一种用于多糖提取的磁性分子印迹聚合物的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于聚合物吸附材料领域，具体涉及一种用于多糖提取的磁性分子印迹聚合物的制备方法及其应用。

背景技术

海带多糖(Laminarin)是一种天然高分子聚合物，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、免疫调节等多种生物学活性。常用溶剂法、膜分离法、柱层析法和色谱法等方法分离纯化，传统的方法提取海带多糖步骤繁琐，耗时长，而且分离得到的海带多糖存在纯度低、成本高、含有重金属离子、硫酸化程度低等缺点，难以直接用于医疗。因此，亟需一种高效的吸附材料用于从海带粗品中高效、简洁的提取海带多糖。分子印迹聚合物(MIPs)是一类对目标分子具有高选择性和亲和力的新型材料。它们具有高选择性、特异性识别能力，并被广泛应用于从复杂样品中富集目标物的选择性吸附材料。目前，分子印迹聚合物的研究主要集中小分子化合物，对大分子主要是蛋白质和核酸等，鲜少有多糖的分子印迹聚合物的报道。主要原因是多糖易溶于水，且水与多糖的羟基的相互作用强，常用的功能单体在水中与多糖的相互作用弱，吸附量和印迹因子都较低。因此，采用分子印迹技术制备一种具有高选择性、特异性识别的吸附材料，用于从海带中高效、简洁的提取海带多糖具有重大的意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决多糖提取过程步骤繁琐，耗时长、提取的多糖纯度低、成本高、一般多糖分子印迹聚合物吸附量和印迹因子低等问题，提供一种用于多糖提取的磁性分子印迹聚合物的制备方法及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种用于多糖提取的磁性分子印迹聚合物的制备方法，所述方法具体为：

步骤一：功能单体4-乙烯基苄基三甲基氯化铵的合成：将4-乙烯基苄氯和无水乙醇混合，加入30％的三甲胺乙醇溶液在20～40℃反应1～24h，产物在60℃减压蒸馏，除去溶剂，60℃恒温干燥，得到4-乙烯基苄基三甲基氯化铵白色晶体；

步骤二：将海带多糖与4-乙烯基苄基三甲基氯化铵，搅拌预聚合1h，然后加入Fe

一种用于多糖提取的磁性分子印迹聚合物的制备方法，所述方法具体为：

步骤一：4-乙烯基苄基三甲基氯化铵的合成：将4-乙烯基苄氯和无水乙醇混合，加入30％的三甲胺乙醇溶液在20～40℃反应1～24h，产物在60℃减压蒸馏，除去溶剂，60℃恒温干燥，得到4-乙烯基苄基三甲基氯化铵白色晶体；

步骤二：深共晶溶剂的制备：摩尔比为1:1～4的4-乙烯基苄基三甲基氯化铵和4-乙烯基苯甲酸加入25mL的反应瓶中，50～100℃水浴下反应1～4h即得到透明粘稠的液体；

步骤三：将海带多糖与深共晶溶剂加入反应瓶中，搅拌预聚合1h，然后加入Fe

一种上述制备的磁性分子印迹聚合物用于海藻酸多糖、岩藻多糖、海带多糖的提取。

本发明相对于现有技术的有益效果为：本发明制备的磁性分子印迹聚合物可应用于实际海带多糖的提取，极大的节约了时间，简化了海带多糖的提取步骤。此外，也可以应用于其他结构类似多糖的分离纯化，有望作为新型的吸附材料用于天然产物中其他多糖的分离和纯化。

本发明采用相对小分子量(4～5kDa)的海带多糖(Laminarin)作为模板分子，4-乙烯基苄基三甲基氯化铵(VBTAC)和4-乙烯基苯甲酸(VBA)深共晶溶剂(DESs)作为双功能单体，丙烯酸修饰的四氧化三铁作为磁核，通过表面分子印迹技术制备了一种多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物。制备的磁性分子印迹聚合物颗粒呈球形、大小均一，表面富含空穴，具有良好的吸附性能，可用于从海带多糖粗品中快速的提取海带多糖，极大的节约了时间和简化海带多糖的提取步骤。此外，类特异性也表明分子印迹聚合物可以用于其他多糖的提取，有望作为新型的吸附材料用于天然产物中多糖的分离和纯化。

附图说明

图1为多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)扫描电镜图；

图2为多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)制备的反应时间条件优化图；

图3为多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)制备的交联剂用量条件优化图；

图4为多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)制备的引发剂用量条件优化图；

图5为多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)制备的载体用量条件优化图；

图6为多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)和非分子印迹聚合物(NIPs)动力学吸附曲线图；

图7为多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)和非分子印迹聚合物(NIPs)一级动力学模型拟合图；

图8为多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)和非分子印迹聚合物(NIPs)二级动力学模型拟合图；

图9为多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)和非分子印迹聚合物(NIPs)等温吸附曲线图；

图10为多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)和非分子印迹聚合物(NIPs)Langmuir模型拟合图；

图11为多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)和非分子印迹聚合物(NIPs)Freundlich模型拟合图；

图12为多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)选择性吸附图；

图13为多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)重复利用性图；

图14为多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(DMIPs)扫描电镜图；

图15为多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(DMIPs)制备的交联剂用量条件优化图；

图16为多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(DMIPs)制备的引发剂用量条件优化图；

图17为多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(DMIPs)制备的载体用量条件优化图；

图18为多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(DMIPs)和非分子印迹聚合物(DNIPs)动力学吸附曲线图；

图19为多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(DMIPs)和非分子印迹聚合物(DNIPs)一级动力学模型拟合图；

图20为多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(DMIPs)和非分子印迹聚合物(DNIPs)二级动力学模型图；

图21为多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(DMIPs)和非分子印迹聚合物(DNIPs)等温吸附曲线图；

图22为多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(DMIPs)和非分子印迹聚合物(DNIPs)Langmuir模型拟合图；

图23为多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(DMIPs)和非分子印迹聚合物(DNIPs)Freundlich模型拟合图；

图24为多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(MIPs)选择性吸附图；

图25为多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(MIPs)重复利用性图；

图26为海带多糖粗品、海带多糖、MIPs和DMIPs纯化海带多糖液相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。

具体实施方式一：本实施方式记载的是一种用于多糖提取的磁性分子印迹聚合物的制备方法，所述方法具体为：

步骤一：功能单体4-乙烯基苄基三甲基氯化铵(VBTAC)的合成：将4-乙烯基苄氯和无水乙醇(溶剂)混合，加入30％的三甲胺乙醇溶液(乙醇是反应原料)在20～40℃反应1～24h，产物在60℃减压蒸馏，除去溶剂，60℃恒温干燥，得到4-乙烯基苄基三甲基氯化铵白色晶体；

步骤二：将海带多糖与4-乙烯基苄基三甲基氯化铵加入反应瓶中，搅拌预聚合1h，然后加入Fe

制备的单功能单体磁性分子印迹聚合物由于使用4-乙烯基苄基三甲基氯化铵(VBTAC)作为功能单体，表面富含大量季铵基团，在水溶液中与海带多糖的硫酸酯形成离子对和氢键相互作用，因此制备的单功能单体磁性分子印迹聚合物对于含有硫酸酯基和羧基的海带多糖吸附效果较好，可用于从复杂样品中提取海带多糖。

本发明采用表面分子印迹技术制备海带多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物，分别进行了分子印迹聚合物制备条件的优化，最终确定了海带多糖单功能磁性分子印迹聚合物制备条件。

具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种用于多糖提取的磁性分子印迹聚合物的制备方法，步骤一中，所述功能单体4-乙烯基苄基三甲基氯化铵(VBTAC)的合成时4-乙烯基苄氯与三甲胺的摩尔比为1:1～4，反应温度为25℃，反应时间为12h。

具体实施方式三：具体实施方式一所述的一种用于多糖提取的磁性分子印迹聚合物的制备方法，步骤二中，海带多糖(Laminarin)与4-乙烯基苄基三甲基氯化铵(VBTAC)的摩尔比例为1：10～40，4-乙烯基苄基三甲基氯化铵(VBTAC)与交联剂(MBA)的摩尔比例为1：1～20，Fe

具体实施方式四：一种具体实施方式一至三任一项制备的磁性分子印迹聚合物用于海藻酸多糖、岩藻多糖、海带多糖的提取。

具体实施方式五：本实施方式记载的是一种用于多糖提取的磁性分子印迹聚合物的制备方法，所述方法具体为：

步骤一：4-乙烯基苄基三甲基氯化铵(VBTAC)的合成：将4-乙烯基苄氯和无水乙醇(溶剂)混合，加入30％的三甲胺乙醇溶液(乙醇是反应原料)在20～40℃反应1～24h，产物在60℃减压蒸馏，除去溶剂，60℃恒温干燥，得到4-乙烯基苄基三甲基氯化铵白色晶体；

步骤二：深共晶溶剂的制备：摩尔比为1:1～4的4-乙烯基苄基三甲基氯化铵(VBTAC)和4-乙烯基苯甲酸(VBA)加入25mL的反应瓶中，50～100℃水浴下反应1～4h即得到透明粘稠的液体；

步骤三：将海带多糖与深共晶溶剂加入反应瓶中，搅拌预聚合1h，然后加入Fe

深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物提取海带多糖的原理：制备的深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物由于使用4-乙烯基苄基三甲基氯化铵(VBTAC)和4-乙烯基苯甲酸(VBA)作为双功能单体，表面富含大量季铵基团和羧基，在水溶液中季铵基团与海带多糖的硫酸酯基形成离子对和氢键相互作用，同时羧基可以和海带多糖的羟基形成氢键作用，增加了识别位点，提高了特异选择性。因此制备的深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物对于海带多糖吸附效果更好，可用于从复杂样品中提取海带多糖。

本方案在单功能单体基础上，为了提高吸附量和特异性，引入了4-乙烯基苄基三甲基氯化铵(VBTAC)和4-乙烯基苯甲酸(VBA)的深共晶溶剂(DESs)作为双功能单体；采用表面分子印迹技术制备了多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物，分别进行了分子印迹聚合物制备条件的优化，确定了多糖深共晶溶剂双功能磁性分子印迹聚合物制备条件。制备的多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物可应用于实际海带多糖的提取。

具体实施方式六：具体实施方式五所述的一种用于多糖提取的磁性分子印迹聚合物的制备方法，步骤一中，所述4-乙烯基苄基三甲基氯化铵(VBTAC)合成时，4-乙烯基苄氯与三甲胺的摩尔比为1:1～4，反应温度为25℃，反应时间为12h。

具体实施方式七：具体实施方式五所述的一种用于多糖提取的磁性分子印迹聚合物的制备方法，步骤二中，所述深共晶溶剂制备时，4-乙烯基苄基三甲基氯化铵(VBTAC)和4-乙烯基苯甲酸(VBA)的摩尔比为1：1，水浴温度为70℃，反应时间为1h。

具体实施方式八：具体实施方式五所述的一种用于多糖提取的磁性分子印迹聚合物的制备方法，步骤三中，海带多糖(Laminarin)与深共晶溶剂的摩尔比例为1：10～80，深共晶溶剂与交联剂(MBA)的摩尔比例为1：1～20，Fe

具体实施方式九：一种具体实施方式五至八任一项制备的磁性分子印迹聚合物用于海藻酸多糖、岩藻多糖、海带多糖的提取。

实施例1：

(1)Fe

(2)Fe

(3)功能单体4-乙烯基苄基三甲基氯化铵(VBTAC)的合成：将152.6mg(1mM)4-乙烯基苄氯和5mL乙醇一起加入三口烧瓶内，开启搅拌，滴加300μL(1.5mM)30％三甲胺乙醇溶液，滴加完毕后，继续恒温反应12h。将反应后的产物在60℃下减压蒸馏，蒸出其中的溶剂，经60℃恒温干燥，得到对-乙烯基苄基三甲基氯化铵白色晶体。

(4)多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物的制备：称取模板分子海带多糖6mg(1μM)和(3)中合成的对乙烯基苄基三甲基氯化铵(VBTAC)8mg(40μM)于反应瓶中，搅拌预聚合1h，加入10mg Fe

(5)进行(4)中多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物制备条件优化，以吸附量作为指标。具体操作：称取5mg材料于2mL EP管中，各加入2mL 2mg·mL

其中，Q为材料对海带多糖的吸附量，单位为μg·mg

在优化反应时间时设置不同反应时间，分别设置反应时间2、4、6、8、10、12h，如图2多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)制备的反应时间优化图所示，考虑效率原因，选择最优反应时间为10h。在最佳时间下优化交联剂用量，分别设置用量为10、20、30、40、50、60mg，如图3多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)制备的交联剂用量优化图所示，最佳交联剂用量为30mg吸附量最大。在最佳反应时间和交联剂用量下，优化引发剂用量，分别设置用量为5、10、15、20、25、30mg，如图4多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)制备的引发剂用量优化图所示，最佳引发剂用量为15mg吸附量最大。在前面最优条件下优化载体用量，分别设置用量为5、10、15、20、25、30mg，如图5多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)制备的载体用量优化图所示，最佳载体用量为10mg吸附量最大。最终确定了多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)的最佳制备条件为时间为10h，交联剂用量为30mg，引发剂用量为15mg，载体用量为10mg。

(6)在(5)最优制备条件下批量制备多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物，进行一系列吸附性能研究。包括动力吸附实验、等温吸附实验、竞争选择性实验、重复利用实验和真实样品实验。

动力吸附实验：具体操作：分别准确称取5mg材料，加入2mL浓度为2mg·mL

为进一步研究在不同时间下，印迹聚合物对目标化合物的吸附情况，按照准一级动力学反应方程和准二级动力学反应方程对吸附过程进行曲线拟合。

准一级动力学方程式：

准二级动力学方程：

Q

图6多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)和非分子印迹聚合物(NIPs)动力学吸附曲线图显示，MIPs和NIPs随着吸附时间的增加，吸附量逐渐增大，且MIPs的吸附量比NIPs的吸附量大，60min后基本达到吸附平衡。如图7多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)和非分子印迹聚合物(NIPs)一级动力学拟合图和图8多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)和非分子印迹聚合物(NIPs)二级动力学模型拟合图所示，准二级动力学模型拟合结果有较好的线性关系，说明MIPs和NIPs对海带多糖的吸附过程是一种化学吸附。

等温吸附实验：具体操作：分别准确称取5mg的材料，加入2mL不同浓度的laminarin溶液(0.4、0.81.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mg·mL

为了研究不同初始浓度条件下印迹材料的表面性质，我们使用Langmuir和Freundlich等温吸附模型拟合等温线吸附曲线，分析印迹聚合物的等温吸附过程。

Langmuir模型：

Freundlich模型：

其中，Q

图9多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)和非分子印迹聚合物(NIPs)等温吸附曲线图显示，随着溶液中laminarin质量浓度的增加，吸附材料对laminarin的吸附量也逐渐增加，当浓度超过4mg·mL

竞争选择性实验：具体操作：准确称取5mg的MIPs，加入2mL浓度为2mg·mL

其中，α为选择系数，Q

如图12多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)选择性吸附图所示，MIPs对目标化合物laminarin有较高的吸附量，可达到192μg·mg

重复利用性实验：具体操作：准确称取5mg的MIPs，加入2mL浓度为2mg·mL

其中，η为MIPs的重复使用率，Qn为n次的吸附量，n＞1，μg·mg

图13多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物(MIPs)重复利用性图显示，MIPs即使经过5次重复吸附-解吸附，吸附量仍然可以到达初始吸附量的90.43％，说明制备的MIPs具有较好的重复利用性。

真实样品实验：具体操作：分别准确称取20mg MIPs于10mL EP管中，加入10mL2mg·mL

如图26海带多糖粗品、海带多糖、MIPs和DMIPs纯化海带多糖液相色谱图所示。海带多糖粗品含有多种多糖，采用MIPs固相萃取后，色谱图峰明显减少，存在与海带多糖峰相同保留时间的峰，表明MIPs可以特异性吸附海带多糖。

实施例2：

(7)在(4)的基础上，为了提高吸附量和特异性，引入了4-乙烯基苄基三甲基氯化铵(VBTAC)和4-乙烯基苯甲酸(VBA)深共晶溶剂作为双功能单体，其余条件不变，制备多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物。其中深共晶溶剂的制备具体操作为：摩尔比为1:1的4-乙烯基苄基三甲基氯化铵(VBTAC)和4-乙烯基苯甲酸(VBA)加入25mL的反应瓶中，70℃水浴下反应1h即得到透明粘稠的液体。

(8)在(7)基础上上进行多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物制备条件优化，以吸附量和印迹因子作为指标。印迹因子公式为：

其中，IF为印迹因子，Q

具体操作：称取5mg材料于2mL EP管中，各加入2mL 2mg·mL

在优化制备多糖深共晶溶剂分子印迹聚合物的交联剂用量时，分别设置用量为10、20、30、40、50、60mg。如图15多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(DMIPs)制备的交联剂用量条件优化图所示，当交联剂用量为20mg时吸附量和印迹因子最大。在最佳交联剂用量下优化引发剂用量，分别设置用量为5、10、15、20、25、30mg。如图16多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(DMIPs)制备的引发剂用量条件优化图所示，当引发剂用量为15mg，此时吸附量和印迹因子最大。在前面最优条件下优化载体用量，分别设置用量为5、10、15、20、25、30mg。图17多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(DMIPs)制备的载体用量条件优化图所示，吸附量在载体用量为10mg时最大，此时印迹因子相对较高，因此选择最佳载体用量为10mg。最终确定了最佳制备条件为反应时间为10h，交联剂用量20mg，引发剂用量15mg，载体10mg，

(9)在(8)最优制备条件下批量制备大量多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物，如图14多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(DMIPs)扫描电镜图所示，制备的多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(DMIPs)为均匀的球状结构，粒径约为320nm，表面富含大量空穴。后续分别进行海带多糖的吸附性能研究，包括动力吸附实验、等温吸附实验、竞争选择性实验、重复利用实验和真实样品实验，具体操作同多糖单功能单体磁性分子印迹聚合物操作，只更换材料。

图18多糖深共晶溶剂磁性分子印迹聚合物(DMIPs)和非分子印迹聚合物(DNIPs)动力学吸附曲线图显示，DMIPs和DNIPs随着吸附时间的增加，吸附量逐渐增大，且DMIPs的吸附量比DNIPs的吸附量大，60min后基本达到吸附平衡。DMIPs最大吸附量为322.58μg·mg