贻贝油及其制备方法以及在制备提高认知功能制品中的应用

技术领域：

本发明属于医药领域的药物/保健品(功能性食品)、宠物食品的应用技术领域，具体涉及一种贻贝油及其制备方法以及在制备提高认知功能制品中的应用。

背景技术：

多项研究表明，以小胶质细胞激活为主要表现的脑内慢性炎症是衰老过程中脑功能退化的主要诱因，针对其缓慢、渐进的特点，基于食品的营养预防策略尤为重要。

贻贝是一种海产双壳类软体动物，味道鲜美、营养丰富、有“东方夫人”和“海上鸡蛋”的美誉。我国的贻贝主要以活鲜品销售为主，粗加工以冷冻品、干制、罐制、调味品等传统产品为主，产业链短小，同时精深加工方向的发展较为欠缺。迄今为止，与贻贝多糖、蛋白和多肽相比，贻贝中的脂质作为功能性食品或膳食补充剂的商业开发潜力最大，目前针对贻贝脂质的研究主要围绕其抗炎活性，欧洲市面上已有多种贻贝总脂的膳食补充剂，其加工工艺主要有超临界萃取和醇提两种方式，功效主要在于改善慢性关节炎和肠炎。

综上所述，市场现有的贻贝总脂产品，虽然加工工艺简单，但其组分复杂，功能局限，没有针对认知功能的产品；而研究报道有改善认知功能的脂质组分，其制备过程复杂、成本高昂，难以被市场接受。因此，开发一种针对认知功能的、加工工艺简单的贻贝油具有重要意义。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是与现有的贻贝油制品或成分复杂、功能局限，或制备过程复杂、成本高昂，都具有很大的市场局限性。

为解决上述问题，本发明提供了一种贻贝油及其制备方法，率先使用碱提的方法处理贻贝油，得到更容易被吸收的贻贝油制品。该制备方法高效简易，得到的贻贝油制品证实能够抑制小胶质细胞激化，特异性改善脑内慢性炎症，从而具有提高认知功能的作用。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现，一种贻贝油的其制备方法，包括以下步骤：

(1)将贻贝肉破碎物与KOH乙醇溶液混合均匀并进行皂化反应；以沉淀蛋白质组分，将脂质组分抽提到液相溶液中，并可保持甘油骨架sn-1位为烯醚键、sn-2位为羟基、sn-3位为磷酸基团的结构脂质的完整性。原因是，以酯键形式与甘油骨架进行连接的脂肪酸，如甘油三酯、磷脂的sn-2位等，在碱性条件下会水解断开，形成脂肪酸盐和羟基；而烯醚键在碱性条件下可稳定存在。

(2)混合物经过滤弃去固相，保留液相；以除去残留反应物及沉淀的蛋白质组分，保留液相溶液中的结构脂质，并且该液相中还含有脂肪酸钾盐及甾醇等非皂化脂质成分。

(3)向液相中加入提取溶剂，混匀分层；以除去含有非皂化脂质成分的上层，保留下层溶液进行后续操作。

(4)向(3)中的下层液相中加入盐酸进行酸化反应；将脂肪酸钾盐变为游离脂肪酸。

(5)向体系中加入提取溶剂，混匀分层；以除去含有游离脂肪酸的上层，分离下层溶液进行真空浓缩除去溶剂，得到碱提贻贝油。

进一步的，步骤(1)中KOH乙醇溶液的浓度为0.25M，贻贝肉破碎物与KOH乙醇溶液以1：3～5的比例混合。

进一步的，步骤(1)中皂化反应的时间为40～60min。反应进行彻底的同时，可得到较高的目标产物得率。

进一步的，步骤(1)中皂化反应的温度为室温。无需额外控温，节省能耗，并减少加热带来的乙醇挥发。

进一步的，步骤(2)的过滤方法为真空抽滤。

进一步的，步骤(3)和步骤(5)中所用的提取溶剂为正己烷或与正己烷极性相似的液体。

进一步的，步骤(4)中酸化反应的pH为5.5-7。可将脂肪酸钾盐酸化为游离脂肪酸，随后通过步骤(5)去除，并保证sn-1位烯醚键的完整性。

一种上述方法制备得到的贻贝油。

一种上述贻贝油的应用，用于制备抑制小胶质细胞的激化、改善脑内慢性炎症，提高认知能力的制品。贻贝脂质不仅富含n-3多不饱和脂肪酸EPA和DHA，且甘油骨架sn-1位为烯醚键、sn-2位为羟基、sn-3位为磷酸基团的结构脂质在贻贝可食部位中磷脂的占比高达50％，其中EPA、DHA已被证实具有良好的抗炎效果，而本产品中突出的结构脂质在消化吸收和穿越血脑屏障方面具有独特优势，有助于改善脑内脂质组成，保护脑内细胞免受氧化应激，进而抑制小胶质细胞的激化、改善脑内慢性炎症。综上，本贻贝油的应用，可用于制备抑制小胶质细胞的激化、改善脑内慢性炎症，提高认知能力的制品。

进一步的，所述制品为药品。

进一步的，所述制品为保健品或功能性食品。

进一步的，所述制品为宠物食品。

本发明的有益效果在于：

(1)给出了具有显著提高认知功能的碱提贻贝油的高效简易制备方法，为贻贝高值化加工利用提供了基础，有望成为贻贝高值化利用和改善脑内慢性炎症的新途径。

(2)给出了膳食补充碱提贻贝油特异性改善脑内慢性炎症的应用，为缓解老龄化问题提供了新的途径。

(3)给出了膳食补充碱提贻贝油能够改善脑内慢性炎症可能的机制解释，为以贻贝油为主要成分的高端功能食品的开发提供了理论依据。

附图说明

图1：碱提贻贝油的工艺流程图。

图2：碱提贻贝油的薄层色谱分析。

图3：碱提贻贝油的气相色谱/质谱分析。

图4：膳食补充碱提贻贝油对小鼠认知能力的影响。

图5：膳食补充碱提贻贝油对小胶质细胞激活水平的影响。

图6：碱提贻贝油的主要成分结构图。

具体实施方式：

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非特别说明，以下实施例所用材料和试剂均为市购。

实施例1：

1材料与方法

1.1碱提贻贝油制备

将贻贝蒸煮，分离可食部，取100g贻贝肉4份进行破碎，分别与400mL的0.25M KOH乙醇溶液混合均匀，于室温下搅拌皂化20、40、60、120min。混合物经过滤弃去固相，保留液相，向液相中加入100mL正己烷，混匀并使之分层，分离下层液相，加入盐酸进行酸化，调节体系pH至6，静置10min使组分充分酸化。再次向体系中加入100mL正己烷，混匀并使之分层，分离下层液体进行真空浓缩除去溶剂，得到碱提贻贝油。

1.2醇提贻贝油制备

将贻贝蒸煮，分离可食部，取100g贻贝肉进行破碎，置于900mL无水乙醇中浸泡混合，在50℃条件下均匀搅拌1.5h。混合物经过滤分离液相和固相，将液相部分进行真空浓缩除去溶剂得到醇提贻贝油。

1.3柱层析贻贝油制备

将贻贝蒸煮，分离可食部，取100g贻贝肉进行破碎，置于900mL无水乙醇中浸泡混合，在50℃条件下均匀搅拌1.5h。混合物经过滤分离液相和固相，将液相部分进行真空浓缩。将所得产物置于20倍柱体积的正向硅胶柱体系内，以氯仿/异丙醇(体积比2:1)混合物为洗脱剂，除去游离脂肪酸和中性脂，随后以氯仿/甲醇(体积比1:2)混合物为洗脱剂，收集洗脱溶液。向洗脱溶液中加入1/10原料的磷脂酶A1，在50℃下搅拌反应3h，反应结束后以正己烷萃取体系中的脂质组分，真空浓缩除去溶剂，即得到柱层析贻贝油。

1.4气相色谱/质谱分析

以氯仿/甲醇/水(65:25:4，v/v/v)为极性展开剂，对4个反应时间(20min、40min、60min、120min)对应的产物进行薄层色谱分析，根据各组分在薄层色谱板的不同位置进行区分，并以颜色深浅判断目标物质的含量。将极性展开的不同碱提磷脂分子种组分刮下，甲酯化衍生后用气相色谱/质谱分析仪对脂肪酸组成进行分析。色谱条件如下，HP-INNOWax石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.25mm)，高纯氦气为载气，采用恒压模式，压力为54kPa，分流比为25:1。进样口温度为230℃，检测器温度为250℃，柱温以3℃/秒由140℃升到210℃，然后在210℃下保持10min，整个分析过程为33min。GC-MS/MS接口温度280℃，EI离子源,电离能量70eV，离子源温度230℃，扫描周期2.84次/s，进行MS2扫描。质谱分析结果使用NIST MS程序进行搜索匹配。

1.5动物实验

32只SAMP8小鼠喂食棒状饲料至四月龄大，然后喂食高脂饲料至六月龄，按体重随机分为4组，分别为模型组(Model)、碱提贻贝油组(碱提)、醇提贻贝油组(醇提)和柱层析贻贝油组(柱层析)，每组8只小鼠，饲料参考AIN-93G标准饲料，碱提、醇提和柱层析贻贝油的添加量均为1％，小鼠喂养至九月龄时进行认知功能测试。饲料成分如表1所示。

表1动物实验饲料配方(g/kg饲料)

注:“--”，未添加

1.6Morris水迷宫测试

将水池分为4个象限，设定温度为22±1℃。在第一象限中心水面下方1cm处放置圆形平台，摄像装置安放在水池正上方，并与计算机相连。测试过程中为排除标志物以外的其他因素对小鼠空间定位的干扰，向水池加入墨汁。整个行为学测试的过程包括定位航行和空间探索两部分。

定位航行时，平台放置于第一象限，训练小鼠分别从4个象限面向池壁依次放入水池，单次测试的时间为60s，轨迹追踪分析软件自动记录小鼠的潜伏期、平均速度。每天入水的象限顺序依次变化，实验历时5天。

第6天执行空间探索测试，以评估小鼠空间记忆能力。平台被移出泳池，小鼠可以在泳池内自由地游泳60s。记录小鼠在目标区域停留的时间以及穿越平台的次数，并进行统计学分析。

1.7免疫印迹分析

根据RIPA裂解缓冲液的说明从小鼠半脑中提取总蛋白，检测蛋白浓度，100℃加热5min变性后用于免疫印迹分析。取20μg蛋白量上样，采用10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，半干法转移至聚偏二氟乙烯膜上，用5％BSA溶液进行膜封闭2h，用TBST(0.1％Tween-20，20mM Tris,137mM NaCl,pH 7.6)洗涤，在4℃与特异性一抗Iba1RabbitpAb、β-Actin Rabbit pAb孵育过夜，经TBST洗涤后，在室温下使用HRP标记山羊抗小鼠/兔IgG二抗孵育2h，再次用TBST洗涤，最后根据超灵敏化学发光检测试剂盒的说明，对抗原-抗体复合物进行显色，利用凝胶成像仪采集图像，并进行量化分析。目的蛋白表达量以β-Actin蛋白水平作为内参进行校正。

1.8数据统计与分析

实验结果以Mean±SEM表示，采用单因素方差分析(One-WayANOVA)对各组之间的差异进行比较，方差齐采用Tukey法进行事后检验，方差不齐时采用Dunnett’T3法，比较结果以不同字母标识代表p<0.05，视为显著差异。

2结果与讨论

按照如图1所示的工艺流程，分别制备了皂化20min、40min、60min、120min的四种碱提贻贝油，经薄层色谱分析得到如图2所示的主要成分示意图，以PE、PS作为标准品，经位置关系判断出主要组分碱提PE、碱提PC和碱提PS。由碱提组分的颜色深浅判断，皂化反应1h为最佳工艺，因此后续的主成分测定及效果评价以皂化1h所得的碱提贻贝油为原料。

极性展开后刮板所得的各组分的气相色谱/质谱分析结果如图3所示，碱提PE、碱提PC、碱提PS组分中含有sn-1位缩醛结构特征性脂肪酸C16:0、C18:0，而不含sn-2位特征性多不饱和脂肪酸，证明了本发明所制备的碱提贻贝油中富含甘油骨架sn-1位为烯醚键、sn-2位为羟基、sn-3位为磷酸基团的结构脂质。

五天训练期结束后，撤掉平台，进行空间探索实验检验小鼠记忆情况。如图4所示，与模型组小鼠相比，三种贻贝油均显著提高了小鼠目标象限停留时间和穿越平台的次数，其中碱提组小鼠的目标象限停留时间比醇提组和柱层析组分别显著增加了94.5％和47.9％。穿越平台次数也显示出同样趋势，碱提组小鼠穿越平台的次数分别是醇提组和柱层析组的2.13和1.51倍，具有显著差异。综上，碱提贻贝油显示出了优异的提升脑认知功能的效果。

小胶质细胞的激活状态由其激活标志蛋白Iba1的表达量来表征，结果如图5所示。与模型组相比，膳食补充了碱提贻贝油和柱层析贻贝油的小鼠脑Iba1的表达量分别显著降低了73.6％和36.5％。同时，碱提贻贝油组与醇提和柱层析贻贝油组相比，脑Iba1的表达量分别显著降低了66.8％和58.4％。醇提组小鼠脑Iba1的表达量与模型组相比没有显著差异。

以上结果显示碱法提取的贻贝油在提高脑认知能力方面有显著效果，且明显优于普通醇提方式和复杂操作的柱层析方式得到的贻贝油，其发挥作用的主要途径是抑制了脑内小胶质细胞的激活，从而有效缓解了脑内慢性炎症。如图6所示，碱提贻贝油中富含甘油骨架sn-1位为烯醚键、sn-2位为羟基、sn-3位为磷酸基团的结构脂质，其更易于消化吸收以及穿越血脑屏障，进而具有更为显著的改善脑功能的作用。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。