一种用于脑梗诊断与检测的生物标志物及其相关应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种用于脑梗诊断与检测的生物标志物及其相关应用。

背景技术

脑梗又称缺血性卒中，中医称之为卒中或中风。本病系由各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性病变坏死，进而产生临床上对应的神经功能缺失表现。脑梗塞病人的临床症状表现在意识、认知、运动、语言和感觉等方面，病情较轻的病人短时间内会出现四肢麻木无力甚至眩晕等现象；而病情严重者，容易发生偏瘫、脑疝甚至死亡。脑梗塞发病率高、死亡率高并具有低预防率的特点，是严重危害人类健康的主要疾病之一，也是致残的首位病因，其病死率仅低于心肌梗死和癌症，位居第三位。脑梗死依据发病机制的不同分为脑血栓形成、脑栓塞和腔隙性脑梗死等主要类型。其中脑血栓形成是脑梗死最常见的类型，约占全部脑。

目前脑梗塞的诊断是基于临床病史、体格检查、神经影像学和实验室检查。影像学的诊断方法有很多种，其中CT检查(电子计算机体层扫描)、MRI(磁共振成像)、DSA(数字减影血管造影术)是最常用的影像检查方法。但各种检查方法均存在一定的局限性，如CT检查对缺血性卒中敏感度低，妊娠或装有心脏起搏器者不宜进行MRI检查，同时对造影剂过敏或麻醉剂过敏的病人无法进行DSA检查等；因此迫切需要早期准确诊断脑梗塞的新方法。

对此，也要一些脑梗生物标志物已经被研究，现有技术参考如下：

CN113063718A中公开了以血浆内皮细胞膜微粒(EMVs)作为脑梗死生物标志物。

CN113447601B中公开了以半乳糖神经酰胺作为诊断脑梗死及脑白质病变的生物标志物。

CN114137226A中公开了脑梗塞诊断标志物，由如下10种物质组成：4-二甲基烯丙基色氨酸(4-dimethylalyltryptophan)、牛磺鹅脱氧胆酸-3-硫酸酯(Taurochenodeoxycholate-3-sulfate)、三己糖神经酰胺(d18:1/18:0)【Trihexosylceramide(d18:1/18:0)】、溶血磷脂酰胆碱(18:0)【LysoPC(18:0)】、精氨酸-丙氨酸(Arginyl-Alanine)、天门冬氨酸-色氨酸(Asparaginyl-Tryptophan)、甲硫氨酸-精氨酸(Methionyl-Arginine)、鞘磷脂d37:5(SMd37:5)、磷脂酰甘油(12:0/21:0)【PG(12:0/21:0)】和葡糖神经酰胺(d18:0/18:0)【GlcCer(d18:0/18:0)】。

目前这些生物标注物，虽然能够一定程度上检测出动脑梗，但是并不全面，需要进一步挖掘出更适宜、检测结果更为稳定的生物标志物。

发明内容

本发明的目的是提供脑梗生物标志物及相关的应用，对脑梗结果检测更稳定，丰富了脑梗生物标志物库。

本发明的第一方面，提供脑梗生物标志物，包括ZYX基因、CST3基因、RAB11B基因、SPHK1基因、TGFB1基因、NME4基因中的任意一种或几种。

本发明的第二方面提供了本发明第一方面所述的生物标志物在制备诊断脑梗的诊断或检测产品中的应用。

优选地，所述生物标志物ZYX基因、CST3基因、RAB11B基因、SPHK1基因、TGFB1基因、NME4基因联合使用，具有高灵敏度、高特异性、稳定性好、检测迅速等优点。

第三方面，本发明提供了一种脑梗诊断或检测试剂盒，包括检测本发明第一方面所述的脑梗生物标志物表达水平的试剂。

优选地，检测所述脑梗生物标志物表达水平的试剂包括RNA提取试剂、逆转录试剂和PCR扩增试剂。

优选地，检测所述脑梗生物标志物表达水平的PCR扩增引物为：

利用本发明试剂盒对脑梗进行诊断，相比传统仅利用影像学诊断方法，更具有早期诊断的应用价值，有助于早期发现治未病，减少疾病发展的医疗成本，降低急重脑梗发生的几率，改善病人生存质量。

相比现有技术，本发明提供的七种生物标志物，单独使用，特异性和灵敏性更好，尤其适用于联合使用，检测稳定性更高。

附图说明

附图1为相关基因的ROC曲线图；

附图2为不同样本生物标志物ZYX、CST3、RAB11B、SPHK1的q-pcr基因检测结果；

附图3为不同样本生物标志物SHARPIN、NME4、TGFB1的q-pcr基因检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

实施例1

脑梗生物标志物的筛选

收集25例脑梗患者和30例健康人，信息如下表1：

表1样本信息

1.样本血小板分离和RNA提取

取样本血液，在收集后24小时内从血液样品中分离血小板，以尽量减少血小板RNA质量和数量的损失。为了分离血小板，富含血小板血浆(PRP)在1000rpm的离心步骤分离。抽取的PRP并转移到1.5ml Eppendorf管中，然后通过20分钟3000rpm的离心步骤使血小板沉淀。随后除去上清液，观察到血小板为白色沉淀。使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液洗涤血小板，然后在15分钟3000rpm离心步骤后将其去除，之后进行瞬时离心，并去除残留的PBS溶液。沉淀的血小板使用TRIzol试剂(Invitrogen)处理纯化总RNA。

2.文库构建和mRNA测序

样品检测合格(OD260/OD280值在1.8-2.0)，用带有Oligo(dT)的磁珠富集RNA。随后加入fragmentation buffer将mRNA随机打断。以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成cDNA第一链，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase I合成cDNA第二链，随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库。库检合格后，不同文库按照有效浓度及目标下机数据量pooling后Illumina Novaseq 6000测序。

3.差异基因分析

使用DEseq2比较健康人组与脑梗患者组mRNA的表达差异，共筛选出4224个差异基因，其中与健康组相比，脑梗患者组有3692个基因上调，532个基因下调(|Log2FC|>2和q-value≤0.05)。为了识别有价值的基因，我们进一步选择了BaseMean值(BaseMean值比较低，即基因的丰度比较低，比如某个基因，在A组中的表达量均值为16，在B中的平均表达量为2，虽然差了8倍，但由于丰度低，可信度就低，很有可能也会判定为无差异。)靠前的34个基因作为潜在生物标志物，包含：

MT-CO1、MT-ND4L、NRGN、MMD、ZYX、RNF11、CST3、TRIM58、FKBP8、C12orf75、5-sep、CD151、CDKN2D、GAS2L1、MTND2P28、SCN1B、UNC13D、RAB32、FAM110A、RASGRP2、ARHGAP45、CRAT、TAGLN2P1、LRP10、NENF、RAB11B、MTCO1P12、SPHK1、PPDPF、ACTBP2、TGFB1、NME4、KIFC3、SHARPIN，详细信息见表2。

表2 34个潜在生物标志物的信息

4.KEGG通路富集分析

KEGG是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库，在KEGG PATHWAY数据库中，将生物代谢通路划分为6类，分别为：细胞过程(Cellular Processes)、环境信息处理(Environmental Information Processing)、遗传信息处理(Genetic InformationProcessing)、人类疾病(Human Diseases)、新陈代谢(Metabolism)、生物体系统(Organismal Systems)。将预处理的差异表达基因进行KEGG通路富集分析，结果见附图1，了解差异表达基因的相关功能与作用通路，并筛选出相应的核心基因，详见表3。

表3筛选出的核心基因

实施例2

标志物鉴定

受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)反映了灵敏度与特异度间的平衡，ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标，ROC曲线下面积(area undercurve，AUC)越大，试验的诊断价值越大。AUC>0.5的情况下，AUC越接近1，表明诊断标志物的诊断效果越好。约登指数(Youden index)也称正确指数，是评价筛查试验真实性的方法，假设其假阴性(漏诊率)和假阳性(误诊率)的危害性同等意义时，即可应用约登指数。约登指数是灵敏度与特异度之和减去1。表示筛检方法发现真正的患者与非患者的总能力。指数越大说明筛查实验的效果越好，真实性越大。相关基因的ROC曲线如附图2所示。

将各通路的核心基因与之前筛选出的34个差异基因进行交集，得到：ZYX、CST3、CDKN2D、CRAT、RAB11B、SPHK1、TGFB1、NME4、SHARPIN。以约登指数≥0.8，AUC≥0.5，且是通路核心基因为条件，筛选出ZYX、CST3、RAB11B、SPHK1、TGFB1、NME4、SHARPIN这7个基因为脑梗诊断的生物标志物。

表4 7个生物标志物对应的AUC值、敏感度、特异性和约登指数

实施例3

基因验证

通过测序获得目标基因序列，利用Primer Premier 6软件设计所选取的7个生物标志物基因的qpcr引物，引物序列见表5。

表5 7个生物标志物基因的qpcr引物

采集脑梗患者样本16例和健康人样本25例，使用设计的引物进行q-pcr基因拷贝数检测，实验流程如下，结果见附图3。

样本经过血小板分离、RNA提取质检后(过程同上)，进行逆转录，转录体系如下(反转录试剂均采自赛默飞)：

50uM OligodT(20)primer：1ul；

10mM dNTP mix：1ul；

RNA：2ul；

Rnasy-free H2O：9ul。

反应程序为：65℃5min，ice 1min；

5X SSIV buffer：4ul；

100mM DTT：1ul；

RRI：1ul；

SuperScript IV：1ul；

反应程序为：50℃10min，80℃10min。

转录后的产物(cDNA)即可进行q-PCR，反应体系如下：

2x SYBR GREEN Mix：5ul；

Primer-F(10uM)：0.2ul；

Primer-R(10uM)：0.2ul；

RNeasy-free H2O：3.6ul；

cDNA：1ul；

反应程序为：

50℃2min

95℃5min

95℃15s

60℃1min

95℃15s

60℃15s

95℃15s

最终实验结果：ZYX、CST3、RAB11B、SPHK1、TGFB1、NME4在健康人和脑梗患者中相对表达量具有统计学差异(p<0.05)。SHARPIN标志物在健康人和脑梗患者中相对表达量无明显差异(P＝0.798)。

表6不同样本中7个生物标志物基因的相对表达量及P值

截断值

截断值即判断标准，对于变量为二分类的数据，连续型自变量截断值的确定通过ROC分析，选用约登指数(敏感度+特异度-1)最大的点(最大值)为最佳截断值点，是判定健康人与脑梗患者的界值，确定基因表达量中正常值和患病值的范围，以区分正常与异常。分别计算得到ZYX、CST3、RAB11B、SPHK1、NME4、TGFB1约登指数最大值分别为0.8、0.8、0.7、0.8、0.8、0.7。ZYX、CST3、RAB11B、SPHK1、NME4、TGFB1约登指数最大值对应的截断值分别为0.527、0.470、1.002、0.856、0.845、1.590。当基因相对表达量低于对应的截断值时，依据基因约登指数最大值对应的敏感度和特异性评估患者脑梗的发生率。

表7 6个生物标志物基因的特异性、敏感度、约登指数及截断值

经过验证，表明ZYX、CST3、RAB11B、SPHK1、TGFB1、NME4这6个基因可以作为脑梗诊断的生物标志物。