一株具有预防或治疗龋齿和牙周病功效的唾液联合乳杆菌

技术领域

本发明属于益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株具有预防或治疗龋齿和牙周病的唾液联合乳杆菌及其应用。

背景技术

口腔健康是人体健康的重要组成部分，直接或间接影响全身健康。口腔内存在多种厌氧和好氧微生物，如唾液链球菌，发酵乳杆菌，变异链球菌，血链球菌等，这样微生物相互之间制衡，维持健康，一旦致病的微生物大量繁殖，就会导致各种口腔疾病，如龋病、牙周疾病，口腔溃疡，口臭等，致病菌分泌的胞外产物还会破坏牙齿硬组织和牙齿周围支持组织，除影响咀嚼、言语、美观等功能外，还会引起社会交往困难和心理障碍。有些微生物长期存在于口腔中，可导致或加剧某些全身疾病如冠心病、糖尿病等，危害全身健康，影响生命质量。

龋病是人体口腔最常见的慢性感染性疾病，是牙痛和失牙的主要病理性原因，其本质是由多种致龋因素导致的牙体脱矿与再矿化循环的失衡。变异链球菌是最常见的致龋微生物。产胞外多糖和产酸是变异链球菌两大主要致龋毒力因素。在蔗糖依赖性粘附的生物学过程中，变异链球菌能利用葡糖基转移酶代谢蔗糖产生葡聚糖，以促其与牙体粘附和形成生物膜。

牙周病是指发生在牙周组织的疾病，包括仅累及牙龈组织的牙龈病和波及深层牙周组织(牙周膜、牙槽骨、牙骨质)的牙周炎两大类。牙周疾病是常见的口腔疾病，是引起成年人牙齿丧失的主要原因之一，也是危害人类牙齿和全身健康的主要口腔疾病。现已公认，菌斑是牙周病的始动因子，是引起牙周病的主要致病因素，最常见的致病菌是有牙龈卟啉单胞菌，具核梭状杆菌和中间普氏菌等引起。

益生菌是一类对宿主有益的微生物，联合国粮农组织(FAO)与世界卫生组织(WHO)共同定义为“以适当剂量服用时，对宿主(人或动物)健康有益的活体微生物制剂”。关于益生菌作用的研究在胃肠道方面已有许多，但在口腔医学(尤其是牙周病)领域，近年来才刚刚起步。研究表明，益生菌对黏膜细胞的粘附是益生菌发挥其黏膜保护作用的首要条件。益生菌能够与病原菌通过竞争粘附位点总数，竞争营养物质和生长因子，产生抗菌物质，破坏病原菌形成的生物膜，抑制病原菌的生长，从而可以达到维持口腔健康的目的。目前，筛选抑菌性能好的口腔益生菌是本领域的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有预防或治疗龋齿和牙周病的唾液联合乳杆菌及其应用，从而弥补现有技术的不足。

本发明所提供的唾液联合乳杆菌，为唾液联合乳杆菌VHProbi A17(Lagilactobacillus salivarius VHProbi A17)株，于2022年03月01日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2022172。

所提供的唾液联合乳杆菌VHProbi A17株，其16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。

所提供的唾液联合乳杆菌VHProbi A17株的蛋白质谱图如图1所示，Riboprinter指纹图谱如图2所示。

本发明另一个方面还提供所述的唾液联合乳杆菌VHProbi A17株的一种用途，是在制备具有抗氧化功能的制品中的用途。

本发明再一个方面还提供所述的唾液联合乳杆菌VHProbi A17株在制备具有预防或治疗口腔疾病功能的制品中的应用。

所述的口腔疾病为龋齿或牙周病。

所述的制品为保健品、药品或口腔护理用品。

所述的口腔护理用品可以是牙用凝胶、牙粉、牙膏、漱口剂、口喷剂、口香糖、牙线、牙齿清洁液、牙齿清洁泡沫中的任意一种。

本发明还一个方面是提供一种用于抑制口腔病原菌的制品，所述的制品中包含有上述的唾液联合乳杆菌VHProbi A17株的活菌和/或裂解液；

所述的裂解液是通过将唾液联合乳杆菌VHProbi A17株新鲜菌液超声破碎后，再进行热灭活得到的。

本发明提供的唾液联合乳杆菌VHProbi A17对引起龋齿的变异链球菌和粘性放线菌，对致牙周疾病的牙龈卟啉单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌的具有显著的抑制效果，可以作为口腔益生菌使用，有效预防和改善口腔疾病。唾液联合乳杆菌VHProbi A17的裂解液还能够去除变异链球菌形成的生物膜和抑制变异链球菌、粘性放线菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌的生长繁殖，可以添加到药品、保健品，以及牙膏、漱口水等牙齿护理产品中使用。同时唾液联合乳杆菌VHProbi A17具有抗人工胃液和人工肠液的能力，能够在肠道内定植并发挥益生作用。

附图说明

图1为唾液联合乳杆菌VHProbi A17的蛋白质谱图；

图2为唾液联合乳杆菌VHProbi A17的Riboprinter指纹图谱；

图3为唾液联合乳杆菌VHProbi A17与四株致病菌的凝集试验图；其中A为唾液联合乳杆菌对照，B为唾液联合乳杆菌+变异链球菌；C为唾液联合乳杆菌+牙龈单胞卟啉菌；D为唾液联合乳杆菌+具核梭状杆菌；E为唾液联合乳杆菌+半放线聚集杆菌；

图4为唾液联合乳杆菌VHProbi A17对变异链球菌的抑制生长曲线图；

图5为唾液联合乳杆菌VHProbi A17对变异链球菌的抑制粘附试验图，其中A为对照组，B为实验组；

图6为唾液联合乳杆菌VHProbi A17抑制牙龈卟啉单胞菌粘附到人正常牙龈上皮细胞的图片；其中A为对照组，B为实验组；

图7为唾液联合乳杆菌VHProbi A17抑制具核梭状杆菌粘附到人正常牙龈上皮细胞图片；其中A为对照组，B为实验组；

图8为唾液联合乳杆菌VHProbi A17抑制半放线聚集杆菌粘附到牙龈上皮细胞图片；其中A为对照组，B为实验组。

具体实施方式

经多相分类学鉴定，本发明提供的唾液联合乳杆菌VHProbi A17为一株新发现的菌株；可以作为一种食品原料来源使用，长期服用不会有副作用及过量的风险。本发明的唾液联合乳杆菌VHProbi A17能有效抑制常见的口腔病原菌，具有重要的应用价值。

所筛选的唾液联合乳杆菌(Lagilactobacillus salivarius VHProbi A17)VHProbi A17于2022年3月1日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2022172。

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1菌株的分离筛选

1、初筛：

依据2019版《人类遗传资源库伦理规范》，与样本提供者签订项目承诺书和知情同意书后，按照生物样本库标准操作规范，搜集半年内未食用益生菌制剂的健康婴幼儿粪便；将粪便进行系列稀释，取10

2、抗变异链球菌菌株复筛

(1)准备底层琼脂平板

提前准备好底层1.5％琼脂平板，晾干。

(2)变异链球菌菌液制备

分别在BHI平板上划线活化变异链球菌ATCC 25175，CCTCC AB 99010，BNCC700610，然后挑取单菌落到BHI肉汤培养基中，37℃有氧培养24h，然后按照1％的比例转接到新的BHI肉汤培养基中，37℃有氧培养24h，得到新鲜菌液，新鲜菌液按照1：1：1等体积混匀，即得到变异链球菌菌液。

以下实施例中所述的变异链球菌菌液均与本实施例相同。

采用三株不同的变异链球菌作为指示菌株，更能体现筛选的乳酸菌对变异链球菌的抑菌能力。

(3)牛津杯抑菌实验

准备0.7％琼脂含量的BHI培养基，灭菌；等温度降到47℃以下，加入0.3％(体积比)混合好的变异链球菌菌液，摇匀；取7mL倾倒至底层琼脂平板上，等凝固后，放上牛津杯，在孔里分别加入150μL初筛乳酸杆菌的发酵菌液，37℃培养48h，观察有无抑菌圈。

结果显示，本发明初筛获得的23株乳酸杆菌中，只有2株菌对变异链球菌有抑制效果，出现明显的抑菌圈。其中ZY3菌株对变异链球菌的抑制作用最显著，其发酵菌液产生的抑菌圈直径达到27mm。

实施例2 ZY3菌株的鉴定

1、菌落形态鉴定

将ZY3菌株接种于MRS琼脂培养基上，37℃厌氧培养24h后，可见单菌落呈乳白色有光泽，菌落表面平整湿润，边缘整齐，菌落直径在1-2mm。显微镜下呈短杆状。

2、碳源代谢试验鉴定

利用API 50CHL试剂条测定ZY3菌株对49种碳源的代谢作用。

在无菌条件下，取适量新鲜菌液，5000rpm离心5min，用pH7.0磷酸缓冲液洗涤2次，再用同体积缓冲液重悬后，制得菌悬液。新鲜菌悬液按照10％的添加量加到API试剂盒的培养基中，然后按照试剂盒的操作，把培养基加到试纸条的孔里面，石蜡封口，然后把试纸条放到一个盒子里面，盒子底物加大约10ml的无菌去离子水，盖上盖子，放置到37℃培养箱中培养24-48h，观察颜色变化，若菌生长则颜色由蓝色变成黄色，不生长颜色维持不变。记录试验结果，上传到鉴定软件API web。

结果显示，ZY3菌株能利用葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露糖醇、山梨糖醇、N-乙酰葡萄糖胺、七叶苷、麦芽糖、蔗糖、海藻糖和D-阿拉伯糖醇；不能利用甘油、赤藓糖醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、核糖、半乳糖、D-侧金盏花醇、β-甲基-D-木糖苷、山梨糖、α-甲基-D-葡萄糖苷、苦杏仁苷、黄柏素、鼠李糖、水杨苷、纤维二糖、卫矛醇、肌醇、α-甲基-甘露糖苷、乳糖、蜜二糖、棉子糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-来苏糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、菊粉、松三糖、龙胆二糖、土伦糖、D-塔格糖、葡萄糖酸盐、L-阿拉伯糖醇、2-酮葡萄糖酸盐和5-酮葡糖酸盐。

API鉴定结果：ZY3菌株为唾液联合乳杆菌，ID＝99.8％，T值＝0.43。

3、分子生物学鉴定

3.1 16s rDNA基因序列分析

3.1.1基因组DNA提取

挑取ZY3菌株的单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h，然后取500μL发酵菌液，参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302)操作，得到该菌株的基因组。

3.1.2 16s rDNA基因扩增

(1)引物序列:

27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA；

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。

(2)反应体系(50μL)

表1：6s rDNA PCR扩增体系表

(3)电泳验证PCR产物核酸电泳结果为1500bp左右时符合要求。

(4)PCR产物测序

通过测序获得ZY3菌株的16s rDNA序列为SEQ ID NO:1，并将序列在NCBI数据库中进行比对，确定ZY3菌株为唾液联合乳杆菌。

3.2蛋白质谱鉴定

用牙签沾取平板上ZY3菌株的单菌落于蛋白质谱板上，然后用牙签把菌泥涂布均匀在质谱板上的圆盘内，涂布菌泥不需要太厚，然后按照蛋白质谱试剂盒说明书要求加入1μL质谱样本预处理盒中的基质溶液覆盖样品，室温下自然晾干。晾干后的质谱板放置到Motitof蛋白质谱仪上进行鉴定。

蛋白质谱鉴定结果如图1所示，经过鉴定ZY3菌株为唾液联合乳杆菌，匹配率为80.75％。

3.3 Riboprinter指纹图谱

用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取已纯化好的ZY3菌株的单菌落，将其放入缓冲液的样品管中，用手持搅拌棒使其在缓冲液中悬浮，然后将样品放入加热器中灭活后放入Riboprinter系统中，样品经过DNA制备、转模、成像检测及数据处理后，得到细菌鉴定结果。

鉴定结果显示，ZY3菌株为唾液联合乳杆菌，其指纹图谱见图2。

3.4全基因组测序

把ZY3菌株的菌液按照1％的体积比例接种到500mL MRS肉汤培养基中，37℃培养22h，然后8000rpm离心10min，收集菌体。菌体送到测序中心，得到该菌的全基因序列，基因序列上传至NCBI基因数据库，GenBank号为CP097165、CP097166、CP097167、CP097168和CP097169。其中CP097165为基因组序列号，CP097166、CP097167、CP097168和CP097169为质粒的序列号。

将ZY3菌株的菌落形态以及生理生化特性结果进行比对，并综合分子生物学的鉴定结果，确定ZY3菌株为一株新型的唾液联合乳杆菌，并命名为唾液联合乳杆菌VHProbiA17(Lagilactobacillus salivarius VHProbi A17)。

实施例3唾液联合乳杆菌VHProbi A17的溶血性试验

1、血细胞培养基准备：

称取TBS基础培养基的各种组分，溶解，121℃高压灭菌15min，等培养基冷却到50℃的时候，加入5％的无菌脱纤维绵羊血，混匀，倒平板。

2、划线培养：

将唾液联合乳杆菌VHProbi A17菌株划线接种于准备好的血细胞平板，37℃培养箱培养，24～48h观是否有溶血现象。

3、实验结果：

血细胞平板没有变化，说明唾液联合乳杆菌VHProbi A17不产生溶血素，不能够溶解血细胞。

实施例4唾液联合乳杆菌VHProbi A17菌株抗氧化能力测定

1、菌悬液制备

将生长状态优良的唾液联合乳杆菌VHProbi A17单菌落接种于3mL的MRS液体培养基中，37℃条件下培养24h，以此培养液为接种液，按照2％的接种量接种于50mL的MRS液体培养基中，静置培养24h，获得菌株的培养液。吸取1mL菌液收集菌体后用1mLpH 7.0磷酸缓冲液洗涤菌体两遍后再加入等体积缓冲液重悬菌体备用。

2、菌株清除DPPH自由基能力的测定

取1mL待测菌株的菌悬液，加入1mL 0.4mM的现配的DPPH自由基溶液，混合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30min，然后测定样品在波长517nm处的吸光度A样品，测3次平行。对照组样品以等体积磷酸缓冲液和DPPH·乙醇混合液，并以等体积菌悬液和乙醇混合液空白调零。清除率按下列公式计算。

清除率％＝[1-(A样品-A空白)/A对照]×100％。

结果显示，唾液联合乳杆菌VHProbi A17对DPPH自由基的清除率为20.9％。

3、菌株清除羟基自由基能力的测定

将100μL 5mM的水杨酸钠-乙醇溶液，100μL 5mM的硫酸亚铁，500μL去离子水和200μL乳酸菌菌悬液混匀后加入100μL 3％过氧化氢溶液，37℃水浴15min后，4000rpm离心10min收集上清在510nm波长处测量样品吸光度。羟自由基清除率按照下列公式进行计算。

清除率％＝(A样品-A控制)/(A空白-A控制)×100％。

其中：A控制为硫酸亚铁、过氧化氢和水杨酸钠混合溶液的吸光度，A空白为硫酸亚铁和水杨酸钠混合溶液的吸光度。

结果显示，唾液联合乳杆菌VHProbi A17对羟基自由基的清除率为10.6％。

实施例5唾液联合乳杆菌VHProbi A17对人工胃液和人工肠液的耐受性

1、菌液制备：

将冷冻保存的唾液联合乳杆菌VHProbi A17菌株划线接种于MRS固体培养基中，37℃培养24～48h，再经MRS液体培养基传代培养1次后，以5％的接种量把唾液联合乳杆菌VHProbi A17接种到新鲜的MRS液体培养基中40℃振荡培养24～48h，获得新鲜的菌液。

2、人工胃液的配制

分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g和NaCl 2g，加入1000ml蒸馏水，用稀盐酸调pH3.0，然后115℃灭菌20min。然后使用前加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床温浴1h，以模拟人体温度。

3、人工肠液的配制

分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g、KH

4、试验方法

取2mL新鲜菌液，5000rpm离心5min收集菌体，菌体用生理盐水洗涤3次，再用2mL生理盐水重悬，作为接种液。取1mL接种液，加入到9mL已温浴1h的人工胃液中，置于37℃水浴摇床以200rpm转速振荡2h，分别于0h和2h时取样1mL，检测活菌量。然后取1mL消化2h后的人工胃液，加入到24mL人工肠液中，置于37℃水浴摇床(200rpm)3h，取样1mL，检测活菌量。

活菌计数方法按照国标《GB4789.35-2016-食品微生物检验乳酸菌检验》测定菌量，该菌株经过人工胃液和人工肠液后的活菌量的LOG(CFU/mL)如表2所示。

表2：人工胃肠道消化后的活菌量表

从表2可知，唾液联合乳杆菌VHProbi A17经过人工胃肠液消化后，活菌量仅有少量下降，从而说明该菌株对人工胃液和人工肠液具有较强的耐受性。

实施例6唾液联合乳杆菌VHProbi A17对口腔致病菌的抑菌效果试验

1、裂解液制备

按照1％的接种量(体积比)把唾液联合乳杆菌VHProbi A17接种到MRS肉汤培养基，37℃培养24h后停止培养，即得新鲜菌液。将部分菌液用超声破碎仪超声破碎20min，超声条件：功率30％，超声2s，停止2s；80℃灭活60min，得到无活菌的裂解液。

参照实施例1中所述牛津杯法抑菌实验步骤，分别测定唾液联合乳杆菌VHProbiA17菌液和裂解液对变异链球菌(三株)、粘性放线菌ATCC27044，牙龈卟啉单胞菌BNCC353909、伴放线聚集杆菌BNCC336945和具核梭状杆菌BNCC 336949这五种口腔常见致病菌的抑菌效果。其中牙龈卟啉单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌的上层培养基换成哥伦比亚血琼脂培养基；抑菌圈直径见表3。

表3：唾液联合乳杆菌VHProbi A17对口腔致病菌的抑菌效果表

从表3的结果可知，本发明提供的唾液联合乳杆菌VHProbi A17对变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、粘性放线菌、伴放线聚集杆菌和具核梭状杆菌这五种口腔致病菌都有明显的抑制效果，具有较广的抑菌谱。其中，该菌株对变异链球菌和粘性放线菌的抑菌效果最强，抑菌圈直径达到22-27mm，且发酵菌液的抑菌效果要略优于裂解液，取得了意料不到的技术效果。

实施例7：唾液联合乳杆菌VHProbi A17对口腔致病菌的凝集效果试验

共聚集是细胞和细胞蛋白质之间的相互作用。益生菌可以通过与致病菌凝集，防止其在口腔中定植和粘附，从而预防龋齿。凝集试验分为两种，一种是根据乳酸杆菌在一定条件下是否与致病菌结合形成可见的絮状沉淀及沉淀的大小来判断凝集作用，另一种是通过测定凝集率来确定共凝集效果。

1、菌悬液制备

按照1％的接种量(体积比)把接种到MRS肉汤培养基，37℃培养24h后停止培养，得新鲜菌液；将新鲜菌液8000rpm转速离心10min，收集菌体；将菌体用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，然后用pH7.0磷酸缓冲液重悬菌体，至菌悬液的初始吸光度OD600为0.5-0.6之间，备用。

2、致病菌菌悬液制备：

按照1％的接种量(体积比)把变异链球菌菌液接种到BHI肉汤培养基，37℃有氧培养24h后停止培养，得新鲜菌液；按照1％的接种量(体积比)把牙龈单胞卟啉菌，半放线聚集杆菌和具核梭状杆菌菌液接种到BHI肉汤培养基(添加5％的牛血清)，37℃厌氧培养48h后停止培养，得新鲜菌液；

将新鲜菌液8000rpm转速离心10min，收集菌体；将菌体用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，然后用pH7.0磷酸缓冲液重悬菌体，调整菌悬液的初始吸光度OD600为0.5-0.6之间，备用。

3、凝集点试验

取唾液联合乳杆菌VHProbi A17菌悬液300μL加入24孔板，再加入300μL病原菌菌悬液作为反应样本，另取等量的唾液联合乳杆菌VHProbi A17菌悬液和缓冲液混合作为对照，每个对照及样本设2平行。将24孔板置于微孔板恒温振荡器，400rpm，室温，振荡孵育。每振荡30min，停机30min，拍照记录初始孔板状态及每次停机时的孔板状态。

从图3的结果可知，2h内唾液联合乳杆菌VHProbi A17与变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌四种致病菌均有凝集点出现。其中，对变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭状杆菌有小而多的凝集点出现，对半放线聚集杆菌有一个大的凝集点出现，从而说明唾液联合乳杆菌VHProbi A17能够常见口腔致病菌有效结合，显著抑制其粘附到牙齿或者牙龈上。

4、自凝集率和共凝集率的测定

(1)自凝集率测定

将制备的唾液联合乳杆菌VHProbi A17菌悬液取1ml加入24孔板内，室温静置。取100μL在波长600nm条件测定初始吸光值A0，在随后的6h内每隔2h吸取菌悬液上层，在波长600nm条件下测量吸光值At。计算自聚力(R自)。结果见表4。

R

式中：R

表4：唾液联合乳杆菌VHProbi A17的自凝集率表

从表4的结果可以看出，本发明提供的唾液联合乳杆菌VHProbi A17 6h时的自凝集率达到41.085％。从而说明，唾液联合乳杆菌VHProbi A17能够在口腔中有效定植。

(2)共凝集率测定

取100μL唾液联合乳杆菌VHProbi A17菌悬液和致病菌菌悬液测定初始吸光值OD600，然后将等量的唾液联合乳杆菌VHProbi A17菌悬液和病原菌菌悬液混合，摇匀，室温静置，每个样品三个平行，每隔2h取上层悬浮液100μL测定吸光值OD600。按下面公式计算共聚力(R

R

式中：R

表5：唾液联合乳杆菌VHProbi A17对口腔致病菌的共凝集效果表

从表5的结果可以看出，本发明提供的唾液联合乳杆菌VHProbi A17可与变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌四种常见的口腔致病菌有效结合，2-6h时内共凝集率达到14.71％-58.63％。其中，唾液联合乳杆菌VHProbi A17对变异链球菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌的共凝集效果最好，6h时的共凝集率高达48.05％-58.63％，取得了意料不到的技术效果。

本发明提供的唾液联合乳杆菌VHProbi A17可以通过与致病菌有效结合，随着唾液流动和口腔清洁等行为，显著减少口腔内致病菌的数量，进而达到减少致病菌在口腔内荷载的效果。

实施例8：唾液联合乳杆菌VHProbi A17对变异链球菌的抑制生长试验

1、裂解液上清制备

将唾液联合乳杆菌VHProbi A17新鲜菌液用超声细胞破碎仪破碎细胞壁，然后80℃处理60min，用0.22μL微孔滤膜过滤除去不溶物，制备得到裂解液上清。

2、接种液制备

将新鲜变异链球菌菌液用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，同体积重悬。然后稀释5倍，作为接种液。

3、96孔板培养

每孔加入50μL BHI肉汤培养基和10μL变异链球菌菌液，其中实验组再加入20μL裂解液上清，对照组加入20μL无菌水；然后每孔用无菌水补充体积到200μL，加入50μL液体石蜡。每组设置4个平行。将96孔板放置于37℃酶标仪中，设置每间隔10min测定一次OD600，测定24h。

从图4上看出，对照组的变异链球菌在接种10h后开始快速增长，20h时达到稳定期；而添加了唾液联合乳杆菌VHProbi A17裂解液上清的实验组，变异链球菌在20h内几乎没有生长，从而说明唾液联合乳杆菌VHProbi A17裂解液能够高效抑制变异链球菌的生长繁殖。

实施例9：唾液联合乳杆菌VHProbi A17对变异链球菌的拮抗粘附试验

变形链球菌是目前公认的龋病主要致病菌，其在口腔内的定植和粘附是龋齿形成的主要原因。因此，口腔益生菌通过与致病菌形成凝集，能够抑制其生长和粘附，进而有效减少口腔疾病。

1、菌悬液制备

按照1％的接种量(体积比)把唾液联合乳杆菌VHProbi A17接种到MRS肉汤培养基，37℃培养24h后停止培养，得新鲜菌液；将新鲜菌液8000rpm转速离心10min，收集菌体；将菌体用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，然后用同体积pH7.0磷酸缓冲液重悬。

2、变异链球菌菌悬液制备：

参照实施例1所述方法制备变异链球菌菌液；将新鲜菌液8000rpm转速离心10min，收集菌体；将菌体用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，然后用同体积pH7.0磷酸缓冲液重悬。

将500μL唾液联合乳杆菌VHProbi A17菌悬液及500μL变异链球菌菌悬液混合均匀，静置5min后，取500μL的上层溶液添加至已置入无菌细胞爬片的24孔板中，于37℃的温度下培养2h，再移除该上层溶液，以pH7.0磷酸盐缓冲液清洗后，加入0.5mL甲醇固定10min，然后弃去。最后加入300μL吉姆萨染液染色10min，然后弃去染液，用PH 7.0磷酸缓冲液冲洗一遍，将细胞爬片置于载玻片上观察细胞爬片上的菌量。

结果如图5所示，对照组细胞爬片上粘附满了变异链球菌，而添加了唾液联合乳杆菌VHProbi A17的实验组细胞爬片上有很少的变异链球菌，可视范围内几乎看不到，说明唾液联合乳杆菌VHProbi A17能够有效抑制变异链球菌粘附到细胞爬片上。从而说明，本发明提供的唾液联合乳杆菌VHProbi A17能够有效阻止病原菌粘附到牙齿上，进而预防龋齿的发生。

实施例10：唾液联合乳杆菌VHProbi A17对变异链球菌的生物膜消除作用

变形链球菌在牙齿表面粘附和聚集会形成一层生物膜，进而产酸物质导致龋齿的发生。因此，去除变异链球菌形成的生物膜，对预防龋齿非常重要。

1、参照实施例1所述方法制备新鲜的变异链球菌菌液。

2、按照1％的接种量(体积比)把唾液联合乳杆菌VHProbi A17接种到MRS肉汤培养基，37℃培养24h后停止培养，得新鲜发酵液。将发酵液分三部分进行如下处理：

(1)将部分发酵液8000rpm离心10min，收集菌体；将菌体用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，然后用同体积pH7.0磷酸缓冲液重悬，制备得到活菌菌悬液；

(2)将部分发酵液用超声破碎仪超声破碎20min，超声条件：功率30％，超声2s，停止2s；80℃灭活60min，得到无活菌的裂解液；

(3)部分发酵液不进行任何处理。

3、准备无菌的带细胞爬片的24孔板

每孔加入600μL变异链球菌的菌液，培养24h后，变异链球菌在细胞爬片上粘附形成一层生物膜，然后弃除孔内的培养液和未粘附的菌体，用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次；孔内加入600μL的唾液联合乳杆菌VHProbi A17发酵液、菌悬液和无活细胞的裂解液，其中每组做3个平行，并以等量MRS肉汤培养基作对照。

让待测样品和变异链球菌形成的生物膜37℃共培养24h,然后弃去孔内的液体后，加入600μL pH7.0磷酸缓冲液清洗，将每孔清洗3次，清洗时需不断强烈振动以除去未黏附的细菌，然后通过对比细胞爬片上变异链球菌的数量对比来判断待测样品生物膜的去除率。

将细胞爬片置于无菌均质袋内，超声清洗10min，使菌体扩散到缓冲液中，然后通过一系列稀释，取100μL涂布到添加了200U/L杆菌肽的轻质唾液链球菌培养基上37℃有氧培养24h，检测定变异链球菌的菌量，通过以下公式计算变异链球菌生物膜的去除率：去除率(％)＝(1-实验组菌量/对照组菌量)×100％。具体结果见表6。

表6：唾液联合乳杆菌VHProbi A17对变异链球菌生物膜的去除效果表

从表6的数据可知，唾液联合乳杆菌VHProbi A17能高效去除变异链球菌形成的生物膜。其中，菌悬液即单纯的菌体对生物膜的去除率为40.79％，说明菌体细胞膜上有变异链球菌的结合位点，单纯的菌体自身也能够与变异链球菌结合，短时间内去除部分生物膜；而发酵液和裂解液中除了含有菌体自身外，还含有较多的代谢物质，能够更高效去除变异链球菌形成的生物膜，去除率高达100％。因从而说明，本发明提供的唾液联合乳杆菌VHProbi A17能有效预防或治疗由变异链球菌引起的龋齿，可广泛用于牙膏、漱口水等口腔护理用品中。

实施例11：唾液联合乳杆菌VHProbi A17对人正常牙龈上皮细胞:毒性试验

1、细胞预培养

将人正常牙龈上皮细胞液氮中复苏，二氧化碳培养箱培养至所需量，待细胞密度生长至80％左右时，胰酶消化成单细胞悬液，血球计数板计数，细胞数为5×10

2、灭活菌液制备

唾液联合乳杆菌VHProbi A17的新鲜菌液置于80℃水浴锅中灭活20min，然后用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤三次，用细胞培养液重悬菌体，并调整菌体浓度OD600＝0.4-0.5之间。

3、细胞培养

实验组：将灭活菌液按MOI(Multiplicity of Infection,感染复数)值为10的比例加入24孔板的细胞中；

空白对照组：加入与灭活菌液等体积的细胞培养液。

二氧化碳培养箱中继续培养24h。

在待检测的每个细胞培养孔中加入MTT溶液，使其终浓度为0.3g/L；将24孔板放置于二氧化碳培养箱中孵育3h，小心弃掉上清；每个24孔板细胞培养孔中加入500μL DMSO，37℃下孵育30min，使紫色结晶充分溶解；在波长490nm下检测吸光度值。

结果显示，空白对照组的吸光值是0.668，而实验组的吸光值是0.680，基本相当。从而说明，唾液联合乳杆菌VHProbi A17对人正常牙龈上皮细胞的增殖活性无显著影响，安全性良好，无细胞毒性。

实施例12：唾液联合乳杆菌VHProbi A17对牙龈上皮细胞的粘附性

1、细胞预培养

将人正常牙龈上皮细胞液氮中复苏，培养至所需量，待细胞密度生长至80％左右时，胰酶消化成单细胞悬液，血球计数板计数，细胞数为5×10

2、菌悬液制备

将唾液联合乳杆菌VHProbi A17新鲜菌液用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤两次，然后用含10％小牛血清的1640培养液同体积重悬，调整吸光度，使OD600＝0.4-0.5之间。

3、细胞培养

在已准备好的含人原代牙龈上皮细胞的24孔板内加入菌悬液500μL，于二氧化碳培养箱中共生培养2h；用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤3次，去除未粘附的菌。

4、镜检

将细胞爬片用甲醇固定15min，然后吉姆萨染液染色5min，pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤冲洗干净后，取出细胞爬片到载玻片上。在显微镜下观察并计数，随机选择50个细胞，并计算其可视性细胞表面的唾液联合乳杆菌VHProbi A17数量，运用统计学方法计算粘附指数的均数和标准差。

粘附指数＝粘附细菌数/细胞数。

结果显示，五个牙龈细胞上大约粘附1个唾液联合乳杆菌VHProbi A17菌体，粘附指数是0.2。从而说明，唾液联合乳杆菌VHProbi A17粘附性能良好，可以定植在口腔中。

实施例13：唾液联合乳杆菌VHProbi A17在细胞水平上对牙周致病菌的拮抗粘附试验

1、细胞预培养

将人正常牙龈上皮细胞液氮中复苏，培养至所需量，待细胞密度生长至80％左右时，胰酶消化成单细胞悬液，血球计数板计数，细胞数为5×10

2、菌悬液制备

将唾液联合乳杆菌VHProbi A17新鲜菌液用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤两次，然后用含10％小牛血清的1640培养液同体积重悬，调整吸光度，使OD600＝0.4-0.5之间。

采样同样方法分别制备得到牙龈卟啉单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌菌悬液。

3、细胞培养

实验组：将唾液联合乳杆菌VHProbi A17菌悬液和致病菌菌悬液按照体积比1:1的比例混匀，然后取500μL加入到上述准备好的24孔板内；

对照组：将致病菌菌悬液和磷酸盐缓冲液按照体积比1:1的比例混匀，然后取500μL加入到上述准备好的24孔板内。

将24孔板置于二氧化碳培养箱中共生培养2h，终止培养，用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤3次，去除未粘附的菌。

4、镜检

每个孔加入500μL甲醇固定15min，然后吉姆萨染液染色5min，pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤冲洗干净后，取出孔内的细胞爬片到载玻片上。在显微镜下观察并计数，随机选择50个细胞，并计算其可视细胞表面的致病菌数量，运用统计学方法计算粘附指数的均数和标准差，具体结果见表7。镜检结果如图6-8所示。

粘附指数＝粘附细菌数/细胞数。

表7：唾液联合乳杆菌VHProbi A17对牙周致病菌的拮抗粘附效果表

从图6-8以及表7的数据可以看出，与对照组相比，添加唾液联合乳杆菌VHProbiA17菌悬液的实验组牙龈卟啉单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌对牙龈上皮细胞的粘附指数普遍下降了87％-95％，其中对半放线聚集杆菌的粘附抑制最强，粘附指数仅有1.64。从而说明，唾液联合乳杆菌VHProbi A17能显著抑制常见牙周致病菌对牙龈上皮细胞的粘附作用，取得了意料不到的技术效果。

上述细胞实验结果表明，唾液联合乳杆菌VHProbi A17对人正常牙龈上皮血细胞没有毒性，能够显著抑制牙周致病菌(牙龈卟啉单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌)在牙龈上皮细胞上的粘附生长，有效预防和改善牙周炎、牙龈出血等症状。

序列表

<110>青岛蔚蓝生物股份有限公司

青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120>一株具有预防或治疗龋齿和牙周病功效的唾液联合乳杆菌

<160>1

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>1389

<212>DNA

<213>唾液联合乳杆菌(Lagilactobacillus salivariu)

<400>1

ctttgggtgt tacaaactct catggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta60

ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact agcgattccg acttcgtgta ggcgagttgc 120

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