大肠杆菌zjut-mhol及其在产血红素加氧酶-1中的应用

(一)技术领域

本发明涉及血红素加氧酶-1的制备，特别涉及一种大肠杆菌zjut-mhol及其在血红素加氧酶-1中的应用。

(二)背景技术

血红素加氧酶(heme oxygenase，简称HO，EC 1.14.99.3)，是血红素分解的起始和限速酶，将血红素分解为胆绿素、铁离子(Fe

近些年来，关于HO-1的功能以及与疾病的关系逐渐被人们认识。首先，HO-1分解血红素，避免了血红素对细胞的损伤，催化过程中消耗了O

目前，国内外已有利用大肠杆菌表达藻类或鼠源HO-1的研究报道或专利申请，但仍存在HO-1的表达活性低，表达量不高的问题。为此，本发明以小鼠(Mus musculus)的HO-1基因核苷酸序列为模板，经过密码子优化后，在大肠杆菌中表达，并经过紫外线诱变和筛选，获得一株产酶活性显著提高的HO-1产酶菌株，该菌株可应用于发酵制备HO-1。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种产血红素加氧酶-1(HO-1)活性显著提高的大肠杆菌zjut-mhol及其在产血红素加氧酶-1中的应用，解决了目前HO-1只能从动物内脏提取的来源问题，为HO-1相关功能研究和作为临床药物研究提供了高活性的HO-1。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株高产HO-1的大肠杆菌(Escherichia coli)zjut-mho1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62484，保藏日期2022年5月18日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。

本发明所述大肠杆菌zjut-mho1菌株，按以下步骤获得：

(1)依据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)上提供的小鼠(Mus musculus)HO-1基因序列(序列见SEQ ID No.1)，经大肠杆菌偏好密码子优化(序列见SEQ ID No.2)，并在该序列的5′端引入限制性内切酶Nco I位点、3′端引入限制性内切酶Xho I位点，化学合成含Nco I/Xho I酶切位点的小鼠HO-1基因。

(2)上述合成的HO-1基因核苷酸序列和质粒载体pET-28a，分别经限制性内切酶Nco I和Xho I双酶切，酶切产物经过电泳割胶回收后，目标基因片段和开环的质粒载体pET-28a经T4 DNA酶连接后，热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子，提取质粒进行双酶切验证正确，获得重组质粒pET-28a-mho1(电泳图见图2)。

(3)将步骤(2)制备的pET-28a-mho1重组质粒，热激法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，筛选阳性转化子，获得基因重组菌命名为大肠杆菌mho1菌株。

(4)以大肠杆菌mho1菌株为出发菌株，用紫外线照射诱变，经过筛选，获得一株产HO-1活力较出发菌株提高25.9％的菌株，即大肠杆菌zjut-mho1菌株。

本发明还涉及所述大肠杆菌zjut-mho1在发酵产HO-1中的应用，所述的应用为：大肠杆菌zjut-mho1接种于含50μg/mL卡那霉素(Kan)的产酶培养基，于35–37℃、180–200r/min振荡培养至OD

进一步，所述大肠杆菌zjut-mho1发酵前，先经种子扩大培养制备种子液，种子液以体积分数3％–5％(优选3％)的接种量接种于含50μg/mL卡那霉素(Kan)的产酶培养基。

进一步，所述获得HO-1冻干粉的方法为：大肠杆菌zjut-mho1培养液经4℃、8000r/min离心5–10min，收集湿菌体后用pH 7.4、0.1mol/L的PBS缓冲液重悬，经超声波破碎菌体(优选冰浴，功率300W，超声2s，间隔4s，工作200次)，4℃、10000r/min离心5–10min后收集上清液，获得细胞裂解液；细胞裂解液经冷冻干燥，获得HO-1冻干粉；所述pH 7.4、0.1mol/LPBS缓冲液体积用量以菌体湿重计为5–12mL/g。

进一步，所述细胞裂解液冷冻干燥方法为：将细胞裂解液于洁净培养皿(优选直径9cm)中，放入-80℃冷冻结冰，再转入-40℃、真空度20Pa的冷冻干燥机中冷冻至完全干燥，得到HO-1冻干粉。

进一步，所述大肠杆菌zjut-mho1种子扩大培养方法为：按体积分数1％的接种量，移取20％甘油水溶液冻存的大肠杆菌zjut-mho1菌液，或接种环挑取大肠杆菌zjut-mho1斜面菌体2次，接种到含50μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃、180r/min摇床中培养10–12h至OD

进一步，优选所述的产酶培养基组成为：酵母浸出粉24g/L，蛋白胨12g/L，甘油4g/L，K

进一步，所述的大肠杆菌zjut-mho1发酵产HO-1的具体步骤包括：

(1)将低温保存的大肠杆菌zjut-mho1菌体接种于含50μg/mL Kan的LB斜面培养基，于37℃恒温培养24h，获得斜面菌体。所述的LB斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH 7.2–7.4，高压蒸汽121℃灭菌20min。

(2)挑取步骤(1)的斜面菌体2环或按体积分数1％的接种量移取20％甘油水溶液冻存的大肠杆菌zjut-mho1菌液，接种到含50μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃、180r/min摇床中培养10–12h，得OD

(3)按体积分数3％–5％的接种量，移取步骤(2)制备的种子液接种于含50μg/mLKan的产酶培养基中，于35–37℃、150–200r/min摇床中培养3–4h至OD

(4)步骤(3)的培养液经4℃、8000r/min离心5–10min收集菌体，每克湿菌体沉淀中加入5–12mL的pH 7.4、0.1mol/L PBS缓冲液重悬菌体。冰浴条件下超声波破碎细胞(功率300W，超声2s，间隔4s，工作200次)，4℃、10000r/min离心5–10min，收集上清液，获得细胞裂解液。

(5)将步骤(4)得到的细胞裂解液于一个直径9cm的无菌培养皿中，放入-80℃冷冻结冰，再转入-40℃、真空度20Pa的冷冻干燥机中冷冻至完全干燥，得到HO-1冻干粉。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明合成并克隆了小鼠来源的HO-1经偏好密码子优化的基因，构建了能够产HO-1的基因重组大肠杆菌，并经过紫外线诱变，获得一株酶活力高、传代稳定的突变株，可应用于HO-1的制备。该菌株经产酶培养，获得具有胞内活性HO-1的菌体，产酶活力按干菌体质量计为122U/g。从菌体分离获得HO-1冻干粉，冻干粉的酶活力为91.8U/g。

(四)附图说明

图1、HO-1参与血红素分解代谢的反应式。

图2、重组质粒pET-28a-mho1经Nco I/Xho I双酶切后的电泳图(M：Marker；1：酶切产物)。

图3、大肠杆菌zjut-mho1的菌体照片(a：大肠杆菌载有pET-28a的对照；b：大肠杆菌mho1)。

图4、大肠杆菌mho1菌株表达HO-1的SDS-PAGE电泳图(M：Marker；1：大肠杆菌载有pET-28a的对照；2：大肠杆菌mho1的细胞裂解液)。

图5、胆红素浓度—A

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

以下实施例中，如未说明具体的实验方法，均按照常规分子生物学实验方法操作，如魏群主编的《分子生物学实验指导》(第三版，科学出版社，2015)中所述的方法，或按照试剂盒的说明书方法操作。

本发明实施例用于培养重组大肠杆菌的LB斜面培养基、LB平板培养基、LB液体培养基和产酶培养基中，均在接种前加入终浓度为50μg/mL Kan，Kan以浓度为50mg/mL的水溶液的形式加入。

本发明所述的大肠杆菌培养液的OD

本发明实施例所用培养基组成如下：

LB斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH 7.2–7.4，高压蒸汽121℃灭菌20min。

LB液体培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.2-7.4。用100mL三角瓶装20mL的培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

产酶培养基组成为：酵母浸出粉24g/L，蛋白胨12g/L，甘油4g/L，K

实施例1、表达HO-1的基因重组大肠杆菌mho1菌株的构建

本发明所述的表达HO-1的重组大肠杆菌zjut-mho1菌株，按以下步骤构建：

(1)根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库提供的小鼠(Musmusculus)的HO-1序列(GenBank:NM_010442.2:133-1002，核苷酸序列见SEQ ID No.1所示)，经大肠杆菌偏好密码子优化(序列见SEQ ID No.2所示)，并在序列的5′端引入Nco I酶切位点CCATGG，3′端引入Xho I酶切位点CTCGAG，化学合成密码子优化后的HO-1基因序列。基因序列的化学合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

SEQ ID No.1：

ATGGAGCGTCCACAGCCCGACAGCATGCCCCAGGATTTGTCTGAGGCCTTGAAGGAGGCCACCAAGGAGGTACACATCCAAGCCGAGAATGCTGAGTTCATGAAGAACTTTCAGAAGGGTCAGGTGTCCAGAGAAGGCTTTAAGCTGGTGATGGCTTCCTTGTACCATATCTACACGGCCCTGGAAGAGGAGATAGAGCGCAACAAGCAGAACCCAGTCTATGCCCCACTCTACTTCCCTGAGGAGCTGCACCGAAGGGCTGCCCTGGAGCAGGACATGGCCTTCTGGTATGGGCCTCACTGGCAGGAAATCATCCCTTGCACGCCAGCCACACAGCACTATGTAAAGCGTCTCCACGAGGTGGGGCGCACTCACCCTGAGCTGCTGGTGGCCCACGCATATACCCGCTACCTGGGTGACCTCTCAGGGGGTCAGGTCCTGAAGAAGATTGCACAGAAGGCCATGGCCTTGCCCAGCTCTGGGGAGGGCCTGGCTTTTTTTACCTTCCCGAACATCGACAGCCCCACCAAGTTCAAACAGCTCTATCGTGCTCGAATGAACACTCTGGAGATGACACCTGAGGTCAAGCACAGGGTGACAGAAGAGGCTAAGACCGCCTTCCTGCTCAACATTGAGCTGTTTGAGGAGCTGCAGGTGATGCTGACAGAGGAACACAAAGACCAGAGTCCCTCACAGATGGCGTCACTTCGTCAGAGGCCTGCTAGCCTGGTGCAAGATACTGCCCCTGCAGAGACACCCCGAGGGAAACCCCAGATCAGCACTAGCTCATCCCAGACACCGCTCCTCCAGTGGGTCCTCACTCTCAGCTTCCTGTTGGCAACAGTGGCAGTGGGAATTTATGCCATGTAA

SEQ ID No.2：

ATGGAGCGTCCGCAGCCGGATTCTATGCCGCAGGATCTGTCTGAAGCACTGAAAGAGGCGACCAAGGAAGTTCACATTCAGGCAGAAAACGCTGAATTTATGAAAAACTTTCAGAAAGGTCAGGTTAGCCGTGAAGGTTTCAAGCTGGTGATGGCGTCTCTGTACCACATCTATACTGCGCTGGAAGAAGAAATCGAACGCAACAAACAGAACCCGGTTTACGCACCGCTGTACTTCCCGGAAGAACTGCATCGTCGTGCAGCGCTGGAACAGGATATGGCATTCTGGTACGGTCCGCACTGGCAGGAAATCATTCCGTGTACTCCGGCAACTCAGCACTACGTTAAACGTCTGCACGAAGTTGGTCGTACTCACCCGGAACTGCTGGTTGCACACGCGTACACCCGTTACCTGGGTGACCTGTCCGGTGGTCAGGTTCTGAAAAAAATTGCACAGAAAGCTATGGCACTGCCGTCTTCTGGTGAAGGTCTGGCTTTTTTCACTTTCCCGAACATTGATTCTCCGACCAAATTCAAACAGCTGTACCGTGCGCGCATGAACACTCTGGAAATGACCCCGGAAGTTAAACACCGTGTTACCGAGGAGGCAAAAACCGCTTTCCTGCTGAACATCGAACTGTTCGAAGAACTGCAGGTTATGCTGACCGAAGAGCACAAAGATCAGTCTCCGAGCCAGATGGCAAGCCTGCGCCAACGTCCGGCATCTCTGGTTCAGGATACTGCTCCGGCAGAAACCCCGCGTGGTAAACCGCAGATCTCTACCTCCTCTTCCCAGACCCCGCTGCTGCAGTGGGTTCTGACCCTGTCTTTCCTGCTGGCGACCGTAGCTGTCGGTATCTACGCAATGTAA.

(2)将步骤(1)所述的HO-1基因序列，以及表达质粒载体pET-28a，分别经限制性内切酶Nco I和Xho I双酶切，酶切产物经过电泳割胶回收后，用T4 DNA连接酶将目标基因片段和质粒载体进行连接，得到重组质粒。重组质粒热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子，提取重组质粒进行酶切鉴定，结果显示，序列大小(870bp)符合目标序列大小(电泳图见图2)。经测序验证显示插入序列正确，获得重组质粒pET-28a-mho1。

(3)将步骤(2)获得的重组质粒pET-28a-mho1热激法转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，筛选阳性转化子，得到含重组质粒pET-28a-mho1的HO-1基因重组大肠杆菌，命名为大肠杆菌mho1菌株。

(4)挑取大肠杆菌mho1单菌落接种于LB液体培养基中，37℃、180r/min培养4h(OD

(5)将45mL步骤(4)的培养液经4℃、8000r/min离心10min收集菌体(菌体照片见图3)，得湿菌体0.265g，用2mL的pH 7.4、0.1mol/L的PBS缓冲液重悬菌体，冰浴条件下超声波破碎细胞(功率300W，工作2s，间隔4s，工作200次)，经4℃、10000r/min离心10min，取上清液，得到澄清的细胞裂解液。

(6)将步骤(5)制备的细胞裂解液进行SDS-PAGE蛋白电泳分析(见图4)，结果显示，重组菌表达了分子量约为33kDa的蛋白，与HO-1分子量大小一致(32.9kDa)，说明能够表达HO-1的基因重组大肠杆菌构建成功。

所述的限制性内切酶Nco I和Xho I、T4 DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司。质粒pET-28a、大肠杆菌DH5α菌株和BL21(DE3)菌株、DNA凝胶回收试剂盒和质粒小量制备试剂盒等购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

实施例2、大肠杆菌mho1菌株表达HO-1

利用大肠杆菌mho1菌株，表达HO-1的培养方法可按如下步骤操作：

(1)将4℃保存的大肠杆菌mho1菌株斜面菌体，接种于含50μg/mL Kan的LB斜面培养基，于37℃恒温培养24h，获得新鲜斜面菌体。

(2)挑取步骤(1)的斜面菌体2环，接种到20mL含50μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃、180r/min摇床中培养12h，得OD

(3)按体积分数3％的接种量，移取步骤(2)制备的种子液1.5mL接种于50mL的LB液体培养基中，于37℃、180r/min摇床中培养3h(OD

(4)取45mL步骤(3)的培养液经4℃、8000r/min离心10min收集菌体，得湿菌体0.387g，用4.5mL的pH 7.4、0.1mol/L的PBS缓冲液重悬菌体，冰浴条件下超声波破碎细胞(功率300W，工作2s，间隔4s，工作200次)，经4℃、10000r/min离心10min，取上清液得到澄清的细胞裂解液，测定裂解液的HO-1活性，测得大肠杆菌mho1细胞裂解液的HO-1活力，按发酵液体积计为0.126U/mL，按干菌体质量计为96.9U/g。

所述的HO-1活力测定方法为：上述细胞裂解液200μL，0.5mmol/L的氯化血红素溶液50μL，0.1mol/L pH 7.4的PBS缓冲液449μL，10.0g/L的牛血清白蛋白水溶液40μL，40mmol/L的D-葡萄糖-6-磷酸二钠(G-6-P-Na

式中：C

HO-1活力的定义：于37℃、pH 7.4缓冲液体系中，在胆绿素还原酶过量存在的条件下，每分钟催化血红素生成1μg胆红素的酶量为一个活力单位(U)。

所述的0.5mmol/L氯化血红素溶液由DMSO溶解配制，4℃棕色瓶避光保存。0.1mol/L、pH 7.4的PBS缓冲液由0.1mol/L的NaH

所述的胆绿素还原酶粗酶液，用产胆绿素还原酶的大肠杆菌zjut-bvr菌株(GDMCCNO:61045)，按本实施例的步骤(1)–步骤(4)制备的细胞裂解液，具体制备方法参见中国发明专利“大肠杆菌zjut-bvr及其在制备胆绿素还原酶中的应用(ZL202010912807.8)”。

实施例3、诱变选育获得大肠杆菌zjut-mho1菌株

所述的大肠杆菌zjut-mho1按以下方法诱变筛选获得：

(1)菌体制备：20mL的LB液体培养基中，接入大肠杆菌mho1菌株斜面菌体2环，于37℃、180r/min振荡条件培养12h。取1mL菌液于离心管中，8000r/min离心5min，弃上清液，加入等量无菌生理盐水(0.85％NaCl水溶液)重悬菌体，再次8000r/min离心5min收集菌体，如此重复洗涤菌体1次后，用10mL无菌生理盐水重悬菌体于50mL三角瓶备用。

(2)诱变：取直径6cm无菌培养皿6副，分别加入上述菌悬液1mL。打开培养皿盖，于20W紫外灯下距离30cm处，分别照射0、30、45、60、75、90s。将各菌液用无菌生理盐水稀释至1×10

上述平板菌落计数结果表明：随着紫外线照射时间的延长，致死率逐渐增加，当照射75s时，致死率达到90％。一般认为致死率在90％～99.9％时，诱变效果较好(施巧琴,吴松刚.工业微生物育种学[M].北京:科学出版社,2013)，所以从紫外线照射时长75s和90s诱变后的平板中挑取突变株菌落。

(3)筛选：从紫外线照射诱变后的平板中挑取单菌落，转接LB斜面培养基，37℃培养24h后，再挑取菌体接种LB液体培养基，于37℃、180r/min摇床中培养3h，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG作为诱导剂，于25℃，180r/min的摇床中表达培养6h，按实施例2方法测定HO-1酶活力，从筛选的菌株中选取酶活提高相对较高的前10个突变菌株进行复筛(每个菌株做3个重复样)，复筛的10个菌株产HO-1的活力见表1。

表1经紫外线诱变的突变菌株复筛产酶活力(按干菌体质量计)

经过复筛后，编号为mho1-uv-32菌株的产酶活力提高幅度较大，较出发菌株提高了25.9％。用LB斜面培养基接种传代5次，mho1-uv-32产HO-1活力稳定。将该菌株重新命名为大肠杆菌zjut-mho1，提交广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号：GDMCC No:62484，保藏日期2022年5月18日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。

将大肠杆菌zjut-mho1在LB液体培养基中，37℃、180r/min培养12h后，培养液与40％无菌甘油水溶液等体积混合，保藏于-80℃冰箱。

实施例4、优选条件下大肠杆菌zjut-mho1产HO-1

在实施例3获得能产HO-1的大肠杆菌zjut-mho1菌株的基础上，对该菌株产HO-1的表达条件进行了优化。经过优化后，HO-1的表达量显著提高，优选的大肠杆菌zjut-mho1菌株产HO-1的培养方法步骤如下：

(1)移取0.2mL实施例3制备的大肠杆菌zjut-mho1甘油菌液，按体积分数1％的接种量接种到20mL的LB培养基中，37℃、200r/min摇床中培养10h，得到OD

(2)移取步骤(2)制备的2.5mL种子液，按体积分数5％的接种量接种至50mL产酶培养基中，37℃、200r/min摇床中培养4h后(OD

(3)取45mL步骤(2)的培养液经4℃、8000r/min离心10min收集菌体，得湿菌体0.933g，加5mL的pH 7.4、0.1mol/L的PBS缓冲液重悬菌体，冰浴条件下超声波破碎细胞(功率300W，工作2s，间隔4s，工作200次)，经4℃、10000r/min离心10min，取上清液，得到澄清的细胞裂解液，按实施例2方法测定裂解液的HO-1活性。

按本实施例方法，测得大肠杆菌mho1细胞裂解液的HO-1活力，按发酵液体积计为0.374U/mL，按干菌体质量计为121U/g。

实施例5、HO-1冻干粉的制备

按实施例4的方法，培养表达HO-1的大肠杆菌zjut-mho1菌体，按以下步骤制备HO-1冻干粉：

(1)按实施例4方法制备OD

(2)将步骤(1)制备得到的全部HO-1细胞裂解液于一个9cm的无菌培养皿中，放入-80℃冷冻结冰，再转放于-40℃、真空度20Pa的冷冻干燥机中冷冻干燥，得到366mg的HO-1粗酶液冻干粉。HO-1冻干粉的酶活力91.8U/g。