硫氧还蛋白还原酶重组蛋白及其免疫单克隆抗体的制备和应用

技术领域

本发明属于基因工程和免疫领域，具体涉及一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白及其免疫单克隆抗体。

背景技术

硫氧还蛋白系统包括硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase，TrxR)、硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate，NADPH)，是一个广泛分布的NADPH依赖性二硫化物还原酶系统。

硫氧还蛋白还原酶是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，包含保守的Cys Val Asn Val Gly Cys氧化还原位点，催化依赖硫氧还蛋白NADPH还原反应。该酶可直接作用于机体的氧化还原、细胞增殖及DNA合成等生理过程，具有调节细胞生长发育和抗氧化应激的作用，该酶在各种细胞中广泛表达，但在肿瘤及异常增生细胞/组织中的表达水平是正常组织的5-10倍以上，因此临床上通过检测人体内外周血TrxR活性、含量水平，可以动态评估机体内异常增生的发生风险和程度，特别是联合TrxR活性和TrxR蛋白水平综合评定，单位蛋白中的活性评定较单一TR活性评定相比具有临床重要意义。由于不可逆恶性增生是肿瘤的重要特征，在癌症的早期阶段该值就会明显升高，因此硫氧还蛋白还原酶是一种特异性、敏感性、广谱性都较高的肿瘤标志物，提高TrxR检测的灵敏度和特异性具有重要的临床价值。显然综合检测TrxR活性和TrxR蛋白具有重要的临床应用现实意义。

因此，体外制备硫氧还蛋白还原酶和相匹配的单克隆单体对技术对于相关疾病的诊断和治疗研究具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白(TXNRD1)及免疫得到的单克隆抗体对。

本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白，在氨基酸序列C端添加6个His(HHHHHH)片段，氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。

第二方面，本发明提供一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。在本发明的一个实施方案中，是对硫氧还蛋白还原酶氨基酸序列密码子优化后，通过基因合成的方式得到编码基因。

第三方面，本发明还提供重组载体和/或表达菌株，其特征在于，所述重组载体和/或表达菌株，含有所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因。在本发明一个实施方案中，将所述编码基因亚克隆到表达载体，构成重组载体；例如，所述载体为pET28b；在本发明另一个实施方案中，将所述编码基因亚克隆到克隆载体，构成重组载体；例如，所述载体为pUC19。

第四方面，本发明提供所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因的表达方法，包括如下步骤：

(1)将硫氧还蛋白还原酶氨基酸序列密码子优化得到编码基因，利用基因合成的方式得到编码基因，例如，通过线上软件进行氨基酸序列密码子优化；

(2)构建重组载体；

将PCR扩增的DNA序列和质粒载体用限制性内切酶进行双酶切，用DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到重组载体；所述载体可以为克隆载体或者表达载体；

(3)将重组载体转化到感受态细胞，培养筛选，测序验证；

(4)构建表达菌株或表达细胞，表达蛋白；

(5)重组蛋白纯化，利用Ni树脂纯化方式纯化。

根据本发明的表达方法，所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白编码基因由大肠杆菌表达或者由哺乳细胞表达，例如有大肠杆菌或者HEK293细胞表达。

在本发明一个实施方案中，所述表达方法包括将DNA片段和表达载体用限制性内切酶进行双酶切，用DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到重组表达载体，将其转化到表达菌株，筛选阳性转化子，将目标表达菌株体外诱导表达，例如表达菌株可选自大肠杆菌，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。

在本发明另一个实施方案中，所述表达方法包括将DNA片段和克隆载体用限制性内切酶进行双酶切，用DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到重组克隆载体，将重组克隆载体转化感受态细胞，经过菌P验证确定目标菌株，大量提取质粒，再瞬间转染到表达细胞，进行细胞培养，表达蛋白，例如表达细胞可选自HEK293细胞，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

第五方面，本发明提供所述硫氧还蛋白还原酶单克隆抗体和抗体对以及其免疫制备或筛选方法，其特征在于，由上述的硫氧还蛋白还原酶重组蛋白制备而成，

优选地，将哺乳表达的重组蛋白通过单抗免疫、细胞融合、腹水制备和单抗配对获得单克隆抗体对细胞株，

具体包括如下步骤：

(1)将硫氧还蛋白还原酶重组蛋白通过背部多点注射方式，通过弗氏完全佐剂或弗氏不全佐剂注射至实验鼠中，通过间接ELISA检测抗血清效价；

(2)细胞融合：免疫5-8只小鼠，选择效价高的两只小鼠脾脏进行细胞融合，换1/10、1/5、1/2、1HAT培养基进行培养，再换1/10、1/5、1/2、1HT培养基培养，用ELISA进行筛选；检测及克隆化：第1次亚克隆保证间接ELISA检测，OD>0.5-1.5为阳性，第2次亚克隆筛选，间接ELISA检测，OD>0.5-1.5为阳性，对阳性的单克隆进行扩大培养，准备足量细胞做腹水，然后冻存至液氮；

腹水制备和纯化：将上述阳性细胞扩大培养并注射至免疫缺陷的Balb/C小鼠裸鼠(Pristane、弗氏不完全佐剂致敏)的腹腔，一般1～2周可见小鼠腹部隆起即代表有腹水产生。当小鼠有明显腹水产生时及时抽取腹水；抗体纯化：将腹水经ProteinA/G纯化；

(3)单抗配对：对获得的多个单克隆抗体全部做生物素标记，做两两配对，给出标准曲线，同时验证多个阳性及阴性样品，得到配对抗体。

本发明还提供单克隆抗体对细胞株，其特征在于，所述细胞株含有所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因，优选地，所述细胞株通过哺乳表达的重组蛋白制备的，更优选地，该细胞株通过单抗免疫、细胞融合、腹水制备和单抗配对获得。第六方面，本发明还提供上述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白在硫氧还蛋白还原酶活性检测中的应用，例如作为参比蛋白或者标准品辅助用于通过酶动力学方法检测离体生物样本中硫氧还蛋白还原酶活性水平；本发明还提供上述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白和单克隆抗体和/抗体对在硫氧还蛋白还原酶含量检测中的应用，例如作为标准品和单克隆抗体对辅助用于通过双抗夹心学方法检测离体生物样本中硫氧还蛋白还原酶含量，所述生物样本可以是来自生物体的离体血液、唾液、尿液、脑脊液、组织液、体外细胞、组织匀浆等，所述生物体可以是人类或其他哺乳动物。第七方面，本发明还提供检测硫氧还蛋白还原酶的试剂盒，所述试剂盒含有上述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白和/或其抗体或抗体对。优选，用于硫氧还蛋白还原酶有关的疾病的诊断和/或治疗试剂盒。

此外，硫氧还蛋白还原酶单克隆抗体和/或抗体对在硫氧还蛋白还原酶活性和/或含量检测中的应用；优选通过酶动力学方法/双抗夹心方法检测离体生物样本中硫氧还蛋白还原酶活性和/或含量水平。

有益效果

本发明通过密码子优化和基因合成得到了两种可编码硫氧还蛋白还原酶编码基因，通过单抗免疫、细胞融合、腹水制备和单抗配对获得单克隆抗体对细胞株；并将该编码基因分别在大肠杆菌和哺乳细胞中成功表达，获得了体外表达的硫氧还蛋白还原酶；将哺乳表达的重组蛋白通过单抗免疫、细胞融合、腹水制备和单抗配对获得单克隆抗体对细胞株。本发明所合成的编码基因表达效率高，且表达得到的硫氧还蛋白还原酶序列完整，获得抗体可以和本发明获得的经过大肠杆菌和哺乳细胞中表达的蛋白特异性结合，方法简单，稳定性好，重组蛋白和单克隆抗体对组合形成的双抗夹心试剂检测盒，可广泛用于硫氧还蛋白还原酶有关的疾病诊断、治疗研究，，并形成独立特异性的检测体系。突破了现有硫氧还蛋白还原酶产品序列不完整的困境，也避免蛋白和抗体匹配度不高的风险。在前申请的《硫氧还蛋白还原酶重组蛋白及其编码基因》申请主要是针对硫氧还蛋白还原酶重组蛋白获得专利保护，本申请是在此重组蛋白基础并专门匹配其筛选抗体技术并使之成为一套完整的自身互相满足的可用于检测临床样本的封闭检测体系，具有重大意义。

附图说明

图1:为实施例1重组蛋白的表达测试结果(左：SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝；右：Western Blot，ECL显色)，其中MW.分子量标记，

图2为实施例1所表达的蛋白纯化后的测试结果，A为SDS-PAGE电泳验证纯化结果，B为样品最终QC，其中MW.分子量标记，IN.流入，FT.流出，W.洗涤，E.洗脱。

图3为实施例1表达的蛋白样品与TrxR1兔多抗孵育的Western blot验证结果。

图4为实施例1表达的蛋白样品与HRP标记的TrxR1抗体(Santa Cruz)孵育的Western blot验证结果。

图5为实施例2表达的蛋白样品纯化后的测试结果，用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE电泳图谱(左：定性分析，右：缓冲液交换后的最终样品QC，每泳道2μg)；其中MW.分子量标记，In.流入，FT，流出，W.洗涤，E1-E11.洗脱。

图6为实施例2表达的蛋白样品与TrxR1兔多抗孵育的Western blot验证结果。

图7为实施例2表达的蛋白样品与HRP标记的TrxR1抗体(Santa Cruz)孵育的Western blot验证结果。

图8为实施例3中硫氧还蛋白还原酶活性-吸光度标准曲线。

图9为物镜为20倍镜下实施例4中硫氧还蛋白还原酶单克隆抗体对(2#、4#)细胞株细胞培养图

图10为实施例4中硫氧还蛋白还原酶单克隆抗体对(2#、4#)腹水中单克隆抗体分子量还原型SDS-PAGE鉴定图

图11为实施例4中硫氧还蛋白还原酶单克隆抗体对(2#、4#)腹水纯化SDS-PAGE图

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。但本领域技术人员了解，本发明的保护范围不仅限于以下实施例。根据本发明公开的内容，本领域技术人员将认识到在不脱离本发明技术方案所给出的技术特征和范围的情况下，对以上所述实施例做出许多变化和修改都属于本发明的保护范围。

除特殊说明外，本发明实施例所用试剂均可市购获得。主要试剂和仪器来源如表1。

表1本发明实施例所涉及主要试剂和仪器

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实施例1

1.1 HEK293细胞表达TXNRD1

(1)基因序列的获得和优化

从UniProt网站得到TXNRD1的氨基酸序列，选取1-649AAs为表达目的片段，其中648U变为C，C端添加6*His标签，采用密码子优化后进行基因合成，得到编码基因序列SEQID NO.2。

(2)克隆载体的构建

PCR扩增步骤(1)得到的DNA片段，将载体pUC19和扩增的DNA片段用限制性内切酶EcoRI/NotI进行双酶切，DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到克隆载体TXNRD1-pUC19。

PCR体系如表2和表3所示。

表2.PCR反应体系

表3.PCR反应程序

(3)构建克隆菌株，并转化筛选

将克隆载体TXNRD1-pUC19转化至感受态细胞DH5а，培养筛选得到阳性转化子，经菌落PCR筛选并测序确定为目标菌株。

(4)细胞转染和蛋白表达验证

从目标菌株中提取质粒，30～40℃，pH7.5条件下转染到HEK293细胞，细胞培养，第6天收集1.5ml培养基和细胞。半纯化后，通过SDS-PAGE和WB验证培养基、细胞破碎上清(Native)和细胞破碎沉淀(Denative)，结果如图1所示。图1显示，目标蛋白在培养基、细胞破碎上清和细胞破碎沉淀中均有表达。

1.2纯化实验

合并剩余的TXNRD1培养基，并通过镍离子亲和树脂(His-tag)进行纯化：

-用pH 7.5的PBS缓冲液进行平衡

-用包括0mM，30mM，50mM咪唑，pH 7.5的PBS缓冲液顺序洗涤

-用包括200mM和400mM咪唑，pH 7.5的PBS缓冲液顺序洗脱

-用SDS-PAGE电泳验证洗涤洗脱各组分；

-最终样品QC：通过SDS-PAGE对其定性和定量

通过SDS-PAGE验证纯化结果，结果如图2的A所示。合并组分W3至E9并进行贮存缓冲液的交换和浓缩，最终的QC如图2的B所示。图2说明经过镍离子亲和树脂纯化，得到纯度达85％以上的硫氧还蛋白还原酶蛋白。

1.3蛋白Western blot验证

(1)设置两个样品孔，上样量分别为400ng和200ng。过夜孵育TrxR1兔多抗，二抗室温孵育一小时，进行WB实验，ECL发光，曝光结果如图3；结果显示70kDa位置处有目的条带，且上样量不同，条带灰度不同。

(2)上样量与(1)相同，过夜孵育HRP标记的TrxR1抗体(Santa Cruz)，进行WB实验，ECL发光，曝光结果如图4；结果显示70kDa之间有目的条带，且上样量不同，条带灰度深浅不同；Santa Cruz HRP标记TrxR1抗体可以与所得到的TXNRD1蛋白结合。通过哺乳细胞表达的氨基酸序列为SEQ ID NO.1蛋白接近人体内天然形成的硫氧还蛋白还原酶构型，可以较大程度保持生物活性。

实施例2

2.1 E.coli表达TXNRD1

(1)基因序列的获得和优化

从UniProt网站得到TXNRD1的氨基酸序列，选取150-649AAs为表达目的片段，其中648U变为C，C端添加6*His标签，采用密码子优化后进行基因合成，得到编码基因序列SEQID NO.4。

(2)重组载体的构建

PCR扩增步骤(1)得到的DNA片段，将DNA片段亚克隆到pET28b载体，酶切位点为NcoI/Xho I，得到重组表达载体TXNRD1-pET28b。PCR反应体系和反应程序如下表4、表5所示。

表4.PCR反应体系

表5.PCR反应程序

(3)转化筛选，构建表达菌株

将重组表达载体TXNRD1-pET28b转化至感受态细胞C41，培养筛选得到阳性转化子，经菌落PCR筛选并测序确定为目标菌株。

(4)表达菌株的培养和表达

目标菌株用LB培养基培养，16-20℃下IPTG 1mM诱导表达16h。

2.2纯化实验

离心收集菌体，裂解菌体，收集上清，通过镍离子亲和树脂(His-tag)进行纯化：

-用PBS pH7.5进行平衡和结合

-咪唑(方法同实施例1)洗涤和洗脱

-最终样品QC：通过SDS-PAGE定性，通过Bradford方法定量

纯化后，将目标样品与贮存缓冲液进行缓冲液交换(除去咪唑)。

结果如图5所示，图5说明镍离子亲和树脂纯化，得到纯度大于90％的硫氧还蛋白还原酶蛋白。

2.3蛋白Western blot验证

(1)设置两个样品孔，上样量分别为400ng和200ng。过夜孵育TrxR1兔多抗，二抗室温孵育一小时，进行WB实验，ECL发光，曝光结果如图6；55～70kDa之间有目的条带，且上样量不同，条带灰度不同。

(2)上样量与(1)相同，过夜孵育HRP标记的TrxR1抗体(Santa Cruz)，进行WB实验，ECL发光，曝光结果如图7；55～70kDa之间有目的条带，且上样量不同，条带灰度不同，SantaCruz HRP标记TrxR1抗体可以与大肠杆菌表达的TXNRD1蛋白结合。

实施例3重组蛋白用酶动力学法测定硫氧还蛋白还原酶活性的应用

采用实施例2所制备的重组蛋白辅助测定人血样本中的硫氧还蛋白还原酶活性，方法：酶动力学法。

(1)标准曲线的绘制：

取实施例2所制备的重组蛋白用Tris缓冲液(含1mM的EDTA，300mM的NaCl，pH7.4)配制成0、6、12、18、24(U/mL)等不同活性的溶液，加入20μLNADPH，DTNB底物100μL，405nm下持续测定吸光度的变化，得到标准曲线如图8所示。

(2)样本中硫氧还蛋白还原酶活性的检测

取临床受试者血浆样本15μL，185μL酶促反应体系(NADPH 20μL、DTNB底物100μL)，用同步骤(1)的测定方法，获得吸光度，参考标准曲线获得对应的硫氧还蛋白还原酶活性(TrxR活性)。将相同的血浆样本采用Biovision K763-100(100assays)硫氧还蛋白还原酶检测分析试剂盒进行活性检测。样本1-50检测结果如表6所示。

采用本发明实施例2所制备的硫氧还蛋白还原酶重组蛋白作为标准品制备标准曲线，通过酶动力学法检测样本TrxR活性所得检测结果与Biovision试剂盒检测结果对比，结果显示本发明制备的重组蛋白作为标准品的TrxR活性检测准确率可达90％以上。表明本发明制备的硫氧还蛋白还原酶重组蛋白可用于辅助酶动力学方法检测硫氧还蛋白还原酶活性水平，对于人体内异常增生程度的临床诊断和临床的疗效监测具有重要的作用。

表6样本中硫氧还蛋白还原酶活性检测结果

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实施例4

4.1动物免疫

(1)选用动物5-8周龄Balb/C小鼠8-10只，采用背部多点注射，第一次主注射使用弗氏完全佐剂，以后加强注射使用弗氏不完全佐剂，均与等体积哺乳重组蛋白充分混匀后注射。主注射50-200ug抗原/只实验鼠，加强注射50-100ug抗原/只实验鼠；

(2)免疫周期为：第1天主注射，第15天第一次加强注射，第30天第二次加强注射，第45天第三次加强注射，第52天试取血+ELISA检测，抗血清检测从小鼠尾静脉取少量血，制备抗血清。

(3)间接ELISA方法检测抗血清效价，如不满足，再次加强注射；

4.2细胞融合及亚克隆

(1)骨髓瘤细胞制备

融合前一周，复苏SP2/0细胞，正常培养至对数期。

(2)脾细胞制备

选定要融合的大鼠，融合当天用颈椎脱臼法处死，取脾，标准流程收集脾细胞并计数。

(3)细胞融合

按1:3-1：10的比例混合骨髓瘤细胞和脾细胞，标准流程进行细胞融合操作，随后用HAT DMEM完全培养基培养，融合后3-5天即可以看到杂交瘤细胞，第7-8天换1/10、1/5、1/2、1HAT完全培养基，第8-9天换1/10、1/5、1/2、1HT培养基。融合后10-12天左右开始进行筛选检测。

(4)细胞融合结果：融合后用HAT选择性培养基培养，显微镜下观察，看到多个生长的杂交瘤细胞，证明融合操作成功。

(5)融合筛选

吸取细胞上清100ul/孔进行间接ELISA检测。根据ELISA结果，判断阳性孔。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次复检，进一步确认阳性孔。

(6)亚克隆

对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆。(因为第一次亚克隆得到的阳性孔细胞株尚不稳定，有可能包含多个杂交瘤细胞，普遍认为第二次亚克隆后杂交瘤细胞为单个细胞株，并确定为阳性)。

第一次亚克隆有限稀释阳性孔中细胞，至多个孔中，加HT DMEM培养基培养，7-8天左右在显微镜下观察，间接ELISA检测有克隆生长的孔，取OD值高的孔为阳性孔；挑取阳性孔的细胞进行第二次亚克隆，检测出稳定阳性的杂交瘤细胞株，作为最终制备单抗的细胞，并扩大培养，培养于DMEM完全培养基中，置于37℃、95％相对饱和湿度、5％CO2的培养箱中培养；

4.3腹水制备及抗体纯化

(1)腹水制备

将上述阳性细胞扩大培养并注射至免疫缺陷的Balb/C小鼠裸鼠(Pristane、弗氏不完全佐剂致敏)的腹腔，一般1～2周可见小鼠腹部隆起即代表有腹水产生。当小鼠有明显腹水产生时及时抽取腹水。

(2)腹水纯化

纯化方法：ProteinA/G柱亲和纯化:腹水离心，吸出淡黄色液体计算体积。将ProteinA/G填料装入重力纯化柱内，用PBS洗涤三次，每次用10x柱体积的PBS。将腹水装入柱子内，4℃温和混匀2-4h。放出流穿液，备用。用PBS洗涤ProteinA/G填料三次，用预冷的pH3.0左右的HCL-Glycine洗脱液洗脱抗体，收集下的抗体立即用10xPBS中和液中和。检测抗体浓度，合并高浓度收集管。装洗脱下的浓度较高的抗体。对PBS透析，4℃透析过夜。用BCA蛋白定量试剂盒检测浓度，SDS-PAGE检测纯度，用间接ELISA测效价。

表7 2#细胞株的效价数据

表8 4#细胞株的效价数据

4.4单抗配对

对获得的多个单克隆抗体全部做生物素标记，做两两配对，给出标准曲线，同时验证多个阳性及阴性样品，得到配对抗体(2#、4#)。

表9 2#为包被抗体和4#为检测抗体的标准曲线数据

表10 2#为包被抗体和4#为检测抗体的阳性及阴性样品验证

以上实验表明，本发明通过大肠杆菌和哺乳细胞HEK293分别成功表达了两种TXNRD1，且均可与TrxR1抗体特异性结合，说明本发明表达的两种硫氧还蛋白还原酶序列完整。而且实施例3说明，所制备的重组蛋白可用于酶动力学法检测样本中的TrxR活性，将制备的重组蛋白通过免疫得到单克隆抗体对，使之形成双抗夹心体系，具有特异性强，能满足检测样本TrxR的含量，且自身匹配的封闭的检测系统，有广泛的应用前景。本发明从活性和含量两方面，对TrxR表达水平进行全方位的检测，能更精准的衡量TrxR在异常增生疾病中所起的作用，提高检测异常增生疾病的精密度和灵敏度，具有重大意义。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。