一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种PCR检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种 PCR检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)属气单胞菌科(Aeromonadaceae)、 气单胞菌属(Aeromonas)，为兼性好氧或需氧革兰氏阴性菌。主要分为5个亚 种：杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)、史氏亚种 (Aeromonas salmonicidasubsp.smithia)、无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes)、杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.masoucida) 和溶果胶亚种(Aeromonas salmonicidasubsp.pectinolytica)。杀鲑气单胞菌为 多种鱼类疖疮病的病原，传统对病原的鉴定可以根据生理生化特征、菌株形 态、培养特性等特征，然而，这些方法繁琐且耗时，并且易与其他病原菌发 生交叉反应。此外，免疫学技术、环介导等温扩增技术(LAMP)、多重PCR、 荧光定量PCR和常规PCR也被用于检测杀鲑气单胞菌。其中多是基于16S rRNA基因的扩增，但这些方法只能鉴定属，不能鉴定到亚种，且对于序列 高度相似的菌株无法区分。

杀鲑气单胞菌是一种常见的鱼类致病菌，随着养殖规模的扩大、养殖密 度的增加等因素，杀鲑气单胞菌的爆发也越来越频繁。但对于其防治不容乐 观，给临床治疗带来困难。因此，对杀鲑气单胞菌的早期诊断具有重要意义， 常规实验室针对细菌性病原，传统的检测方法首先对病原进行分离、纯培养， 再结合病原的培养特性、形态、生理生化特征等进行判断，耗时长，不利于 控制病情。

杀鲑气单胞菌是多种水产养殖鱼类的重要病原，其中杀鲑亚种是致病性 最强的一个亚种，但是在检测鱼类疖疮病的时候，常规的检测方法无法确定 亚种种类，不能及时使用药物，从而出现错误用药，错过了最佳治疗时间， 导致大批养殖鱼死亡，养殖经济受到重创。且杀鲑气单胞菌疫苗在不同亚种 之间缺乏交叉免疫保护效果，疫苗免疫首先要确定感染的亚种种类。目前， 仅有经验丰富的生物学家通过实验室操作并测序验证才能诊断出杀鲑气单 胞菌杀鲑亚种，其确诊方式复杂，原有的一些杀鲑亚种检测方法均会与其他 亚种发生反应，缺少简便、快速、精准的检测方法。

发明内容

本发明目的在于首次提出了一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种PCR检测试剂 盒及其使用方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

为实现上述目的，本发明提供一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种PCR检测试剂 盒，包括缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、杀鲑气单胞菌杀鲑亚种特异性 PCR检测引物、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为杀鲑气单胞菌杀鲑亚 种ATCC33658基因组DNA，所述阴性对照为灭菌双蒸水；所述杀鲑气单胞 菌杀鲑亚种PCR检测引物如A.salmonicida F1/R1所示。

优选的，上述PCR检测体系的组分为：10×PCR buffer：2.5uL，2 mmdNTPs：2uL，25mM MgSO4：1.5uL，1u/μL酶：0.5μL，10μmol/L 引物各1.5uL，ddH

优选的，上述反应程序为：94℃预变性5min，98℃变性10s，55℃ 退火30s、68℃延伸10s，35个循环，68℃充分延伸10min。

优选的，上述10×PCR缓冲液含有100mM KCl、80mM(NH4)SO4、pH 为9.0的100mMTris-HCl、15mM MgCl2和0.5％Tergitol-type NP-40。

优选的，上述dNTPs包括dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均 为2.5mM。

本发明同时提供一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种PCR检测试剂盒进行非诊 断性检测的方法，包括以下步骤：

S1：使用煮沸法或商品化试剂盒提取细菌基因组DNA，得到检测模板；

S2：PCR扩增，将10×PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、检测 引物以及DNA模板加入灭菌PCR反应管中，添加灭菌双蒸水至总体积25 μl，同时设置阳性、阴性对照，使用PCR仪进行扩增反应；采用2％琼脂 糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果；

S3：如果电泳结果中出现明显亮带，则表示此样本为阳性，反之为阴性。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)检测灵敏度在DNA水平上达到17.6pg；

(2)在细胞水平达到12.8±1.8cfu/反应；

(3)本试验以常见的23株病原菌进行了特异性检测，结果表明只有在 杀鲑气单胞菌杀鲑亚种检测到特异性条带，并且不与其他多种水产病原菌发 生反应，说明该检测方法具有较高的特异性；

(4)进一步缩短了检测时间，节省了经济成本，为病原的快速检测提 供了支撑。

附图说明

图1为本发明优化PCR体系；(a)：2mM dNTPs的优化1-4：1、2、3、 4uL；(b)：25mMMgSO4的优化1-5：1、1.5、2、2.5、3uL；(c)：10μmol/L 引物的优化1-4：1.5、1、0.75、0.5uL；(d)：1u/μL酶的优化：1-4：0.25、 0.5、0.75、1uL，M：DL 2000marker。

图2为本发明优化PCR灵敏度；(a)1-7：每反应以(1.28±0.18)×10

图3为本发明特异性检测结果；A.salmonicida subsp.masoucida， 5-7：A.salmonicida subsp.salmonicida，8：A.salmonicida subsp. achromogenes，9：A.salmonicida subsp.smithia，10：Escherichia coli， 11：Aeromonas hydrophila，12：Vibrio anguillarum，13：Vibrio harveyi， 14：Vibrio harveyi，15：Aeromonasencheleia，16：Photobacterium damselae，17：Photobacterium damselae，18：Vibriosalmonicida，19： Streptococcus iniae，20：Streptococcus parauberis，21：Streptococcus dysgalactiae，22：Edwardsiella piscicida，23：Bacillus，24：空白对照，M：DL 2000marker。

图4为本发明以组织原液为模板进行PCR反应；1：健康鱼组织液、2： 病死鱼组织液、3：阳性对照、4：空白对照、M：DL 2000marker

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实 施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通或改变都落 入本发明保护范围；且下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的 常规方法。

实施例1：

菌株及培养条件

本实验所用菌株如表1，其中杀鲑气单胞菌、鳗鱼气单胞菌在TSA培养 基中20℃培养，迟缓爱德华氏菌、大肠杆菌在LB培养基中37℃培养，嗜 水气单胞菌、美人鱼发光杆菌、鳗弧菌、哈氏弧菌、鳗鱼气单胞菌、副乳房 链球菌、杀鲑弧菌、海豚链球菌、停乳链球菌、枯草芽孢杆菌等其他菌株在 TSA培养基中28℃培养。

表1本实验使用菌株

提取细菌基因组DNA，特异性引物设计和筛选反应条件

本实验使用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，中国)提取杀鲑气 单胞菌杀鲑亚种ATCC33658的基因组DNA。

根据GenBank中杀鲑气单胞菌杀鲑亚种基因phoB序列，设计特异性引 物(A.salmonicida F1/R1)，以杀鲑气单胞菌杀鲑亚种ATCC33658的基因组 DNA为模板。25μLPCR反应体系：2×Taq Plus PCR Master Mix、12.5μL、 ddH

PCR反应体系条件的优化

为优化PCR扩增条件，对反应条件和反应体系中的dNTPs浓度、引物 浓度、Mg2+浓度、酶浓度进行优化，优化条件如表3所示。PCR反应产物 经1.5％琼脂糖凝胶电泳，比较PCR产物的亮度。

表3 PCR反应体系的优化

如图1所示，为了得到最高灵敏度的检测结果，对25uL反应体系进行 优化，结果表明以A.salmonicida F1/R1为引物的PCR反应体系中，2mM dNTPs最适添加量为2、3、4uL，10μmol/L引物最适添加量为1.5uL，25mM MgSO4最适添加量为1.5、2、2.5uL，1u/μL酶最适添加量为0.5、0.75uL(图 1)。为节约用量，后期引物A.salmonicida F1/R1采用的反应体系为10×PCR buffer：2.5uL，2mmdNTPs：2uL，25mM MgSO4：1.5uL，1u/μL酶：0.5 μL，10μmol/L引物各1.5uL，ddH

PCR灵敏度检测

以平板计数法测定液体培养的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种ATCC33658的菌 落个数，用ddH

分光光度计测定杀鲑气单胞菌杀鲑亚种ATCC33658的基因组DNA浓 度，用ddH

如图2所示，当以ATCC33658梯度稀释的菌液为模板时，菌液浓度为 (1.28±0.18)×105-(1.28±0.18)×101cfu/μL时均可扩增出目的条 带，但当菌液浓度为(1.28±0.18)×100cfu/μL未扩增出目的条带，因此 本试验建立的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种A.salmonicida F1/R1 PCR检测方法的 菌液浓度最低灵敏度为12.8±1.8cfu/反应(图2a)。以DNA为模板，当DNA 模板浓度为1.76pg时，未扩增出目的条带，其余浓度均可检测到条带。因 此以引物A.salmonicida F1/R1为反应的PCR检测方法，检出下限为17.6pg/ 反应(图2b)。

PCR特异性检测

本实验所用细菌见表1，取单菌落加入20μL ddH

如图3所示，引物A.salmonicida F1/R1特异性检测表1中的23株菌， 包括4株杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种、3株杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和16株其 他菌属细菌。在以A.salmonicida F1/R1为引物的PCR反应时，仅在杀鲑气 单胞菌杀鲑亚种中扩增出特异性目的条带，从其它细菌的DNA中未扩增出 预期的DNA条带(图3)。因此，本研究以phoB基因设计的引物A.salmonicida F1/R1能特异性地检测杀鲑气单胞菌杀鲑亚种。

鱼体中的病原检测

实验所用大菱鲆购于莱阳某养殖场，体重50-60g，实验前分别养殖于 100L循环海水养殖系统中，养殖水温18℃。感染试验前随机取5尾鱼解剖， 取肝脏、脾脏和肾脏匀浆涂布于TSA培养基，确定试验鱼未携带病原。将试 验鱼随机分为2组，每组10尾，养殖于50L整理箱。利用PBS缓冲液将培 养好的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种ASS20200608XZ11L菌液浓度调整至1×10

如图4，杀鲑气单胞菌杀鲑亚种菌株ASS20200608XZ11L肌肉注射感染 大菱鲆7天内，大菱鲆全部死亡。取50mg组织加入ddH