBS缓冲液)，每日早晚2次。

EGF组：创面表面滴加50μl 5000IU/ml EGF(配制溶液为PBS缓冲液)，每日早晚2次。

(3)观察指标

从手术结束后第0天起，每隔2天用相机记录小鼠背部创面情况。通过追踪伤口边缘和计算像素面积，使用image J计算创面愈合率。每天记录小鼠体重与进行创面炎症评分。

创面愈合率(％)＝100-(现伤口面积/原伤口面积)×100

创面炎症评分标准(由Bates-Jensen伤口评估与效果评价量表改良简化得来，总分12分)

①伤口边缘：1＝模糊，不能区分伤口轮廓；2＝能够清楚区分伤口轮廓；3＝轮廓分明，伤口基底低于伤口边缘。②渗液类型：1＝无渗液；2＝稀薄的淡红色；3＝水样红色或粉色。③渗液量：1＝几乎无渗液，伤口组织干燥；2＝伤口组织微湿，浸湿0～25％的敷料；3＝伤口组织潮湿，浸湿25％以上的敷料。④伤口皮肤颜色：1＝颜色正常或粉色；2＝淡红色；3＝深红色或紫色。

(4)实验结果

小鼠第7天与第11天创面愈合率抗菌肽组与空白组、EGF组对比结果如图3所示，小鼠第5天与第11天创面炎症评分空白组与抗菌肽组对比结果如图4所示，小鼠抗菌肽组第1、3、5、7、9、11天创面愈合情况照片与空白组、EGF组对比如图5所示。结果表明抗菌肽hLFT-68能有效促进小鼠皮肤伤口愈合和组织修复，降低伤口炎症。