用于纯化生物流体的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年10月15日提交的美国临时专利申请第63/256,278号的优先权和权益，所述临时专利申请以引用的方式整体并入本文并用于所有目的。

序列表

随附提交的计算机可读序列表的文本名称为“NCSU-39568-601.xml”，创建于2022年10月14日，文件大小为20,808字节，所述文本据此通过引用的方式整体并入。

技术领域

本公开提供了与从生物流体中纯化生物品相关的材料和方法。具体地说，本公开提供了组合物和相关方法，所述方法包括能够在生物品的生产期间从生物流体中去除工艺相关的杂质(例如，宿主细胞蛋白质、核酸和培养基组分)和产物相关的杂质(例如，产物片段、产物聚集体和源自由细胞培养收获物中其他物质的产物降解或与细胞培养收获物中的其他物质缔合的无活性形式)的肽配体。

背景技术

治疗性单克隆抗体(mAb)的日益增长的临床应用以及在对抗癌症、代谢性病症、神经退行性病症、自身免疫性疾病以及传染性疾病(例如，COVID-19)中引入它们的下一代变体(例如，工程化的抗体片段、抗体药物缀合物(ADC)和多特异性抗体)要求改进的生物制造策略，所述改进的生物制造策略提高生产率和生产量，同时降低这些工艺的成本和环境影响。在此上下文中，诸如工业4.0的倡议正在寻求依靠一次性使用技术的未来mAb制造，所述技术可以将工艺“足迹”和缓冲液使用减至最少，从而实现连续操作和更快的工艺验证。这些特征可以加速产品交付到临床，从而潜在地缩短新产品的“从实验室到临床”的时间，并优化自然资源的使用。

mAb制造工艺中的主要挑战是去除与工艺相关的杂质，具体地说是宿主细胞蛋白质(HCP)，其与mAb产物一起由重组表达系统，主要是最普遍使用的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞分泌。由于HCP的广泛物理化学和生物分子多样性、其与mAb产物缔合(共洗脱)或降解mAb产物的能力以及强大的免疫原性潜力，因此在药物产品配制之前必须小心地去除HCP。在目前的制造工艺中，去除HCP的任务主要由蛋白质A步骤承担，在该步骤中mAb被捕获并浓缩，同时去除CHO细胞培养收获物中存在的大部分HCP。然而，蛋白质组学在生物过程监测中不断增长的应用已证明蛋白质A捕获步骤无法去除若干种HCP，这些HCP由于其免疫原性或在储存期间降解mAb产物的能力而对患者健康构成威胁。此外，这些HCP中的一些可以逃脱通过中间和最终精加工的连续步骤的捕获，并且已有报道导致FDA临床试验和批准流程的延迟，以及mAb批次的召回。完成这些持久性、高风险(HR-)HCP的去除需要对捕获后色谱步骤进行大量优化，并对下游生物制造造成较大的财务影响。

最近，病毒载体(VV)因为它们可以作为针对罕见疾病的基因疗法的递送剂、对抗侵袭型癌症的溶瘤剂、对抗传染性疾病的疫苗平台以及对细胞疗法和用于可持续农业的植物和动物进行工程改造的途径的作用，已经成为现代医学和生物技术中的另一类工具。新的VV设计正不断引入，其具有改善的组织靶向和基因递送，以及低基因毒性、肝毒性和免疫原性。虽然病毒衣壳和转基因设计的不断升级是其作为下一代生物治疗药物取得成功的必要条件，但这对大规模制造来说是一个挑战：(i)VV衣壳的生物分子景观本质上是复杂的-迄今为止，已在人/非人灵长类动物组织中分离出腺相关病毒(AAV)的12种血清型和超过100种变体以及腺病毒(Ad)的>60种血清型；(ii)与相应的天然血清型相比，经由针对提高的治疗功效和安全性的文库筛查而选择的重组衣壳在病毒体蛋白质的组成、比例和排列方面存在显著差异；和(iii)由工程化的细胞进行的VV表达-无论是天然的还是重组的-是具有高度缺陷性的过程，该过程返回多种产物相关的杂质，包括部分衣壳和衣壳片段、衣壳结合的DNA以及转导活性差或无转导活性的Rep相关性衣壳。这些复杂性的影响在目前用于VV纯化的商业亲和吸附剂的景观中得到了很好的体现。在AAV领域中，据报道呈现为泛选择性的配体表现出与一些天然血清型的弱结合，并且无法与几种重组血清型结合，从而导致开发出血清型特异性的配体；此外，这些配体无法区分完整衣壳和破碎的或杂质相关的衣壳；最后，强有力的衣壳:配体缔合需要苛刻的洗脱，这可能导致病毒体蛋白质变性和衣壳聚集，从而导致转导活性差，以及通过阻碍结合表面的完全再生而降低树脂寿命。可用于其他VV(诸如慢病毒(LV)和Ad)的亲和纯化的亲和力相当有限，并且连同其高成本而遭受与以上针对靶向AAV的吸附剂列出相同的限制。最后，对于许多VV(诸如疱疹病毒、杆状病毒、狂犬病病毒等)，尽管它们与体内或离体基因和细胞疗法相关，但都没有可用的亲和吸附剂。VV制造的快速发展的情况表明在产物未知(product-agnostic)的方向上重新配置亲和纯化技术。这一点得到了VV表达体系的一致性的证实，这些体系与VV产物的多样性形成鲜明对比，几乎仅由HEK293和Sf9细胞代表，而其他细胞系(诸如Vero和Per.C3)则很少被使用。

这就需要能够实现用于VV纯化的灵活平台的工具，所述工具包括以流通模式操作的步骤，以捕获与工艺和产物相关的杂质(即，宿主细胞蛋白质(HCP)、宿主细胞DNA(hcDNA)、质粒DNA(pDNA)以及衣壳片段、衣壳结合的DNA和Rep相关衣壳等)，同时允许产物VV以未结合的形式流通。这代表了一种用于VV纯化的变革性方法，因为它是(a)灵活的，因为它可以容易地实施以纯化不同的VV，并且对于给定的VV家族，在其不同血清型之间可以互换；(b)稳健的，因为它可以通过最少的优化容易地解决来自上游环节的工艺和产物相关杂质的变化；(c)快速的，因为杂质清除的主要步骤是以流通模式进行的，该模塑本身是快速的，因此使得随后的结合和洗脱模式步骤能够在“更简单”的下游流上操作；(d)通过在纯化管线的起点去除传统上难以去除并对患者安全和产品稳定性构成威胁的杂质，提供更高的产品质量和安全性。

发明内容

本公开的实施方案包括用于从生物流体中纯化靶生物品的组合物。根据这些实施方案，所述组合物包含至少一种长度为至少四个氨基酸的肽配体，并且包含至少一种碱性氨基酸和至少一种亲水性氨基酸。

在一些实施方案中，至少一种肽配体包含在第二氨基酸位置处的疏水性氨基酸或带正电荷的氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体包含在第四氨基酸位置处的疏水性氨基酸或带负电荷的氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体包含与疏水性氨基酸或带负电荷的氨基酸直接相邻的酸性氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体包含与阳离子氨基酸或脂肪族氨基酸直接相邻的极性氨基酸。在一些实施方案中，肽配体中带负电荷的氨基酸：(i)与极性氨基酸不直接相邻；(ii)与脂肪族氨基酸或芳香族氨基酸直接相邻；和/或(iii)与带正电荷的氨基酸直接相邻。在一些实施方案中，肽配体中的芳香族氨基酸：(i)与脂肪族氨基酸直接相邻；(ii)与阴离子氨基酸直接相邻；和/或(iii)与阳离子氨基酸直接相邻。

在一些实施方案中，至少一种肽配体结合至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)、至少一种高风险HCP、至少一种宿主细胞核酸、靶生物品的聚集体和/或源自靶生物品的杂质。

在一些实施方案中，至少一种肽配体对HCP、宿主细胞核酸、靶生物品的聚集体和/或源自靶生物品的杂质表现出从约10

在一些实施方案中，至少一种肽配体包含接头。在一些实施方案中，接头被结合至肽配体的C末端，并且其中所述接头包含Gly

在一些实施方案中，至少一种肽配体被结合至固体支持物。在一些实施方案中，固体支持物包括无孔或多孔颗粒、膜、塑料表面、纤维或织造或非织造纤维垫、水凝胶、微孔板和/或微流体装置。在一些实施方案中，固体支持物包括聚甲基丙烯酸酯、聚烯烃、聚酯、多糖、氧化铁、二氧化硅、二氧化钛和/或氧化锆。

在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度不超过15个氨基酸。

在一些实施方案中，生物流体包含上清液和/或细胞裂解物。

在一些实施方案中，生物流体来源于CHO细胞。在一些实施方案中，CHO细胞选自由以下组成的组：CHO-DXB11细胞、CHO-K1细胞、CHO-DG44细胞和CHO-S细胞或它们的任何衍生物或变体。

在一些实施方案中，生物流体来源于HEK293细胞。在一些实施方案中，HEK细胞选自由以下组成的组：HEK293S细胞、HEK293T细胞、HEK293F细胞、HEK293FT细胞、HEK293FTM细胞、HEK293SG细胞、HEK293SGGD细胞、HEK293H细胞、HEK293E细胞、HEK293MSR细胞和HEK293A细胞或它们的任何衍生物或变体。

在一些实施方案中，生物流体来源于酵母细胞。在一些实施方案中，酵母细胞选自由以下组成的组：巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae)和布拉氏酵母(S.boulardii)或它们的任何衍生物或变体。

在一些实施方案中，生物流体来源于病毒生产细胞系。在一些实施方案中，病毒生产细胞系选自由以下组成的组：MDCK-S、MDCK-A、Vero细胞、LLC-MK2D、PER.C6、EB66和AGE1.CR细胞或它们的任何衍生物或变体。

在一些实施方案中，靶生物品是以下中的一种或多种：蛋白质、肽或多肽；寡核苷酸或多核苷酸；病毒或病毒样颗粒；外来体或细胞外小泡；细胞或细胞器；或小分子。

在一些实施方案中，生物流体具有从约3.0至约9.0的pH值。

在一些实施方案中，生物流体具有从约1至约50mS/cm的电导率。

在一些实施方案中，至少一种肽配体选自由以下组成的组：EHIPA(SEQ ID NO:1)、GPRPK(SEQ ID NO:2)、HAIYPHRH(SEQ ID NO:3)、DLSLRDWGCLW(SEQ ID NO:4)和DISLPRWGCLW(SEQ ID NO:5)或它们的任何衍生物或变体。

在一些实施方案中，至少一种肽配体包含至少两种选自由以下组成的组的肽配体：EHIPA(SEQ ID NO:1)、GPRPK(SEQ ID NO:2)、HAIYPHRH(SEQ ID NO:3)、DLSLRDWGCLW(SEQ ID NO:4)和DISLPRWGCLW(SEQ ID NO:5)或它们的任何衍生物或变体。

在一些实施方案中，至少一种肽配体包含至少三种选自由以下组成的组的肽配体：EHIPA(SEQ ID NO:1)、GPRPK(SEQ ID NO:2)、HAIYPHRH(SEQ ID NO:3)、DLSLRDWGCLW(SEQ ID NO:4)和DISLPRWGCLW(SEQ ID NO:5)或它们的任何衍生物或变体。

在一些实施方案中，至少一种肽配体包含至少四种选自由以下组成的组的肽配体：EHIPA(SEQ ID NO:1)、GPRPK(SEQ ID NO:2)、HAIYPHRH(SEQ ID NO:3)、DLSLRDWGCLW(SEQ ID NO:4)和DISLPRWGCLW(SEQ ID NO:5)或它们的任何衍生物或变体。

在一些实施方案中，所述组合物包含EHIPA(SEQ ID NO:1)、GPRPK(SEQ ID NO:2)、HAIYPHRH(SEQ ID NO:3)、DLSLRD WGCLW(SEQ ID NO:4)和DISLPRWGCLW(SEQ ID NO:5)或它们的任何衍生物或变体。

在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种选自由以下组成的组的肽配体：GSRYRY(SEQ ID NO:6)、RYYYAI(SEQ ID NO:7)、AAHIYY(SEQ ID NO:8)、IYRIGR(SEQ ID NO:9)、HSKIYK(SEQ ID NO:10)、ADRYGH(SEQ ID NO:11)、DRIYYY(SEQ ID NO:12)、DKQRII(SEQID NO:13)、RYYDYG(SEQ ID NO:14)、YRIDRY(SEQ ID NO:15)、HYAI(SEQ ID NO:16)、FRYY(SEQ ID NO:17)、HRRY(SEQ ID NO:18)、RYFF(SEQ ID NO:19)、DKSI(SEQ ID NO:20)、DRNI(SEQ ID NO:21)、HYFD(SEQ ID NO:22)和YRFD(SEQ ID NO:23)或它们的任何衍生物或变体。

本公开的实施方案包括吸附剂，所述吸附剂包含本文所述的任何组合物。

本公开的实施方案还包括从生物流体纯化靶生物品的方法。根据这些实施方案，所述方法包括使包含本文所述的至少一种肽配体和/或吸附剂中任一种的组合物与包含所述靶生物品的生物流体接触，并以流通模式收集所述生物流体，其中所述生物流体包含所述靶生物品。在一些实施方案中，至少一种肽配体结合渗余物中的至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)、至少一种高风险HCP、至少一种宿主细胞核酸、靶生物品的聚集体和/或源自靶生物品的杂质。

在一些实施方案中，所述方法还包括对包含靶生物品的生物流体进行亲和色谱。

在一些实施方案中，生物流体具有从约3.0至约9.0的pH值。在一些实施方案中，生物流体具有从约1至约50mS/cm的电导率。

在一些实施方案中，所述方法在静态结合条件下进行。在一些实施方案中，所述方法在动态结合条件下进行。

附图说明

图1：“流通亲和色谱法”的机理，其中合成配体的系综捕获细胞培养收获物中存在的系列HCP，而不保留靶产物(例如，治疗性抗体或病毒)。

图2A至图2B：静态结合研究-报道为Langmuir等温线结合数据-此数据是在(图2A)非竞争条件下通过将CHO HCP溶液与(■)G.1或(◆)G.2LigaGuard

图3：通过将工业HCCF上样到G.1和G.2LigaGuard

图4：在G.1和G.2LigaGuard

图5：用G.1和G.2LigaGuard

图6：在1min或2min的停留时间(RT)(□:G.1-RT:1min；■:G.2-RT:1min；○:G.1-RT:2min；●:G.2-RT:2min)下通过将含有治疗性mAb的工业CHO HCCF上样到G.1和G.2LigaGuard

图7：由G.1和G.2LigaGuard

图8A至图8B：通过将0.7mg HCP/mL的空CHO-S HCCF与(◇)G.1或(◆)G.2LigaGuard

图9：通过将不同的工业HCCF上样到G.1LigaGuard

图10：本研究中使用的工业HCCF中CHO HCP的气泡图，由基于序列的等电点(pI)和亲水性总平均数(GRAVY)的值呈现；每个点代表通过丰度(点的直径)和基于序列的分子量值(颜色)在源HCCF中鉴定的独特HCP。

图11：通过将含有治疗性mAb的工业CHO HCCF上样到G.1和G.2LigaGuard

图12：基于合并流出物中基于序列的分子量值的CHO HCP分布，合并流出物是通过将工业HCCF上样到G.1或G.2LigaGuard

图13：基于合并流出物中基于序列的等电点(pI)值的CHO HCP分布，合并流出物是通过将工业HCCF上样到G.1或G.2LigaGuard

图14：mAb纯化工艺的示意图，其中将来自G.2LigaGuard

图15A至图15B：还原SDS-PAGE凝胶的代表性图像(图15A中为考马斯染色；图15B中为银染色)，显示来自使用本公开的肽配体纯化的CHO细胞的细胞培养流体的各个流通级分(例如，FT1-FT10)中存在mAb4。

图16A至图16B：还原SDS-PAGE凝胶的代表性图像(图16A中为考马斯染色；图16B中为银染色)，显示来自使用本公开的肽配体纯化的CHO细胞的细胞培养流体的各个流通级分(例如，FT1-FT10)中存在mAb3。

图17A至图17B：还原SDS-PAGE凝胶的代表性图像(图17A中为考马斯染色；图17B中为银染色)，显示来自使用本公开的肽配体纯化的CHO细胞的细胞培养流体的各个流通级分(例如，FT1-FT10)中存在mAb2。

图18A至图18B：还原SDS-PAGE凝胶的代表性图像(图18A中为考马斯染色；图18B中为银染色)，显示来自使用本公开的肽配体纯化的CHO细胞的细胞培养流体的各个流通级分(例如，FT1-FT10)中存在GmAb3。

图19A至图19B：还原SDS-PAGE凝胶的代表性图像(图19A中为考马斯染色；图19B中为银染色)，显示来自使用本公开的肽配体纯化的CHO细胞的细胞培养流体的各个流通级分(例如，FT1-FT10)中存在GmAb2。

图20A至图20C：通过使用LigaTrap

图21A至图21D：色谱级分的SDS-PAGE分析(还原条件，考马斯染色)，该色谱级分是通过使用LigaTrap

图22A至图22C：通过使用LigaTrap

图23A至图23B：色谱级分的SDS-PAGE分析(还原条件，考马斯染色)，该色谱级分是通过使用LigaTrap

图24A至图24E：通过将在不同结合缓冲液中的3mg/mL的pIgG溶液进样到第一代LigaGuard

图25A至图25C：通过将在不同结合缓冲液中的经稀释的6mg/mL Ig耗竭性血浆进样到LigaGuard

图26A至图26D：通过将使用在pH 6.0下的20mM Bis-Tris HCl缓冲液稀释到总蛋白质滴度为10mg/mL(10倍稀释，D10X)或5.1mg/mL(20倍稀释，D20X)的血浆进样到第一代LigaGuard

图27：色谱级分的SDS-PAGE分析(还原条件，考马斯染色)，该色谱级分是通过使用LigaGuard

图28A至图28G：通过将在pH 6.0下的20mM Bis-Tris HCl缓冲液中的3.0mg/mLpIgG溶液和5.6mg/mL Ig耗竭性血浆分别进样到第二代LigaGuard

图29A至图29D：色谱级分的SDS-PAGE分析(天然条件，考马斯染色)，色谱级分是通过从使用在pH 6.0下的20mM Bis-Tris HCl缓冲液稀释到总蛋白质滴度为(图29A)15mg/mL(5倍稀释，D5X)、(图29B)7.0mg/mL(10倍稀释，D10X)、(图29C)3.9mg/mL(20倍稀释，D20X)的充分冷冻的血浆，或从使用在pH 6.0下的20mM Bis-Tris HCl缓冲液稀释到总蛋白质滴度为6.04mg/mL(10倍稀释，D10X)的(图29D)未充分冷冻的血浆中纯化pIgG获得的。标签：MW，分子量阶梯；hIgG，人多克隆IgG标准品；F，经稀释的血浆原料；和FTi，第i个流通级分。

图30A至图30B：双柱工艺，包括以流通模式操作的第二代LigaGuard

图31A至图31B：双柱工艺，包括以结合和洗脱模式操作的第二代LigaTrap

图32：在不同停留时间(2和5min)和初始浓度(5和10mg/mL)下LigaTrap

图33A至图33B：使用(图33A)LigaTrap人IgG树脂和(图33B)蛋白质G

图34A至图34B：色谱级分的SDS-PAGE分析(还原条件，考马斯染色)，该色谱级分是在不同的IgG上样量(10、15、20、30、40和50mg/mL树脂)下从LigaTrap人IgG树脂(图34A)和蛋白质G

图35A至图35D：(图35A)CHO宿主细胞蛋白质与(图35B)人血浆蛋白质的基于序列的等电点(pI)和亲水性指数的总平均数(GRAVY)的值的比较；(图35C)CHO宿主细胞蛋白质与(图35D)人血浆蛋白质的基于序列的极性(Zimmerman标度)和GRAVY指数的值的比较。

图36A至图36E：通过将在不同结合缓冲液中的3mg/mL的pIgG溶液进样到LigaGuard

图37A至图37E：通过将在不同结合缓冲液中的3mg/mL的pIgG溶液进样到LigaGuard

图38A至图38F：通过将在pH 6.0下的20mM Bis-Tris HCl缓冲液中的3.0mg/mlpIgG溶液进样到第二代LigaGuard

图39A至图39F：通过将在pH 6.0下的20mM Bis-Tris HCl缓冲液中的3.0mg/mlpIgG溶液进样到第二代LigaGuard

图40A至图40C：(A)使用LigaGuard

图41A至图41D：通过将由(A)中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞、(B,C)人胚肾(HEK293T)细胞或(D)HEK293FT细胞产生的澄清的收获的细胞培养流体(HCCF)上样到LigaGuard

图42：以上样到LigaGuard

图43：使用LigaGuard

图44A至图44C：使用LigaGuard

图45：使用LigaGuard

图46A至图46B：使用LigaGuard

图47A至图47B：使用LigaGuard

图48A至图48B：使用LigaGuard

图49A至图49B：使用LigaGuard

具体实施方式

1.定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在冲突的情况下，以本文件(包括定义)为准。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料可用于本公开的实践或测试中，但在下文中描述了优选方法和材料。如本文所用，短语“在一个实施方案中”不一定指相同的实施方案，尽管它可以是指相同的实施方案。此外，如本文所用，短语“在另一个实施方案中”不一定指不同的实施方案，尽管它可以是指不同的实施方案。因此，如下所述，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，可以容易地组合本发明的各种实施方案。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用的方式整体并入。本文公开的材料、方法和实施例仅是说明性的，并且不意图是限制性的。

如本文所用，术语“包含(comprise)”、“包括(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以(can)”、“含有(contain)”以及其变化形式旨在是不排除另外行为或结构的可能性的开放式连接词、术语或词语。除非上下文中另外明确指定，否则单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。本公开还考虑了其他实施方案“包含文中提出的实施方案或元素”、“由文中提出的实施方案或元素组成”和“基本上由文中提出的实施方案或元素组成”，无论是否明确阐述。

对于本文中数值范围的叙述，明确地考虑了其间具有相同精确度的每个中间数值。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外还考虑数字7和8，并且对于6.0-7.0的范围，明确考虑数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

如本文所用，“与之相关”是指与之比较。

如本文所用，除非另外指明，否则“肽”和“多肽”通常是指两个或更多个由肽酰胺键(--C(O)NH--)通过主链接合的氨基酸的多聚体化合物。术语“肽”通常是指短氨基酸多聚体(例如，具有少于25个氨基酸的链)，而术语“多肽”通常是指较长的氨基酸多聚体(例如，具有多于25个氨基酸的链)。

如本文所用，“序列同一性”通常指两个多聚体序列(例如肽、多肽、核酸等)具有相同的单体亚基序列组成的程度。术语“序列相似性”是指两个多聚体序列(例如，肽、多肽、核酸等)具有相似多聚体序列的程度。例如，相似的氨基酸是那些具有相同生物物理特征的氨基酸，并且可以分为多个家族，例如，酸性(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。“序列同一性百分比”(或“序列相似性百分比”)通过以下方式计算：(1)在比较窗口(例如，较长序列的长度、较短序列的长度、特定窗口)内比较两个最佳比对的序列；(2)确定含有同一(或相似)单体的位置的数量(例如，相同的氨基酸出现在两个序列中，相似的氨基酸出现在两个序列中)以产生匹配位置的数量；(3)将匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数(例如，较长序列的长度、较短序列的长度、特定窗口)；和(4)将结果乘以100以产生序列同一性百分比或序列相似性百分比。例如，如果肽A和B的长度均为20个氨基酸，并且除了1个位置外，在所有位置处都具有同一的氨基酸，那么肽A和肽B具有95％序列同一性。如果非同一位置处的氨基酸具有相同的生物物理特征(例如，两者均为酸性)，那么肽A和肽B将具有100％序列相似性。作为另一个实例，如果肽C的长度为20个氨基酸，并且肽D的长度为15个氨基酸，并且肽D中15个氨基酸中的14个与肽C的一部分的氨基酸具有同一性，那么肽C和肽D具有70％序列同一性，但肽D与肽C的最佳比较窗口具有93.3％序列同一性。出于计算本文中“序列同一性百分比”(或“序列相似性百分比”)的目的，比对序列中的任何缺口都作为在该位置处的错配处理。

如本文所用，术语“纯化的”或“纯化”是指从样本中去除成分(例如，污染物)。例如，通过去除污染的非免疫球蛋白蛋白质来纯化抗体；它们也通过去除不与靶分子结合的免疫球蛋白而纯化。去除非免疫球蛋白蛋白质和/或去除不与靶分子结合的免疫球蛋白导致样本中靶反应性免疫球蛋白的百分比增加。在另一个实例中，重组多肽在细菌宿主细胞中表达，并且通过去除宿主细胞蛋白质来纯化多肽；由此增加样本中重组多肽的百分比。

如本文所用，术语“靶”或“靶生物品”通常是指靶蛋白质、肽、多肽、核酸、核糖核蛋白质复合物、核酸构建体、超分子构建体、病毒、病毒构建体、病毒样颗粒、细胞、细胞器、小分子及其任何组合，它们可以存在于包含一种或多种工艺相关的杂质和/或产物相关物质的样本(例如，生物流体)中。在一些实施方案中，靶或靶生物品是抗体或其任何抗原结合片段/衍生物(例如，单克隆或多克隆抗体)。在其他实施方案中，靶或靶生物品是病毒载体(例如，AAV)。

如本文所用，术语“宿主细胞蛋白质”或“HCP”是指由用于产生重组多肽产物的生物体产生或编码并且与预期产物无关的任何蛋白质。HCP在最终原液中通常是所不希望的。

如本文所用，“混合物”包含感兴趣的靶生物品(希望对其进行纯化)和一种或多种污染物或杂质。在一些实施方案中，混合物由表达感兴趣的蛋白质(天然地或重组地)的宿主细胞或生物体产生。此类混合物包括例如，细胞培养物、细胞裂解物和澄清原液(例如，澄清的细胞培养上清液)。

为了回应生物制造过程中从细胞培养流体中高效地和有效地去除杂质(例如，宿主细胞蛋白质)的挑战，本公开的实施方案已经建立了用于连续靶分子纯化(例如，生物品纯化)的新颖且可扩展的技术。根据这些实施方案，“流通亲和色谱法”的概念涉及使用合成肽配体的系综，其捕获细胞培养收获物中存在的HCP系列而不保留靶产物(图1)。这种方法是通过创建带有肽配体系综(LigaGuard

为证明这种改进的方法的有效性，使用具有不同mAb亚类、滴度、HCP组合物和浓度的一组六种CHO细胞培养收获物对第一代(G.1)和第二代(G.2)LigaGuard

如本文进一步所述，靶生物品(例如，治疗性单克隆抗体)的下一代制造将可能涉及连续工艺，其特征在于一次性使用/用后可弃的吸附剂、小“足迹”和最小体积的水性缓冲液。这些特征(i)能够使工艺强化；(ii)加快产品向临床的交付，并潜在地缩短更新型的生物治疗药物“从实验室到临床”的时间；和(iii)减少生物制造对环境的影响。在此上下文中，下游管线将发挥至关重要的作用，即专门用于生物产物纯化的生物工艺的区段。具体地，连续操作的色谱吸附剂-并且理想情况下，以流通模式-非常适合连续且快速的纯化。该范例基于使含有生物产物的液流流经一系列吸附剂，其中杂质被捕获，并且产物以未结合形式流通。

然而，实施该纯化范例存在重大挑战。待捕获的“杂质”在滴度、物理化学/生物分子性质(例如，流体动力学半径、化学成分、等电点、两亲性、二级/三级结构等)以及毒性机制(例如，免疫原性反应的直接触发器、使产物变性或降解为有毒或致免疫原性的副产物等)方面差异很大。因此，设计快速且有效地捕获全部宿主的工艺相关杂质(包括但不限于宿主细胞蛋白质(HCP)和DNA、内毒素、外源因子(病毒性和细菌性污染物))的吸附剂尚未得以实现。

HCP的清除特别地困难，因此在学术界和工业界都进行了大量研究。非常小的(例如，培养基组分)和大的(例如，病毒和细菌及其片段)污染物实际上可以通过依靠尺寸排阻/过滤方法来去除；类似地，通过离子交换色谱法，依靠其强负电荷和均一的物理化学性质，可以轻松地去除DNA和RNA。另一方面，HCP的多样化要高得多，并且对患者的健康而言是危险的。已知对患者的健康构成特殊威胁的特定HCP，据报道已导致多批次的已批准mAb召回或实验性mAb的临床试验失败/中断。

本公开的实施方案已经建立了靶生物品的流通纯化(例如，mAb纯化)。具体地说，本公开的实施方案包括“亲和流通色谱法”，其涉及合成肽配体的系综的鉴定和使用，所述系综能够捕获含单克隆和多克隆的重组细胞培养流体中存在的全部范围的HCP(例如，中国仓鼠细胞(CHO)、人胚肾(HEK)、毕赤酵母(Pichia pastoris)等)，而不保留产物。

先前的工作(即，International journal of molecular sciences 20.7(2019):1729；Biotechnology and bioengineering 117.2(2020):438-452；Separation andPurification Technology 257(2021):117890)集中于肽配体系综的开发和表征。具体地说，本公开分析了通过在不同的停留时间值(即，原料的流速与进样原料所通过的吸附剂体积的比率)下经由连续进样澄清的CHO细胞培养收获物通过LigaGuard

这项先前的工作鉴定并开发了肽配体的这种系综，所述肽配体系综包括肽GSRYRY(SEQ ID NO:6)、RYYYAI(SEQ ID NO:7)、AAHIYY(SEQ ID NO:8)、IYRIGR(SEQ ID NO:9)、HSKIYK(SEQ ID NO:10)、ADRYGH(SEQ ID NO:11)、DRIYYY(SEQ ID NO:12)、DKQRII(SEQ IDNO:13)、RYYDYG(SEQ ID NO:14)、YRIDRY(SEQ ID NO:15)、HYAI(SEQ ID NO:16)、FRYY(SEQID NO:17)、HRRY(SEQ ID NO:18)、RYFF(SEQ ID NO:19)、DKSI(SEQ ID NO:20)、DRNI(SEQID NO:21)、HYFD(SEQ ID NO:22)和YRFD(SEQ ID NO:23)以及它们的任何衍生物或变体。这些实施方案公开于2019年11月26日提交的PCT专利申请公开WO 2020/112906，其通过引用方式以其整体并入本文。此外，在一些实施方案中，这些肽中的九种包含第一代LigaGuard

虽然对于由不同工业合作者使用第一代LigaGuard

2.用于去除工艺和产物相关的杂质的组合物和方法

a.组合物

高级分析在治疗性单克隆抗体(mAb)生物制造中的应用日益增多，凸显了与宿主细胞蛋白质(HCP)杂质的清除相关的挑战。在mAb的生物制造中，特别需要关注的是“持久性”HCP的去处，即与来自蛋白质A捕获步骤的mAb产物共洗脱并可以逃脱后续精加工步骤的物质。持久性HCP包括一些免疫原性和mAb降解蛋白质，这些蛋白质对患者健康构成威胁，并给生物制药行业带来负担。为回应这一挑战，开发了靶向中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养流体中全部范围HCP的肽配体系综，并将它们经由流通亲和色谱法应用于mAb纯化。在本公开中，进一步改善了能够提高mAb产物的回收率和纯度的吸附剂(LigaGuard

根据这些实施方案，本公开提供了用于从一种或多种产物和/或工艺相关的杂质或污染物中纯化靶生物品的组合物和方法。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法有助于靶生物品(例如，抗体、载体构建体等)从一种或多种产物和/或工艺相关的杂质或污染物中的流通纯化和分离。所述组合物包含一种或多种肽配体，每种肽配体可以用与结合一种或多种靶生物品相比更高的亲和力结合一种或多种产物和/或工艺相关的杂质或污染物。在一些实施方案中，一种或多种肽配体结合一种或多种宿主细胞蛋白质(HCP)，从而纯化靶生物品。

一种或多种靶生物品可以是任何合适的生物靶标。例如，靶生物品可以是多肽、蛋白质、寡核苷酸、多核苷酸、病毒或病毒衣壳、病毒衣壳的一部分、细胞或细胞器或小分子。在一些实施方案中，靶生物品是蛋白质，诸如抗体、抗体片段、抗体-药物缀合物、药物-抗体片段缀合物、Fc融合蛋白质、激素、抗凝剂、凝血因子、生长因子、形态发生蛋白质、治疗性酶、工程化的蛋白质支架、干扰素、白细胞介素或细胞因子。

如本领域普通技术人员基于本公开将理解，靶生物品可以是细胞中产生的任何蛋白质、肽或多肽，包括由细胞产生的任何内源性、外源性或重组蛋白质，并且本文所述的方法和组合物可以促进它们从HCP中纯化。

在其他实施方案中，靶生物品可以是病毒、病毒衣壳或在细胞中增殖的病毒载体。在一些实施方案中，此类病毒、病毒衣壳或病毒载体被工程化以将遗传物质递送至细胞用于基因疗法、溶瘤应用或疫苗接种；因此，本公开的各种实施方案可用于纯化靶生物品病毒、病毒衣壳或病毒载体，然后将它们施用于细胞或受试者。例如，如本文进一步所述，靶生物品可以是逆转录病毒(RV)、腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)、慢病毒(LV)、杆状病毒或单纯疱疹病毒(HSV)。如本领域普通技术人员基于本公开将理解，靶生物品可以是细胞中产生的任何病毒载体，并且本文所述的方法和组合物可以促进它们从HCP中纯化。

在一些实施方案中，靶生物品可以是干细胞、祖细胞或免疫效应细胞中的细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞包括但不限于T细胞或自然杀伤(NK)细胞，包括工程化以包含嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞，诸如CAR-T细胞和CAR-NK细胞。在一些实施方案中，靶生物品可以是细胞外小泡或外来体。

一种或多种产物和/或工艺相关的杂质或污染物可以是包含靶生物品的纯化组合物中不希望的任何蛋白质、肽、多肽和/或核酸。例如，产物和/或工艺相关的杂质可以包括在经纯化的组合物中所不希望的靶生物品的任何片段或聚集体。在其他实施方案中，产物和/或工艺相关的杂质可以包括已经历化学或生物化学修饰(例如，靶生物品的氨基酸序列的酶修饰或其翻译后修饰的概况)的完整靶生物品，或已经与杂质缔合的完整靶生物品(例如，已经使其无活性)。

根据这些实施方案，至少一种肽配体结合至少一种HCP、至少一种宿主细胞核酸、靶生物品的聚集体和/或源自靶生物品的杂质。一种或多种HCP可以是人们想要从混合物中去除的任何宿主细胞蛋白质，并且独立地选自表达一种或多种靶生物品的宿主细胞的蛋白质组。宿主细胞蛋白质的实例包括但不限于酸性核糖体蛋白质、双糖链蛋白质聚糖、组织蛋白质酶、簇连蛋白质、热休克蛋白质、巢蛋白质、肽基-脯氨酰基顺式-反式异构酶、蛋白质二硫化物异构酶、SPARC、血小板反应蛋白质-1、波形蛋白质、组蛋白质、内质网伴侣BiP、豆荚蛋白质(legumain)、丝氨酸蛋白质酶HTRA1和推定的磷脂酶B样蛋白质。

根据这些实施方案，所述组合物包含至少一种长度为至少四个氨基酸的肽配体，并且包含至少一种碱性氨基酸和至少一种亲水性氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体包含在第二氨基酸位置处的疏水性氨基酸或带正电荷的氨基酸(例如，X

在一些实施方案中，至少一种肽配体包含与疏水性氨基酸或带负电荷的氨基酸直接相邻的酸性氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体包含与阳离子氨基酸或脂肪族氨基酸直接相邻的极性氨基酸。在一些实施方案中，肽配体中带负电荷的氨基酸：(i)与极性氨基酸不直接相邻；(ii)与脂肪族氨基酸或芳香族氨基酸直接相邻；和/或(iii)与带正电荷的氨基酸直接相邻。在一些实施方案中，肽配体中的芳香族氨基酸：(i)与脂肪族氨基酸直接相邻；(ii)与阴离子氨基酸直接相邻；和/或(iii)与阳离子氨基酸直接相邻。

根据这些实施方案，氨基酸的疏水性可以通过本领域已知的任何方式，例如用亲水性绘图来确定。疏水性绘图是对蛋白质氨基酸的疏水性或亲水性程度的定量分析。它可用于表征或鉴定蛋白质的可能结构或结构域。通常，绘图在其x轴上显示蛋白质的氨基酸序列，并且在其y轴上显示疏水性和亲水性的程度。有许多方法可以测量极性溶剂(诸如水)与特定氨基酸的相互作用的程度。例如，Kyte-Doolittle量表指示疏水性氨基酸，而Hopp-Woods量表测量亲水性残基。对绘图的形状进行的分析提供了关于蛋白质部分结构的信息。氨基酸的Hopp-Woods亲水性量表可用于根据其水溶性对蛋白质中的氨基酸进行分级，以便于搜索蛋白质的表面位置，尤其是那些倾向于与其他大分子(诸如蛋白质、DNA和RNA)形成强相互作用的位置。

在一些实施方案中，被认为是疏水性(具有疏水性侧链)的氨基酸包括甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala,A)、缬氨酸(Val,V)、亮氨酸(Leu,L)、异亮氨酸(Ile,I)、脯氨酸(Pro,P)、苯丙氨酸(Phe,F)、甲硫氨酸(Met,M)和色氨酸(Trp,W)。此外，被认为带正电荷的(阳离子的)氨基酸包括赖氨酸(Lys,K)、精氨酸(Arg,R)和组氨酸(His,H)(碱性侧链)；并且被认为带负电荷的(阴离子的)氨基酸包括天冬氨酸(Asp,D)和谷氨酸(Glu,E)(酸性侧链)。被认为是极性氨基酸的氨基酸包括丝氨酸(Ser,S)、苏氨酸(Thr,T)、半胱氨酸(Cys,C)、天冬酰胺(Asn,N)、谷氨酰胺(Gln,Q)和酪氨酸(Tyr,Y)。被认为是脂肪族氨基酸的氨基酸包括异亮氨酸(Ile,I)、亮氨酸(Leu,L)、脯氨酸(Pro,P)和缬氨酸(Val,V)。并且被认为是芳香族氨基酸的氨基酸包括色氨酸(Trp,W)、酪氨酸(Tyr,Y)和苯丙氨酸(Phe,F)。

基于本公开，本领域普通技术人员将认识到，本文提供的肽配体可以与接头缀合。在一些实施方案中，接头可以促进肽配体在固体支持物上的展示，这允许例如更好地捕获HCP。在其他实施方案中，本文提供的肽配体不与接头缀合，但仍可以与HCP结合，并通过其他方式从细胞培养流体中去除。在一些实施方案中，一种或多种肽配体包含在肽的C末端上的接头。C末端接头包含根据以下结构的接头：Gly

在一些实施方案中，至少一种肽配体对HCP、宿主细胞核酸和/或靶生物聚集体表现出约10

在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度不超过15个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度不超过14个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度不超过13个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度不超过12个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度不超过11个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度不超过10个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度为约4至约15个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度为约5至约15个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度为约6至约15个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度为约7至约15个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度为约8至约15个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度为约9至约15个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度为约10至约15个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度为约4至约14个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度为约4至约13个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度为约4至约12个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度为约4至约11个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度为约4至约10个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度为约5至约15个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度为约5至约10个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度为约5至约15个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度为约10至约15个氨基酸。在一些实施方案中，至少一种肽配体的长度为约7至约14个氨基酸。

在一些实施方案中，细胞培养流体包含上清液和/或细胞裂解物。在一些实施方案中，细胞培养流体来源于CHO细胞。在一些实施方案中，CHO细胞选自由以下组成的组：CHO-DXB11细胞、CHO-K1细胞、CHO-DG44细胞和CHO-S细胞或它们的任何衍生物或变体。在一些实施方案中，细胞培养流体来源于HEK293细胞。在一些实施方案中，HEK细胞选自由以下组成的组：HEK293S细胞、HEK293T细胞、HEK293F细胞、HEK293FT细胞、HEK293FTM细胞、HEK293SG细胞、HEK293SGGD细胞、HEK293H细胞、HEK293E细胞、HEK293MSR细胞和HEK293A细胞或它们的任何衍生物或变体。在一些实施方案中，细胞培养流体来源于酵母细胞。在一些实施方案中，酵母细胞选自由以下组成的组：巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae)和布拉氏酵母(S.boulardii)或它们的任何衍生物或变体。在一些实施方案中，细胞培养流体来源于病毒生产细胞系。在一些实施方案中，病毒生产细胞系选自由以下组成的组：MDCK-S、MDCK-A、Vero细胞、LLC-MK2D、PER.C6、EB66和AGE1.CR细胞或它们的任何衍生物或变体。

在一些实施方案中，细胞培养流体具有约3.0至约9.0的pH值。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约4.0至约9.0的pH值。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约5.0至约9.0的pH值。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约6.0至约9.0的pH值。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约7.0至约9.0的pH值。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约3.0至约8.0的pH值。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约3.0至约7.0的pH值。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约3.0至约6.0的pH值。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约4.0至约8.0的pH值。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约5.0至约7.0的pH值。

在一些实施方案中，细胞培养流体具有约1至约50mS/cm的电导率。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约5至约50mS/cm的电导率。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约10至约50mS/cm的电导率。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约15至约50mS/cm的电导率。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约20至约50mS/cm的电导率。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约30至约50mS/cm的电导率。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约40至约50mS/cm的电导率。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约1至约40mS/cm的电导率。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约1至约30mS/cm的电导率。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约1至约20mS/cm的电导率。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约1至约15mS/cm的电导率。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约10至约40mS/cm的电导率。在一些实施方案中，细胞培养流体具有约20至约30mS/cm的电导率。

根据上述实施方案，至少一种肽配体可以包含至少2种肽配体、至少3种肽配体、至少4种肽配体、至少5种肽配体、至少6种肽配体、至少7种肽配体、至少8种肽配体、至少9种肽配体、至少10种肽配体、至少11种肽配体、至少12种肽配体、至少13种肽配体、至少14种肽配体、至少15种肽配体、至少16种肽配体、至少17种肽配体、至少18种肽配体、至少19种肽配体、至少20种肽配体、至少21种肽配体、至少22种肽配体、至少23种肽配体、至少24种肽配体、至少25种肽配体、至少26种肽配体、至少27种肽配体、至少8种肽配体、至少29种肽配体或至少30种肽配体。在一些实施方案中，一种或多种肽配体包含不同氨基酸序列。

在一些实施方案中，至少一种肽配体选自由以下组成的组：EHI PA(SEQ ID NO:1)、GPRPK(SEQ ID NO:2)、HAIYPHRH(SEQ ID NO:3)、DLSLRDWGCLW(SEQ ID NO:4)和DISLPRWGCL W(SEQ ID NO:5)或它们的任何衍生物或变体。在一些实施方案中，至少一种肽配体包含至少两种选自由以下组成的组的肽配体：EHIPA(SEQ ID NO:1)、GPRPK(SEQ IDNO:2)、HAIYPHRH(SEQ ID NO:3)、DLSLRDWGCLW(SEQ ID NO:4)和DISLPRWGCLW(SEQ ID NO:5)或它们的任何衍生物或变体。在一些实施方案中，至少一种肽配体包含至少三种选自由以下组成的组的肽配体：EHIPA(SEQ ID NO:1)、GPRPK(SEQ ID NO:2)、HAIYPHRH(SEQ IDNO:3)、DLSLRDWGCLW(SEQ ID NO:4)和DISLPRWGCLW(SEQ ID NO:5)或它们的任何衍生物或变体。在一些实施方案中，至少一种肽配体包含至少四种选自由以下组成的组的肽配体：EHIPA(SEQ ID NO:1)、GPRPK(SEQ ID NO:2)、HAIYPHRH(SEQ ID NO:3)、DLSLRDWGCLW(SEQID NO:4)和DISLPRWGCLW(SEQ ID NO:5)或它们的任何衍生物或变体。在一些实施方案中，所述组合物包含EHIPA(SEQ ID NO:1)、GPRPK(SEQ ID NO:2)、HAIYPHRH(SEQ ID NO:3)、DLSLRDWGCLW(SEQ ID NO:4)和DISLPRWGCLW(SEQ ID NO:5)或它们的任何衍生物或变体。

在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种选自由以下组成的组的肽配体：GSRYRY(SEQ ID NO:6)、RYYYAI(SEQ ID NO:7)、AAHIYY(SEQ ID NO:8)、IYRIGR(SEQ ID NO:9)、HSKIYK(SEQ ID NO:10)、ADRYGH(SEQ ID NO:11)、DRIYYY(SEQ ID NO:12)、DKQRII(SEQID NO:13)、RYYDYG(SEQ ID NO:14)、YRIDRY(SEQ ID NO:15)、HYAI(SEQ ID NO:16)、FRYY(SEQ ID NO:17)、HRRY(SEQ ID NO:18)、RYFF(SEQ ID NO:19)、DKSI(SEQ ID NO:20)、DRNI(SEQ ID NO:21)、HYFD(SEQ ID NO:22)和YRFD(SEQ ID NO:23)或它们的任何衍生物或变体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种选自由以下组成的组的肽配体：GSRYRY(SEQ ID NO:6)、RYYYAI(SEQ ID NO:7)、AAHIYY(SEQ ID NO:8)、IYRIGR(SEQ ID NO:9)、HSKIYK(SEQ ID NO:10)、DKSI(SEQ ID NO:20)、DRNI(SEQ ID NO:21)、HYFD(SEQ ID NO:22)和YRFD(SEQ ID NO:23)以及它们的任何衍生物或变体。

根据这些实施方案，本公开的组合物可用于生产任何生物品，包括但不限于生物分子，诸如抗体和抗体片段(例如，单链可变片段(scFv)、单链抗体(scAb)、以及片段抗原结合分子(Fab片段)、双抗体、糖工程化的抗体、双特异性抗体、抗体-药物缀合物及其任何组合、衍生物、变体和融合体。例如，本公开的肽组合物可用于纯化任何目前可获得的治疗性抗体，包括但不限于阿昔单抗(abciximab)(Reopro)、阿达木单抗(Humira，Amjevita)、阿来西普(alefacept)(Amevive)、阿仑单抗(alemtuzumab)(Campath)、巴利昔单抗(Simulect)、贝利尤单抗(Benlysta)、贝兹洛妥珠单抗(bezlotoxumab)(Zinplava)、卡那单抗(canakinumab)(Ilaris)、培塞利珠单抗(Cimzia)、西妥昔单抗(Erbitux)、达克利珠单抗(daclizumab)(Zenapax，Zinbryta)、地诺单抗(Prolia，Xgeva)、依法利珠单抗(efalizumab)(Raptiva)、戈利木单抗(Simponi，Simponi Aria)、英夫利昔单抗(inflectra)(Remicade)、伊匹木单抗(Yervoy)、依奇珠单抗(Taltz)、那他珠单抗(natalizumab)(Tysabri)、纳武利尤单抗(Opdivo)、奥拉单抗(olaratumab)(Lartruvo)、奥马珠单抗(Xolair)、帕利珠单抗(palivizumab)(Synagis)、帕尼单抗(panitumumab)(Vectibix)、帕博利珠单抗(Keytruda)、利妥昔单抗(Rituxan)、托珠单抗(Actemra)、曲妥珠单抗(Herceptin)、司库奇尤单抗(Cosentyx)、乌司奴单抗(Stelara)、英夫利西单抗和贝伐珠单抗。在一些实施方案中，本公开包括包含本文公开的任何肽配体和上文提及的治疗性抗体之一的组合物。

b.吸附剂

本文进一步描述了包含如上所述的组合物的吸附剂，其中所述组合物的每种肽与支持物缀合。支持物可以包括但不限于颗粒、珠、塑料表面、树脂、纤维和/或膜。在一些实施方案中，固体支持物包括无孔或多孔颗粒、膜、塑料表面、纤维或织造或非织造纤维垫、水凝胶、微孔板和/或微流体装置。在一些实施方案中，固体支持物包括聚甲基丙烯酸酯、聚烯烃、聚酯、多糖、氧化铁、二氧化硅、二氧化钛和/或氧化锆。在一些实施方案中，支持物可以包括微粒和/或纳米颗粒。每种支持物可以由任何合适的材料包括但不限于合成或天然的多聚体、金属和金属氧化物制成。一些支持物可以是磁性的，诸如磁珠、微粒和/或纳米颗粒。合适的合成多聚体包括但不限于聚甲基丙烯酸酯、聚醚砜和聚乙二醇。合适的天然多聚体包括但不限于纤维素、琼脂糖和壳聚糖。合适的金属氧化物包括但不限于氧化铁、二氧化硅、二氧化钛和氧化锆。本文进一步描述了包含如上所述与支持物缀合的组合物的吸附剂。

在一些实施方案中，吸附剂包含由单一类型的支持物材料制成的单一类型的支持物，其中组合物中的所有肽与由单一类型的支持物材料形成的支持物缀合。在这些实施方案中，组合物可以包含一种或多种不同类型的肽，每种肽与由单一类型的支持物材料制成的单一类型的支持物缀合。在其他实施方案中，吸附剂包含多种类型的支持物。每种类型的支持物可以由相同类型的支持物材料或不同类型的支持物材料制成。在这些实施方案中，组合物可以包含一种或多种不同类型的肽，每种肽与不同类型的支持物缀合。在又其他实施方案中，组合物的肽可以与可溶性化合物(例如刺激反应性多聚体链)缀合以通过亲和沉淀去除HCP。

c.方法

如本文进一步描述的，如与目前使用的方法相比，本公开还提供了用于从包含一种或多种产物和/或工艺相关的杂质或污染物的生物流体中纯化靶生物品的改进方法。在一些实施方案中，所述方法包括使包含本文所述的任何肽配体的组合物与细胞培养流体接触，并以流通模式收集细胞培养流体，其中所述细胞培养流体包含靶生物品。在一些实施方案中，至少一种肽配体结合渗余物中的宿主细胞蛋白质(HCP)、宿主细胞核酸和/或靶生物品的聚集体。

本文进一步描述了用于从包含一种或多种宿主细胞蛋白质和一种或多种靶生物品的混合物中去除一种或多种宿主细胞蛋白质的方法。所述方法包括使混合物与本文所述的组合物或吸附剂接触。在一个实施方案中，组合物或吸附剂和混合物之间的接触结果导致一种或多种宿主细胞蛋白质与组合物或吸附剂结合。在该实施方案中，如与一种或多种靶生物品相比，一种或多种宿主细胞蛋白质对组合物具有更高的结合亲和力。如与一种或多种靶分子相比，这导致组合物与一种或多种宿主细胞蛋白质的优选结合。

本公开的方法可以进一步包括洗涤组合物或吸附剂以将一种或多种未结合的靶生物品去除到上清液或流动相中；然后收集含有一种或多种未结合的靶生物品的上清液或流动相。在一个实施方案中，洗涤步骤还可以在接触步骤之后并且在收集上清液或流动相之后进行。

在一些实施方案中，所述方法可以在适合用于与组合物或吸附剂一起使用的任何结合条件(包括静态结合条件和动态结合条件)下进行。在一些实施方案中，当所述方法在静态结合条件下进行时，将未结合的靶生物品收集到上清液中。在一些实施方案中，当所述方法在动态结合条件下进行时，将未结合的靶生物品收集到流动相中。本公开的方法可以任选地包括流通色谱法和弱分配色谱法。

如与一种或多种靶分子相比，组合物和/或吸附剂对宿主细胞蛋白质的结合亲和力可以通过以下变化而改变：一种或多种靶蛋白质的性质和浓度；宿主细胞蛋白质的性质和浓度；混合物的组成、浓度和pH值；和/或接触和洗涤步骤的上样条件和停留时间。这些变量中的任何一个都可以改变成根据本公开的方法合适的变量，并导致如本公开所需的结合亲和力的增加或降低。

在一些实施方案中，接触步骤包括高离子强度结合缓冲液或低离子强度结合缓冲液。低离子强度结合缓冲液包含介于1-50mM NaCl之间的缓冲液。在一个实施方案中，低离子强度结合缓冲液包含20mM NaCl。高离子强度结合缓冲液包含介于100-500mM NaCl之间的缓冲液。在一个实施方案中，低离子强度结合缓冲液包含150mM NaCl。

在一些实施方案中，接触步骤可以包括介于pH 5-9之间的低pH缓冲液。在一些实施方案中，接触步骤可以包括介于pH 5-8之间的低pH缓冲液。在一些实施方案中，接触步骤可以包括介于pH 5-7之间的低pH缓冲液。在一些实施方案中，接触步骤可以包括介于pH 6-9之间的低pH缓冲液。在一些实施方案中，接触步骤可以包括介于pH 6-8之间的低pH缓冲液。在一些实施方案中，接触步骤可以包括介于pH 6-7之间的低pH缓冲液。在一些实施方案中，接触步骤可以包括介于pH 7-9之间的低pH缓冲液。在一些实施方案中，接触步骤可以包括介于pH 7-8之间的低pH缓冲液。

如本领域普通技术人员基于本公开将理解，本文所述的方法可以在通常用于纯化和/或分离给定靶分子的任何纯化方法之前或之后使用。例如，本文公开的方法可以在离子交换色谱法(例如，阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法和/或混合模式色谱法)之前或之后、亲和色谱法(例如，蛋白质A亲和色谱法)之前或之后和/或尺寸排阻色谱法或其他过滤处理之前或之后使用。在一些实施方案中，本文公开的方法在细胞培养流体已被澄清之后但在进行色谱法步骤(例如，蛋白质A亲和色谱法)之前使用。

在一些实施方案中，本公开的方法特别适合于在治疗性抗体的制造中使用，所述制造可以极大地受益于采用本公开的肽和吸附剂的组合物，因为其具有将下游工艺从以“结合和洗脱”模式操作的“分批”色谱步骤管线转变为以流通”模式操作的连续且连接的色谱序列管线的潜力。然而，本文所述的方法还适合于其他靶生物品的纯化，诸如基因疗法产品。这些包括例如，用于体内(例如，腺病毒和腺相关病毒)和体外(例如，慢病毒和杆状病毒)基因疗法的病毒。与蛋白质不同，病毒的尺寸大得多(>20nm)，但滴度低得多(10

非治疗性蛋白质的生产构成了当前经济的一大部分。经由基因工程(例如，CRISPR)改良牲畜和作物需要获得经纯化的基因编辑酶(例如，Cas9核酸酶)。通常，这些蛋白质的特征在于显著的生化不稳定性，这使得大规模纯化具有挑战性，并限制了产物的产量和质量，从而大幅提高了这些产物的价格。加速和简化这些产物的纯化工艺是对其未来广泛应用的重要贡献。本公开的组合物和方法可以支持生物技术/农业生物产业的非治疗性蛋白质的生产。

本公开的组合物和方法的另外的应用包括检测生物流体诸如细胞培养收获物、植物/组织提取物、体液(例如，血液、血清、血浆、汗液、尿液、唾液)中的低丰度蛋白质。在此上下文中，用于过程监测和诊断应用的基于质谱法(MS)的分析技术的普及强调了富集和/或分离低丰度蛋白质的需要，所述低丰度蛋白质通常是疾病产物质量的关键标志物。基于MS的分析依赖于样本中分析物物质的电离：大量的分析物因其较高的滴度以变得无法检测的低滴度分析物为代价捕获了大部分电子。本公开的组合物和方法可以通过浓缩HCP并以受控方式释放它们来克服这些限制：(i)所有的HCP最初被捕获在吸附剂上；(ii)使用线性或逐步梯度“洗脱”所述HCP，逐步从吸附剂中释放HCP队列并直接进入分析设备。低丰度蛋白质以高得多的浓度存在于洗脱流中，并且更有可能被检测到。

根据这些实施方案，本公开的组合物和方法可用于生产任何生物品，包括但不限于生物分子，诸如抗体(单克隆和多克隆)和抗体片段(例如，单链可变片段(scFv)、单链抗体(scAb)、片段抗原结合分子(Fa b片段)、双抗体、糖工程化的抗体、双特异性抗体、抗体-药物缀合物及其任何组合、衍生物、变体和融合体。例如，本公开的肽组合物和方法可用于纯化任何目前可获得的治疗性抗体，包括但不限于阿昔单抗(abciximab)(Reopro)、阿达木单抗(Humira，Amjevita)、阿来西普(alefacept)(Amevive)、阿仑单抗(alemtuzumab)(Campath)、巴利昔单抗(Simulect)、贝利尤单抗(Benlysta)、贝兹洛妥珠单抗(bezlotoxumab)(Zin plava)、卡那单抗(canakinumab)(Ilaris)、培塞利珠单抗(Cimzia)、西妥昔单抗(Erbitux)、达克利珠单抗(daclizumab)(Zenapax，Zinbryta)、地诺单抗(Prolia，Xgeva)、依法利珠单抗(efalizumab)(Raptiva)、戈利木单抗(Simponi，SimponiAria)、英夫利昔单抗(inflectra)(Remicade)、伊匹木单抗(Yervoy)、依奇珠单抗(Taltz)、那他珠单抗(natalizumab)(Tysabri)、纳武利尤单抗(Opdivo)、奥拉单抗(olaratumab)(Lartruvo)、奥马珠单抗(Xolair)、帕利珠单抗(palivizumab)(Synagis)、帕尼单抗(panitumumab)(Vectibix)、帕博利珠单抗(Keytruda)、利妥昔单抗(Rituxan)、托珠单抗(Actemra)、曲妥珠单抗(Herceptin)、司库奇尤单抗(Cosenty x)、乌司奴单抗(Stelara)、英夫利西单抗和贝伐珠单抗。在一些实施方案中，本公开包括通过将包含上文提及的抗体之一的细胞培养流体与包含本文公开的任何肽配体的组合物组合而用于纯化上述任何治疗性抗体的方法。

3.实施例

随附的实施例是作为对本公开的部分范围和特定实施方案进行说明而提供，并不意味着限制本公开的范围。

未来的治疗性mAb制造将最有可能依赖于下一代色谱吸附剂，这种吸附剂也有助于连续操作，具有改进的去除HCP的能力，尤其是在当前生物工艺中已经被确定为持久性的高风险物质。在此上下文中，本公开的实施方案包括下游工具箱，包括可负担的基于肽的色谱吸附剂，所述色谱吸附剂以结合和洗脱模式或经由“流通亲和色谱法”纯化治疗性蛋白质。后者(即，LigaGuard

从细胞培养收获物中清除HCP需要用能够捕获一系列蛋白质的配体功能化的色谱基质，所述一系列蛋白质的特征在于浓度、物理化学性质(即，流体动力学半径、化学成分、等电点、两亲性和结构等)和安全性概况(例如，毒性、免疫原性、对蛋白质A的降解活性、mAb产物和药物制剂中使用的赋形剂等)方面存在巨大差异。为实现这一目的，经由双荧光固相文库筛查，通过选择针对包含人多克隆IgG和HCP的模型CHO原料的线性4-聚体和6-聚体肽，开发了9种肽配体的初始系综，被称为第一代(G.1)LigaGuard

本公开的结果包括通过评估工艺相关参数对G.1和G.2LigaGuard

实施例1

LigaGuard

通过将图2中的等温线与Langmuir等温线(在表1中报告)拟合获得的静态结合容量的值提供了对肽配体系综的结合强度和选择性的良好洞察力。图2A中的实心标记分别描绘了G.1(正方形)和G.2(菱形)LigaGuard

在不存在IgG产物的情况下，G.1和G.2LigaGuard

类似地，尽管它们的HCP结合强度(K

在竞争条件下进行的静态结合研究提供了进一步的信息，所述研究使用了按1或5mg/mL的恒定浓度加标NIST mAb的CHO HCP溶液(图2B)。在这些条件下，发现HCP与肽配体结合胜过与肽配体与mAb的结合，最初通过动力学控制的竞争(k

先前关于G.1LigaGuard

表1：在非竞争或竞争条件下G.1和G.2LigaGuard

实施例2

使用G.1和G.2LigaGuard

在图3中，mAb产率和mAb纯度(单体)的等值线图显示为上样的CHO细胞培养收获物的函数(0–100CV；CV：柱体积；注1：这些值相对于1min的停留时间；注2：通过将CHO细胞培养收获物上样到G.2LigaGuard

相反，由于G.2树脂具有更高的结合容量和选择性，观察到其在整个上样范围内提供恒定的mAb纯度值，并且因此提供恒定的累积产率。这一观察结果与图3中描述的结果一致，其中考虑了其他HCCF并用这种吸附剂进行了测试。如表7中所详述的，本研究中采用的工业收获物在细胞系、抗体亚类和滴度方面存在差异，并且在HCP的滴度和性质方面存在显著差异(参见图10中收获物的蛋白质组分布图)。鉴于分子设计框架的多样性以及全球不同生物制药公司采用的表达系统和条件，在各种原料和上样体积中的高mAb回收率和纯度表明G.2LigaGuard

在图4中比较了在最佳上样条件下在G.1和G.2LigaGuard

最后，图5总结了基于用G.1和G.2LigaGuard

测试的各种HCCF在其杂质分布(LMW和HMW物质)方面差异很大，这些杂质在原料中含量范围介于1％-20％之间。通过HMW和LMW物质的清除率，很好地反映了G.2树脂相对于其G.1同类的优良纯化活性。具体地，G.1树脂在较高上样比率下观察到的纯化能力的损失意味着较高的杂质观察值平均值和较大的杂质观察值范围。相反，G.2树脂在整个上样范围中保持的杂质清除活性得到更一致的产物性质，由箱线图标记，从代表原料(蓝色)中LMW和HMW成分的点来看该箱线图较窄且明显分开。值得注意地，这些数据表明，G.2树脂通过靶向HCP完成了工艺和产物相关的蛋白质杂质的去除，包括其形成由HCP介导的mAb聚集体，这些聚集体最终展示在聚集的蛋白质颗粒的表面上。

实施例3

宿主细胞蛋白质的清除：总体结果和物质特定结果。几十年来，ELISA一直被视为生物工艺流中滴度和HCP清除率定量的全球标准，并且对治疗性mAb生产批次的验证继续依赖于ELISA试剂盒，其证明残留的HCP杂质是低于FDA规定的限值。然而，最近，质谱法作为一种用于蛋白质鉴定以及(甚至在最近)定量的先进分析技术的普及，已经显示具有可接受的总体杂质水平的mAb制剂可能含有一定量的单个HR-HCP，这些HR-HCP由于其固有的免疫原性或在储存过程中降解mAb产物的能力而对患者健康构成威胁。在此上下文中，越来越多的文献证明商业蛋白质A和精加工吸附剂难以去除HR-HCP。这些“持久性”HR-HCP已在工艺基础和产品批次基础上得到了强调，并且已经被报道导致临床试验和工艺批准的延迟以及mAb批次的召回。

考虑到这些经验，使用经由ELISA的总体定量法和经由通过质谱法(LC-MS/MS)对流通流出物的蛋白质组学分析的单一蛋白质跟踪法评估了LigaGuard

值得注意的是，在停留时间为1min时，一致地观察到较高的HCP清除率。这可以通过mAb产物和HCP杂质之间的配体结合动力学以及它们之间的竞争来解释。虽然后者在动力学上(k

随着HCP结合肽配体变得逐渐饱和，它们捕获单个HCP或HCP类的能力可能会下降。因此，随着上样的进行，有必要对流出物进行监测，以追踪可能对产物质量和患者安全造成威胁的特定HCP的穿透。在这方面，大量文献已经确定并表征了CHO HCP的作用，其通过与mAb产物一起从蛋白质A树脂上洗脱而在纯化管线中持续存在，并逃脱精加工吸附剂，并且具有高免疫原性或在储存过程中降解mAb产物。

为记录LigaGuard

虽然这些数值并未描述去除的HCP的质量或浓度，并且因此无法直接与LRV进行比较，但它们提供了由LigaGuard

然后调查通常结合的HCP，包括蓝色液滴边界中的那些HCP，以确定由G.1和G.2LigaGuard

从流出物的蛋白质组学分析中获得的最重要结论是各种收获物中确定的“持久性”、“高风险”CHO HCP的清除率。工业生物工艺中通常鉴定的HCP的列表以及G.1和G.2LigaGuard

如上所述，虽然证明了“流通亲和色谱法”范例的值，但G.1前体不足以捕获一些极具问题的HCP。相反，G.2LigaGuard

作为最终评估的一部分，将来自G.2LigaGuard

表2：由G.1和G.2LigaGuard

表3：由G.1和G.2LigaGuard

关于LigaGuard

当面对在mAb滴度、产物性质以及HCP滴度和多样性差异很大的不同工业CHO HCCF的挑战时，G.2树脂表现出显著的稳健性，证明了额外的肽配体确实增强了吸附剂的纯化能力。此外，与随着上样其HCP结合活性急剧下降的前体G.1树脂不同，相比之下G.2树脂在整个上样体积范围内实现始终更高的总体HCP LRV(0.5–2)。G.2树脂在生物工艺持久性HCP进入mAb纯化管线(即捕获、中间纯化和最终精加工的序列，在它们对产品质量和患者健康构成威胁之前)之前将其捕获的能力是显著的。因此，虽然适合作为后蛋白质A精加工步骤，但LigaGuard

此外，LigaGuard

实施例4

使用LigaTrap

如图20所示，结合缓冲液的pH值是LigaTrap

这些结果与LigaTrap配体的组成一致，所述配体的特征在于疏水性、阳离子和氢键合部分的组合。由于pIgG的等电点在7.0-8.1的范围内变化，因此在疏水性和氢键相互作用的驱动下，显然结合在7.4时最高，这提供了耐盐结合；此外，当pH值降低至4时，洗脱可能是由pIgG上的诱导阳离子和配体之间的静电排斥引发的。当在低盐度下进行柱上样时，洗脱的pIgG的纯度随pH值降低。这归因于阴离子血浆蛋白质，诸如α

为进一步提高LigaTrap

实施例5

使用LigaGuard

同时，与重组来源的血浆(其中Ig蛋白质与非Ig蛋白质的比率在1-2·10

与pH值相比，缓冲液组成对pIgG产率具有较小但仍值得注意的影响。事实上，在pH7.4时，用不同结合缓冲液获得的Y

当在pH 7.4下操作时，观察到非Ig血浆蛋白质的大量流通：当达到约1-1.5mL(2-3CV)的上样体积时，C

利用这些结果，进行了实验以评估LigaGuard

最值得注意地，Q

表4：在1min停留时间处与通过将5mL(10CV)经稀释的血浆上样到LigaGuard

为增加流出物中Y

根据这些结果，对从稀释的充分冷冻的血浆中pIgG的流通纯化进行了迭代。图28C和图28E中报告了Y

实施最佳上样条件以从未充分冷冻的血浆中纯化pIgG。图28F和图28G中报告的产物产率与上样体积和纯度与上样体积的所得分布图(C

实施例6

使用两步工艺从充分冷冻的血浆中纯化pIgG：保护-捕获与捕获-精加工。先前的工作表明了在单克隆抗体的工艺纯化中，在亲和性捕获步骤之前使用LigaGuard

双柱工艺的总体产率明显受到第一步骤的限制(Y

在进一步提高pIgG回收率和生产率的尝试中，提出了一种替代性的双柱工艺，其包括以结合和洗脱模式使用LigaTrap

值得注意地，优势产物捕获实质性提高了总回收率(Y

表5总结了两种替代性工艺设计的性能，其连同产物产率和纯度一起报告了产物流中pIgG富集和非Ig血浆蛋白质的清除率的相应值。采用第一工艺配置实现的显著纯化水平表明了拟定技术用于纯化血浆衍生治疗剂的潜力。

表5：与通过在不同树脂序列和上样pH值下将1mL充分冷冻的血浆上样到LigaGuard

综合考虑，这些结果表明使用整合了以流通模式捕获非Ig血浆蛋白质的基于肽的吸附剂LigaGuard

实施例7

LigaTrap

实施例8

使用LigaTrap

根据以上讨论的结果，将LigaTrap

在10mg pIgG/mL树脂的上样值下，产物产率高达95.1％，并且纯度为91.0％，与原料相比对应于3倍富集，因此进一步证实了LigaTrap

实施例9

使用LigaGuard

实施例10

经由“流通”亲和色谱法进行的AAV8纯化。使用填充在1.5mL色谱柱中的G.2LigaGuard

分析型尺寸排阻色谱法-超高压液相色谱法(SEC-UPLC)用于高通量mAb纯度评估。使用BioResolve SEC mAb柱，使用在pH 7下的50mM磷酸钠缓冲液中的200mM KCl和0.05-0.1％ NaN

实施例11

经由流通亲和色谱法进行AAV2纯化。使用填充在0.65mL色谱柱中的G.2LigaGuard

表6：使用流通模式进行的AAV2衣壳的回收率指标。

实施例12

使用LigaGuard

分析型尺寸排阻色谱法-超高压液相色谱法(SEC-UPLC)用于高通量AAV滴定评估。使用BioResolve SEC mAb柱，使用在pH7下的50mM磷酸钠缓冲液中的200mM KCl和0.05-0.1％ NaN

实施例13

使用LigaGuard

分析型尺寸排阻色谱法-超高压液相色谱法(SEC-UPLC)用于高通量AAV滴定评估。使用BioResolve SEC mAb柱，使用在pH7下的50mM磷酸钠缓冲液中的200mM KCl和0.05-0.1％ NaN

实施例14

使用LigaGuard

分析型尺寸排阻色谱法-超高压液相色谱法(SEC-UPLC)用于高通量AAV滴定评估。使用BioResolve SEC mAb柱，使用在pH7下的50mM磷酸钠缓冲液中的200mM KCl和0.05-0.1％ NaN

实施例15

使用LigaGuard

分析型尺寸排阻色谱法-超高压液相色谱法(SEC-UPLC)用于高通量AAV滴定评估。使用BioResolve SEC mAb柱，使用在pH7下的50mM磷酸钠缓冲液中的200mM KCl和0.05-0.1％ NaN

4.材料和方法

Fmoc-保护的氨基酸Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Il e-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-As p(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH和Fmoc-Leu-OH、偶联剂氮杂苯并三唑四甲基脲六氟磷酸(HATU)、和二异丙基乙胺(DIPEA)、哌啶和三氟乙酸(TFA)来源于ChemImpexInternational(Wood Dale,IL,US A)。Toyopearl AF-氨基-650M树脂是从TosohBioscience(Tokyo,Japan)获得的。三异丙基硅烷(TIPS)、1,2-乙二硫醇(EDT)、茴香醚、Kaiser检测试剂盒、NISTmAb和蛋白质G

表7：本研究中使用的CHO细胞培养收获物中的mAb滴度和性质以及HCP滴度。

LigaGuard

静态结合研究。静态结合研究是使用北卡罗来纳州立大学BTEC捐赠的空CHO-S细胞培养收获物在G.1LigaGuard

经由“流通”亲和色谱法进行mAb纯化。使用填充在0.1mL色谱柱中的G.1和G.2LigaGuard

使用分析型蛋白质A色谱法进行mAb定量。使用安装在配备有Waters 2487双吸光度检测器的Waters Alliance 2690系统(Waters Corporation,Milford,MA,USA)上的0.1mL蛋白质G Sepharose Fast Flow柱，经由分析蛋白质G色谱法测量CHO细胞培养收获物和使用G.1和G.2LigaGuard

分析型尺寸排阻色谱法(SEC)用于高通量mAb纯度评估。使用Yarra 3μm SEC-2000柱以在pH 7.4下的PBS作为流动相，分析流通级分的分子量分布。按0.5mL/min的流速进样50μL的样本体积，并在280nm下连续监测流出物的UV吸光度。基于保留时间将所得色谱图分成(i)高分子量峰区段(MW>150kDa)、mAb产物峰区段(MW约150kDa)和低分子量峰区段(10kDa

经由CHO特异性酶联免疫吸附测定(ELISA)测量HCP LRV。还使用从CygnusTechnologies(Southport,SC)获得的CHO特异性ELISA试剂盒分析选定的流通级分，以测量使用G.1和G.2LigaGuard

经由液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS)进行蛋白质组学分析。根据先前工作中所述的蛋白质组学方案分析CHO HCCF和流通级分。简言之，最初使用改编自

材料。Fmoc-Cys-(Trt)-Rink聚苯乙烯树脂购买自Anaspec(Fremont,CA,USA)，Toyopearl AF-氨基-650M树脂是从Tosoh Corporation(Tokyo,Japan)获得的，并且WorkBeads 40ACT树脂来自Bioworks(Uppsala,Sweden)。Fmoc-N-[3-(N-Pbf-胍基)-丙基]-甘氨酸来自PolyPeptide(Torrance,CA,USA)。芴基甲氧羰基-(Fmoc-)保护的氨基酸Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-OH、六氟磷酸氮杂苯并三唑四甲基脲(HATU)、二异丙基乙胺(DIPEA)、哌啶和三氟乙酸(TFA)是从ChemImpex International(Wood Dale,IL,USA)获得的。Kaiser检测试剂盒、三异丙基硅烷(TIPS)和1,2-乙二硫醇(EDT)是从Millipore Sigma(St.Louis,MO,USA)获得的。N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、甲醇和N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)是从Fisher Chemical(Hampton,NH,USA)获得的。

处于冻干形式的人多克隆免疫球蛋白G(IgG)购自Athens Research&Technology,Inc(Athens,GA,USA)。富含Ig的糊以及充分冷冻和未充分冷冻的人血浆是CSL Behring(King of Prussia,PA,USA)的馈赠。磷酸二氢钠(NaH

LigaTrap

LigaTrap

使用LigaTrap

通过第一代和第二代LigaGuard

等式1：

等式2：

等式3：

其中C/C

使用包含LigaGuard

通过分析型蛋白质G色谱法定量IgG产率。使用配有Waters2487双吸光度检测器的Waters Alliance 2690分离模块系统(Waters Corporation,Milford,MA,USA)，通过分析型蛋白质G色谱法测定收集的级分中的IgG浓度。将湿法填充在Vici Jour PEEK 2.1mm IDx30mm柱(0.1mL)中的蛋白质G Sepharose

表8：通过分析型蛋白质G色谱法进行IgG定量的HPLC方法。

为评估IgG产物的穿透比(C/C

通过尺寸排阻色谱法(SEC)进行IgG纯度的定量。然后使用以在pH 7.4下的PBS作为流动相的40分钟等度方法运行的Yarra 3μmSEC-2000 300mm x 7.8mm柱，通过分析SEC分析收集的级分。进样体积为50μL的样本，并在280nm吸光度(A280)下通过UV光谱法连续监测流出物。使用等式4计算IgG(P,％)的级分纯度。

等式4：

其中P(％)

通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)定量IgG纯度。以Tris/甘氨酸/SDS缓冲液作为运行缓冲液使用4-20％ Mini-PROTEAN

等式4的推导。第x个流通级分中所含的人IgG的纯度由等式4a严格定义，其中C

等式4a：

在SEC色谱图中，对应于人IgG的峰的面积和对应于非IgG血浆蛋白质的峰的总面积(基于停留时间确定)与IgG和非IgG血浆蛋白质的浓度成正比。事实上，朗伯-比尔定律(Lambert-Beer law)指出，溶液中蛋白质的浓度等于蛋白质的摩尔消光系数(λ)乘以溶液的吸光度(A)的乘积。将朗伯-比尔定律应用于等式4a得出等式4b：

等式4b：

在假设所有血浆蛋白质的摩尔消光系数相似(λ

等式4：

值得注意的是，假设λ