核酸构建物
文献发布时间:2024-07-23 01:35:12
技术领域
本发明涉及能够在裂殖酵母属酵母中表达多核苷酸的核酸构建物。
背景技术
裂殖酵母属酵母是微生物的模式生物之一,也研究了向蛋白质生产、化学品制造的应用。为了使用微生物进行蛋白质、化学品的制造,需要在微生物内使编码酶基因的多核苷酸表达,因此需要启动子。
所谓启动子,是控制被连接于下游的多核苷酸的表达的核酸序列,作为启动子的种类,有组成型表达或诱导型表达的启动子等。作为能够在裂殖酵母属酵母利用的启动子,已知CMV启动子(非专利文献1)、hsp9启动子、nmt1启动子(非专利文献2)等。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Giga-Hama Y et al.,Bio/Technology,12,400-404(1994)
非专利文献2:Suyama A et al.,J.Biosci.Bioeng,Vol.124,4,392-399(2017)
发明内容
发明要解决的课题
在利用微生物培养的蛋白质、化学品的制造方法中,作为培养方法使用分批发酵、补料分批发酵、连续培养,其中连续培养具有不易发生底物抑制、产物抑制,生产性高这样的特征。因此,在利用了基因重组微生物的酶、化学品的制造方法中,期待通过制成在连续培养中高表达的启动子的下游连接了作为重组基因的多核苷酸的核酸构建物,将导入了该核酸构建物的基因重组微生物进行连续培养,从而蛋白质、化学品的制造效率提高。然而,新发现了在重组的裂殖酵母属酵母的连续培养中,利用了公知的启动子的核酸构建物不充分发挥功能这样的课题。
因此,本发明的目的是提供包含在裂殖酵母属酵母的连续培养中高表达的启动子的核酸构建物、导入了该构建物的裂殖酵母属酵母、和表达该构建物内的目的多核苷酸的方法。
用于解决课题的手段
本发明者们全面地分析了裂殖酵母属酵母的基因表达,为了解决上述课题而进行了深入研究,结果发现,通过包含裂殖酵母属酵母来源的翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)基因启动子的核酸构建物能够解决所述课题,从而完成了本发明。
即,本发明由以下(1)~(12)构成。
(1)核酸构建物,包含裂殖酵母属酵母来源的翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因启动子和多核苷酸片段,在所述启动子的下游,以在所述启动子的控制下表达的方式人工地连接了所述多核苷酸片段。
(2)根据(1)所述的核酸构建物,所述裂殖酵母属酵母是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)、嗜冷裂殖酵母(Schizosaccharomyces cryophilus)或日本裂殖酵母(Schizosaccharomycesjaponicus)。
(3)根据(1)或(2)所述的核酸构建物,所述启动子包含TCTP基因的5’非翻译区,在该非翻译区的下游人工地连接了所述多核苷酸片段。
(4)根据(1)~(3)的任一项所述的核酸构建物,所述启动子是包含以下(a)或(b)的碱基序列的多核苷酸,
(a)由序列号1~4的任一项所记载的碱基序列组成的多核苷酸,
(b)由与序列号1~4的任一项所记载的碱基序列有85%以上的序列同一性的碱基序列组成的多核苷酸。
(5)根据(1)~(3)的任一项所述的核酸构建物,所述启动子是包含以下(c)或(d)的碱基序列的多核苷酸,
(c)由序列号5~8的任一项所记载的碱基序列组成的多核苷酸,
(d)由与序列号5~8的任一项所记载的碱基序列有85%以上的序列同一性的碱基序列组成的多核苷酸。
(6)根据(1)~(5)的任一项所述的核酸构建物,所述多核苷酸片段编码蛋白质。
(7)重组的裂殖酵母属酵母,包含(1)~(6)的任一项所述的核酸构建物。
(8)多核苷酸的表达方法,包括将(7)所述的重组的裂殖酵母属酵母进行连续培养的工序。
(9)根据(8)所述的多核苷酸的表达方法,所述连续培养包括将培养酵母而得的培养液用分离膜过滤,将包含所述酵母的未过滤液保持在或回流至所述培养液中,在所述培养液中补加发酵原料的工序。
(10)化学品的制造方法,包括将(7)所述的重组的裂殖酵母属酵母进行培养的工序。
(11)根据(10)所述的化学品的制造方法,所述培养是连续培养。
(12)根据(11)所述的化学品的制造方法,所述连续培养包括将培养酵母而得的培养液用分离膜过滤,将包含所述酵母的未过滤液保持在或回流至所述培养液中,在所述培养液中补加发酵原料的工序。
发明的效果
如果利用本发明的核酸构建物,则能够在裂殖酵母属酵母中使被连接于启动子的多核苷酸片段在连续培养时高表达。因此,本发明在利用裂殖酵母属酵母的蛋白质、化学品的制造中有用。
附图说明
图1显示具有TCTP启动子活性的碱基序列(序列号5~8)的多重比对的结果。
具体实施方式
本说明书中,只要未进行其他定义,则与本申请相关地被使用的科学术语和技术术语具有本领域技术人员一般理解的含义。
本说明书中,所谓裂殖酵母属酵母是指相当于分类学上的裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的酵母,可列举例如嗜冷裂殖酵母(Schizosaccharomycescryophilus)、日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)、Schizosaccharomyceskambucha、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)、嗜锇裂殖酵母(Schizosaccharomyces osmophilus)、易变裂殖酵母(Schizosaccharomycesversatilis)、Schizosaccharomyces malidevorans、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)。
本说明书中,碱基序列的“序列同一性”是指能够对比的2个以上的碱基序列彼此的一致的程度。即,某2个碱基序列的同一性越高,它们的序列的同一性或类似性越高。碱基序列的同一性的程度例如使用作为序列分析用工具的FASTA,使用默认参数确定。或者,可以使用Karlin和Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.90:5873-7(1993))来确定。这些分析方法的具体方法是公知的,参照National Center of BiotechnologyInformation(NCBI)的网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
1.核酸构建物
本发明作为其一实施方式,涉及包含裂殖酵母属酵母来源的翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因启动子和多核苷酸片段,在所述启动子的下游,以所述多核苷酸片在所述启动子的控制下表达的方式人工地连接了所述多核苷酸片段的核酸构建物。
所谓裂殖酵母属酵母来源的翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因启动子(以下也有时仅记载为“TCTP启动子”),只要是在该微生物的野生型中控制TCTP基因的表达的DNA序列就不特别限制。
作为裂殖酵母属酵母的TCTP基因,可列举粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)TCTP基因(NCBI Accession Number:NM_001019749)、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)TCTP基因(NCBI Accession Number:XM_013161615)、嗜冷裂殖酵母(Schizosaccharomyces cryophilus)(NCBI Accession Number:XM_013168673.1)、日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)(NCBI AccessionNumber:XM_002173941.2)等,在本发明中优选使用这些酵母来源的TCTP启动子。
基因的启动子碱基序列如本领域技术人员明白的那样,包括转录起始位点的上游(5’侧)和根据需要的下游(3’侧)。调查转录起始位点的方法不特别限定,但可以由mRNA的序列信息、各种数据库特定。例如,粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的TCTP基因的转录起始位点由从NCBI Reference Sequence:NM_001019749.2获得的TCTP基因的mRNA序列特定。
作为本发明中使用的TCTP启动子,在以裂殖酵母属酵母的TCTP基因的转录起始位点的碱基作为+1、以其下游(3’侧)作为+的值、以其上游(5’侧)作为0或-的值的情况下,可列举优选包含-1000~+200、更优选包含-500~+150、进一步优选包含-150~+150的转录起始位点的任意核酸区域。作为具体例,可列举序列号1~8所记载的碱基序列,优选列举序列号5~8所记载的碱基序列,更优选列举序列号5。
序列号1~4所记载的碱基序列分别为粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的基因组上的TCTP基因的-359~+41的核酸区域、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)的基因组上的TCTP基因的-194~+22的核酸区域、嗜冷裂殖酵母(Schizosaccharomyces cryophilus)的基因组上的TCTP基因的-333~+8的核酸区域、日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)的基因组上的TCTP基因的-242~+133的核酸区域。
序列号5~8所记载的碱基序列分别为粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的基因组上的TCTP基因的-64~+41的核酸区域、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)的基因组上的TCTP基因的-94~+22的核酸区域、嗜冷裂殖酵母(Schizosaccharomyces cryophilus)的基因组上的TCTP基因的-108~+8的核酸区域、日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)的基因组上的TCTP基因的-70~+133的核酸区域,图1显示利用Clustal W2(设定:默认)的序列号5~8所记载的碱基序列的多重比对结果。
TCTP启动子可以在具有启动子活性的范围内具有碱基序列的突变。作为碱基序列的突变,可列举取代、缺失、插入、添加等。这种情况下,具有突变的启动子的碱基序列与序列号1~8的任一项所记载的碱基序列具有优选85%以上、更优选90%、进一步优选95%以上的同一性。
本发明的核酸构建物以多核苷酸片段在TCTP启动子的控制下表达的方式被连接。所谓“在启动子的控制下表达”,是指被连接的多核苷酸片段的表达量、表达时期、表达方法、表达部位等的任一项以上在特定的启动子下被控制,不限于仅特定的启动子的控制。即,在本发明中,也可以由于TCTP启动子以外因素而多核苷酸片段的表达量等变化,例如,可以通过添加新的激活剂等来追加表达的控制方法。
在本发明中使用的多核苷酸片段只要是用于使其在TCTP启动子的控制下表达的就不特别限制,在其目的范围内为任意的2碱基以上的DNA序列即可。另外,多核苷酸片段既可以是编码蛋白质的碱基序列,也可以是表达像引起RNAi的双链RNA的前体、核酶那样不编码蛋白质地发挥功能的功能性核酸的碱基序列。
以在TCTP启动子的控制下表达的方式人工地连接多核苷酸片段的方法不特别限制,对于本领域技术人员是明确的。这里,本说明书中的所谓被“人工地连接”的状态,是指野生型TCTP基因以外的多核苷酸片段被连接到TCTP启动子的下游的状态。
本发明的核酸构建物不限于仅存在TCTP启动子和多核苷酸片段的DNA序列,也可以存在其他碱基序列。例如,可以在本发明的核酸构建物的3’末端添加用于使多肽片段的转录终止的终止子序列,也可以在本发明的核酸构建物的5’末端或3’末端添加限制性酶序列,还可以在本发明的核酸构建物中插入限制性酶序列,进而可以在质粒中整合本发明的核酸构建物。
能够添加在本发明的核酸构建物中的终止子序列不特别限制,可列举adh1终止子、sv40终止子、tef终止子、nmt1终止子、ura4终止子等。
整合本发明的核酸构建物的质粒不特别限制,可以使用PombeNet(https://dornsife.usc.edu/pombenet/vectors/)所记载的质粒。具体可列举pAUR224(タカラバイオ)、REP系列、pKS系列、pFA6a系列等。
本发明的核酸构建物的获取方法不特别限制,可以通过通常的化学合成法或基因工程学的方法得到。例如,可以以在NCBI等登记的碱基序列的信息等为基础,通过人工合成在TCTP启动子的下游连接了多核苷酸片段的DNA,从而获取。DNA的人工合成可以利用例如,ジーンウィズ社等的服务。或者,可以从粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等微生物按照例如Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION(JosephSambrook,David W.Russell,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)记载的方法克隆启动子序列,将目的的多核苷酸片段通过例如限制性酶法、同源重组法连接。作为同源重组法,例如,可以使用由タカラバイオ株式会社发售的“In Fusion”等来进行。
2.重组裂殖酵母属酵母
作为本发明的一实施方式,提供包含所述核酸构建物的重组裂殖酵母属酵母、和使用该重组酵母使核酸构建物所包含的位于TCTP启动子的下游的多核苷酸表达的方法。
作为将核酸构建物导入裂殖酵母属酵母的方法不特别限定。可列举例如,在酵母的重组中经常被利用的乙酸锂法、电穿孔法等。对于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe),可以通过Yeast,22:799-804(2005)的方法有效地获取转化体。对于日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus),在Cold Spring Harb.Protoc.,996:998(2017)中记载了转化方法。
作为将核酸构建物导入裂殖酵母属酵母的一实施方式,有将核酸构建物导入到裂殖酵母属酵母的基因组上的方法。作为将核酸构建物导入到基因组上的方法,可以将使具有与想要导入的基因组DNA的基因座同源的碱基序列的DNA片段与选择标志物盒和本发明的核酸构建物连接而成的DNA片段导入酵母。此时可以利用Cre/LoxP系统、CRISPR-Cas9等基因组编辑技术。在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的基因组DNA上导入目的DNA的方法可以通过BMC Biotechnol.,16:76(2016)的方法来进行。
作为将核酸构建物导入裂殖酵母属酵母的一实施方式,有将包含核酸构建物的载体导入裂殖酵母属酵母的方法。包含核酸构建物的载体的获取方法不特别限制,对于本领域技术人员是明确的。例如,可以与前述的核酸构建物同样地通过人工合成获取。另外,可以通过限制性酶法、同源重组法与在裂殖酵母属酵母中发挥功能的载体连接。
作为在裂殖酵母属酵母中发挥功能的载体,只要是在宿主细胞内被稳定地保持、在微生物内被复制的载体就不特别限定。可列举例如,pAUR224(タカラバイオ株式会社)、pTIN(RNA,26(11):1743-1752(2020))、pDUAL系列(Yeast,Nov;21(15):1289-305(2004))等。
3.多核苷酸的表达方法
本发明的核酸构建物中所包含的TCTP启动子适合在裂殖酵母属酵母的连续培养中发挥功能,因而通过将导入了核酸构建物的重组酵母连续培养(continuous culture),从而能够使连接在TCTP启动子的下游的多核苷酸片段在重组酵母内适合地表达。本说明书中的所谓连续培养,是指在适当的时期进行流加液的供应和培养液的抽出的培养方法,流加液的添加时期、组成、速度、方法等不特别限定。流加液供应和抽出的开始时期未必相同。另外,流加液的供应和抽出既可以是连续的,也可以是间歇的。作为连续培养的例子,存在恒化、利用分离膜的连续培养方法等。优选为利用了分离膜的连续培养。
利用了分离膜的连续培养,是在培养微生物而制造化学品的方法中,培养微生物,将包含微生物的培养液用分离膜过滤,由滤液回收产物,同时将过滤而得的微生物保持在培养液中,将培养液中的微生物的浓度维持得较高,从而能够长时间将产物的收率、生产性维持得较高的培养方法。
在利用了分离膜的连续培养中,发酵原料的供应和培养液的过滤一开始,则被供应的发酵原料被微生物代谢,过一会儿就形成微生物以一定的速度增殖的常规状态。是否为常规状态的确认,可以分析过滤液中所含的产物、发酵原料的浓度等,确认产物的生产速度、未利用的发酵原料的浓度等变为一定。
回收包含培养的重组酵母的未过滤液的时间点只要在进行期间、即开始发酵原料的供应和培养液的过滤之后即可,优选回收常规状态的未过滤液。例如,作为常规状态,在被供应的发酵原料中包含的糖浓度为100~200g/L的条件下,优选回收过滤液中的糖浓度保持优选5g/L以下、更优选2g/L以下、进一步优选0.3g/L以下的连续培养中的未过滤液。这里,所谓本发明中的糖浓度,是指作为在培养中使用的酵母能够同化的碳源的糖的合计值的浓度。例如,在包含葡萄糖、果糖作为碳源的情况下,是将它们合计而得的值的浓度。另外,在蔗糖等多糖的情况下,换算成被分解成单糖时的重量而计算出糖浓度。
利用了分离膜的连续培养按照本领域技术人员周知的方法即可,例如,可以按照国际公开第2007/097260号或国际公开第2010/038613号记载的连续培养方法实施。
实施例
以下,列举实施例具体地说明本发明。
(参考例1)糖类的分析
糖类浓度在下述所示的HPLC条件下通过与标准品的比较来定量。
柱:“Shodex SH1011”(昭和电工株式会社)
移动相:5mM硫酸(流速0.6mL/分钟)
反应液:无
检测方法:RI(差示折射率)
温度:65℃。
(参考例2)利用了分离膜的连续培养
作为酵母使用粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)972h-,通过利用了分离膜的连续培养进行培养。发酵原料使用将从Kaset phol Co.,Ltd.购买的甘蔗糖蜜用水稀释,并调整了糖浓度而得的原料。具体地,将甘蔗糖蜜的原液与水混合,分取出一部分。将分取出的原料所包含的糖浓度通过参考例1的方法进行了分析。测定分取后残留的发酵原料的比重和重量,求出了体积。根据通过糖分析的结果和计算求出的发酵原料的体积计算出糖的总重量。通过在其中添加水来调整糖浓度,用高压釜进行灭菌处理之后,作为发酵原料在以下的实验中使用。将制备发酵原料之后的糖浓度的分析结果示于表1。
将酵母在10mL的YPD培养基(100g/L葡萄糖(ナカライテスク株式会社)、10g/L干燥酵母粉末(ナカライテスク株式会社)、20g/L“Bacto Peptone”(Becton DickinsonCompany,Ltd))中振荡培养一晚(前预培养)。将前预培养液接菌到新鲜的YPD培养基100mL中,用500mL带档板的烧瓶振荡培养24小时(预培养)。将预培养液添加到包含15mL上述发酵原料的发酵反应槽中,开始主培养。在主培养开始后24小时的时间点开始连续培养,并同时回收未过滤的培养液供RNA提取用。将此时的RNA样品作为分批阶段用于表达分析。开始连续培养后,通过参考例1的方法分析过滤液中的糖浓度,确认了葡萄糖、果糖、蔗糖分别保持为0g/L,回收了RNA提取用的未过滤液。将此时的RNA样品作为连续培养阶段用于表达分析。下述显示利用了分离膜的连续培养的运行条件。
[利用了分离膜的连续培养条件]
发酵反应槽容量:2L
使用分离膜:聚1,1-二氟乙烯制过滤膜
分离膜元件有效过滤面积:218cm
温度调整:30℃
发酵反应槽通气量:无通气
发酵反应槽搅拌速度:300rpm
通量设定值:0.18(m
错流过滤流速100(cm/秒)
灭菌:包含分离膜元件的发酵槽通过121℃、20分钟高压釜进行高压蒸气灭菌
平均细孔径:0.1μm
平均细孔径的标准偏差:0.035μm
膜表面粗糙度:0.06μm
纯水透过系数:50×10
(参考例3)恒化培养
作为酵母使用粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)972h-,进行恒化培养。发酵原料使用将从Mitrphol Co.,Ltd.购买的甘蔗糖蜜用水稀释,并调整了糖浓度而得的原料。具体地,将甘蔗糖蜜的原液与水混合,分取出一部分。将分取出的原料所包含的糖浓度通过参考例1的方法进行了分析。测定分取后残留的发酵原料的比重和重量,求出了体积。根据通过糖分析的结果和计算求出的发酵原料的体积计算出糖的总重量。通过在其中添加水来调整糖浓度,用高压釜进行灭菌处理之后,作为发酵原料在以下的实验中使用。将制备发酵原料之后的糖浓度的分析结果示于表1。
将酵母在10mL的YPD培养基(100g/L葡萄糖(ナカライテスク株式会社)、10g/L干燥酵母粉末(ナカライテスク株式会社)、20g/L“Bacto Peptone”(Becton DickinsonCompany,Ltd))中振荡培养一晚(前预培养)。将前预培养液接菌到新鲜的YPD培养基100mL中,用500mL带档板的烧瓶振荡培养24小时(预培养)。将预培养液添加到包含15mL上述发酵原料的发酵反应槽中,开始主培养。在主培养开始后24小时的时间点开始连续培养,并同时回收RNA提取用的培养液。将此时的RNA样品作为分批阶段用于表达分析。开始连续培养后,通过参考例1的方法分析发酵液中的糖浓度,确认了葡萄糖、果糖、蔗糖分别保持为0g/L,回收了RNA提取用的培养液。将此时的RNA样品作为连续培养阶段用于表达分析。下述显示恒化培养的运行条件。
[恒化培养]
发酵反应槽容量:2L
温度调整:30℃
发酵反应槽通气量:无通气
发酵反应槽搅拌速度:300rpm
灭菌:包含原料罐和抽出管线的发酵槽通过121℃、20分钟高压釜进行高压蒸气灭菌。
表1
(实施例1)启动子的鉴定
(1)总RNA提取
将为了RNA提取而回收的培养液5ml分取到15ml离心管中,进行离心分离(8000×g,5分钟,4℃),回收菌体。将回收的菌体用灭菌Milli-Q水进行了洗涤。RNA提取以Schmitt等的方法(Nucl.Acids.Res.,18:3091-3092(1990))为基础进行。回收的RNA最终溶解于20~50μl的“UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water”(Thermo FisherScientific,Inc.)中。
(2)全面的表达量分析
全面的表达量分析利用了通过タカラバイオ株式会社的HiSeq系统(イルミナ社)进行的RNA-seq委托服务(https://catalog.takara-bio.co.jp/jutaku/basic_info.php?unitid=U100006557sha-puanchor03)。其中,分析方式为2017年时间点的方法。通过将(1)中获得的总RNA进行全面的表达量分析,从而测定酵母内的多核苷酸的表达量。其结果作为各多核苷酸的序列数据、各多核苷酸的注释结果和FPKM(fragments per kilobase ofexon per million reads mapped)值获取了多核苷酸的表达量数据。
(3)高表达启动子序列的鉴定
以(2)中得到的表达量数据和注释数据为基础,比较了分批发酵阶段与连续培养阶段中的各多核苷酸的表达量,特定了在连续培养中表达量高的多核苷酸。由多核苷酸的注释信息探索上游的基因组DNA序列,鉴定启动子序列。
其结果发现,TCTP基因的表达量在连续培养阶段高表达,获取了序列号1所记载的序列作为启动子序列。表2中记载TCTP的FPKM值、和作为参考的在已知的启动子内、在化学品生产的研究(J.Biosci.Bioeng.,124(4):392-399(2017))中被利用的启动子的基因(nmt1、hsp9)的FPKM值。
表2
(实施例2)重组酵母的制成
(1)质粒载体的获取
设计在pAUR224(タカラバイオ株式会社)的Nco1和Xho1位点导入了序列号1所记载的TCTP启动子(以后也表述为TCTP1)、在Sac1和Sal1位点导入了荧光蛋白mRuby(FPbaseID:6KLAW)的基因的质粒,通过ジーンウィズ基因合成服务获取pAURTCTP1-mRuby。
(2)转化体的获取
将Yeast,22:799-804(2005)所记载的方法部分改变,在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)972h-中导入(1)所获取的pAURTCTP1-mRuby。具体地,将上述论文的方法中的热休克后的菌体以8000rpm离心5分钟,除去上清后,加入YEL培养基(5g/L干燥酵母粉末(ナカライテスク株式会社)、30g/L葡萄糖(ナカライテスク株式会社))1mL,在30℃静置6小时。将静置后的菌体接菌到YEA选择培养基(在YEL培养基中添加20g/L纯化琼脂粉末(ナカライテスク株式会社)、0.5μg/mL金担子素A(タカラバイオ株式会社))中,在30℃培养4天。将形成的集落用荧光扫描成像仪(“PRINTGRAPH2M”(ATTO株式会社)LED:Cyan、曝光429ms、滤光片:595nm)拍摄,挑菌发光的集落,作为重组酵母pAURTCTP1-mRuby株而获取。
(实施例3)启动子活性的评价
(1)重组酵母的连续培养
使用重组酵母pAURTCTP1-mRuby株,通过利用了分离膜的连续培养进行培养。发酵原料使用5倍浓度的YEL选择培养基(25g/L干燥酵母粉末(ナカライテスク株式会社)、90g/L葡萄糖(ナカライテスク株式会社)、0.5μg/mL金担子素A(タカラバイオ株式会社))。将重组酵母在10mL的YEL选择培养基(5g/L干燥酵母粉末(ナカライテスク株式会社)、30g/L葡萄糖(ナカライテスク株式会社)、0.5μg/mL金担子素A(タカラバイオ株式会社))振荡培养一晚(前预培养)。将前预培养液接菌到新鲜的YEL选择培养基100mL中,用500mL带档板的烧瓶振荡培养24小时(预培养)。将预培养液添加到包含15mL上述发酵原料的发酵反应槽中,开始主培养。在主培养开始后24小时的时间点开始连续培养。此时,回收活性评价用的培养液。开始连续培养之后,通过参考例1的方法分析过滤液中的糖浓度,确认了葡萄糖保持为0g/L,回收了活性评价用的未过滤液。下述显示利用了分离膜的连续培养的运行条件。
[利用了分离膜的连续培养条件]
发酵反应槽容量:2L
使用分离膜:聚1,1-二氟乙烯制过滤膜
膜分离元件有效过滤面积:218cm
温度调整:30℃
发酵中的pH控制:4.0
发酵反应槽通气量:无通气
发酵反应槽搅拌速度:300rpm
通量设定值:0.18(m
错流过滤流速50(cm/秒)
灭菌:包含分离膜元件的发酵槽通过121℃、20分钟高压釜进行了高压蒸气灭菌
平均细孔径:0.1μm
平均细孔径的标准偏差:0.035μm
膜表面粗糙度:0.06μm
纯水透过系数:50×10
(2)启动子活性的评价
通过“CountStar”(Aber社、测定方法:standard)测定了(1)中所回收的菌体的活菌数(细胞/mL)。另外,将菌体适宜稀释,通过多功能酶标仪(“SynergyHT-I”(BioTekInstruments))在Ex:530nm、Em:590nm的条件下测定了荧光强度。通过将所得的荧光强度除以活菌数,从而计算出相对于活菌数的荧光强度(计数/细胞/mL),测定启动子活性。结果归纳于表3。
(比较例1)CMV启动子重组酵母的制成
(1)质粒载体的获取
由实施例1中制成的质粒使用限制性酶Sac1(New England Biolabs,Inc.)和Sal1(New England Biolabs,Inc.)取出mRuby基因,使用“Ligation-Convenience Kit”(株式会社ニッポン·ジーン)导入到pAUR224(タカラバイオ株式会社)的Sac1和Sal1位点,获取pAUR224-mRuby。
(2)转化体的获取
通过与实施例2的(2)同样的方法,将(1)中获取的pAUR224-mRuby转化到粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)972h-中,获取重组酵母pAUR224-mRuby株。
(比较例2)CMV启动子的活性评价
对于比较例1中获取的重组酵母pAUR224-mRuby株,通过与实施例3(1)、(2)同样的方法获取培养菌体,评价了启动子活性。结果归纳于表3。
表3
(实施例4)重组酵母的制成
(1)质粒载体的获取
通过ジーンウィズ社的基因合成服务获取了:在pAUR224(タカラバイオ株式会社)的Nco1与Xho1识别位点之间插入了TCTP1启动子、或序列号5所记载的TCTP启动子(以后也表述为TCTP2)、在其下游连接了荧光蛋白mScarlet(FPbase ID:FVS3D)的基因的pAURTCTP1-mScarlet和pAURTCTP2-mScarlet。
(2)转化体的获取
使用与实施例2(2)所记载的方法同样的方法,在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)972h-中导入(1)中所获取的pAURTCTP1-mScarlet、或pAURTCTP2-mScarlet,获取重组酵母pAURTCTP1-mScarlet株和pAURTCTP2-mScarlet株。
(实施例5)启动子活性的评价
(1)重组酵母的连续培养
使用重组酵母pAURTCTP1-mScarlet株和pAURTCTP2-mScarlet,通过与实施例3(1)同样的步骤进行利用了分离膜的连续培养,回收了活性测定用的菌体。
(2)启动子活性的评价
用CountStar(Aber社、测定方法:standard)测定了(1)中所回收的菌体的活菌数(细胞/mL)。另外,将菌体适宜稀释,用多功能酶标仪(“SynergyHTX”(BioTek Instruments社))在Ex:540nm、Em:620nm的条件下测定荧光强度。通过将所得的荧光强度除以活菌数,从而计算出相对于活菌数的荧光强度(计数/细胞/mL),测定了启动子活性。结果归纳于表4。
(比较例3)CMV启动子重组酵母的制成
(1)质粒载体的获取
以能够在pAUR224(タカラバイオ株式会社)的Xho1位点通过“In Fusion”(タカラバイオ社制)导入mScarlet基因的方式,按照该试剂盒的说明书所记载的方法设计引物,以实施例4(1)中制成的质粒作为模板通过PCR扩增mScarlet基因。然后,在pAUR224(タカラバイオ株式会社)的Xho1位点通过“In Fusion”(タカラバイオ社制)导入扩增基因,获取了pAUR224-mScarlet。
(2)转化体的获取
通过与实施例2(2)同样的方法,在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)972h-中导入(1)中所获取的pAUR224-mScarlet,获取了重组酵母pAUR224-mScarlet株。
(比较例4)CMV启动子的活性评价
对于比较例1中获取的重组酵母pAUR224-mScarlet株,通过与实施例5(1)、(2)同样的方法获取培养菌体,评价了启动子活性。结果归纳于表4。
表4
(总结)
由实施例1、3、5确认了,TCTP启动子是在裂殖酵母属酵母中连续培养时高表达的启动子。另外,由实施例5和比较例4确认了,作为启动子的功能只要包含序列号5所记载的碱基序列即可,TCTP启动子与CMV启动子相比表达量更高。由以上评价,通过利用在TCTP启动子的下游连接了目的多核苷酸的核酸构建物,能够在连续培养时高表达目的多核苷酸。
- 包含来自基因型1b的丙型肝炎病毒基因组的核酸的核酸构建物、和导入有该核酸构建物的丙型肝炎病毒基因组复制细胞、以及感染性丙型肝炎病毒颗粒的制备方法
- 含人丙型肝炎病毒全长基因组的核酸构建物、核酸构建物转入其中的重组全长病毒基因组复制型细胞和生产丙型肝炎病毒颗粒的方法