可活化IL2组合物和使用方法

技术领域

本发明总的来说涉及降低在正常组织中的药物效应并增强肿瘤靶向的可活化白介素-2(IL2)构建物的领域。

关于联邦资助的研究的陈述

不适用。

光盘上提交的材料的参考并入

本申请包括以ASCII格式通过EFS-Web提交并整体通过参考并入本文的序列表。所述创建的ASCII副本被命名为AEBI2002WO_SL，大小为140,265个字节。

背景技术

本发明的背景结合白介素-2(IL2)来描述，但这不限制本发明的范围。

一份此类专利是题为“白介素-2/白介素-2受体α融合蛋白及其使用方法”(Interleukin-2/Interleukin-2Receptor Alpha Fusion Proteins And Methods OfUse)的国际公开WO 2016/022671Al，据说其教导了在低剂量基于IL-2的疗法中提高了调节性T细胞(Tregs)的活性和/或提高了免疫耐受，在较高剂量疗法中提高免疫应答和记忆，与重组IL2相比通过IL2与表达IL2R的细胞之间的竞争性相互作用提高了IL2可利用度，和/或在体内提高了带有IL2R的淋巴细胞的持久性IL2刺激。

另一份此类专利是题为“蛋白酶活化的细胞因子”(Protease activatedcytokines)的8,734,774B2号美国专利，其使用小鼠IL2/PSAcs/连接物/IL2Rα融合蛋白和人类IL2/PSAcs/连接物/scFv(抗人类IL2)来降低毒性，用于潜在的癌症疗法。

其他专利申请包括题为“新型白介素2及其用途”(Novel Interleukin 2And UseThereof)的国际公开WO 2020/057646Al和WO2020/057645(CN2018101108649A)，其教导了IL2突变蛋白具有降低的IL-2a受体结合能力和/或提高的IL2Rβ受体结合能力。所述融合蛋白含有IL2突变蛋白、免疫偶联物和Fc肽。这些申请还教导了一种将IL2突变蛋白携带到肿瘤部位的免疫偶联物，Fc肽提高IL2突变蛋白的稳定性，并且IL2突变蛋白中的突变消除了蛋白质糖基化，并随后降低了它与IL2Ra的结合。

最后，Charych等人在题为“NKTR-214，一种在小鼠肿瘤模型中具有偏倚的IL2受体结合、提高的肿瘤暴露和显著功效的工程化改造的细胞因子”(NKTR-214,an EngineeredCytokine with Biased IL2Receptor Binding,Increased Tumor Exposure,and MarkedEfficacy in Mouse Tumor Models)Clin Cancer Res.2016Feb 1；22(3):680-90.doi:10.1158/1078-0432.CCR-15-1631的文章中教导了IL2受体β相对于受体α的偏好性激活，其使用PEG分子的位置来实现这种偏好性激活。

需要新的融合蛋白，其通过消除正常组织的靶向和增强在肿瘤靶部位处的活性克服了现有技术中的问题，同时也确保了生物药物的有利性质例如增加的半衰期和易于配制和可制造性。

发明内容

在另一个实施方式中，本发明包括一种可活化白介素-2(aIL-2)融合蛋白，其包含：白介素-2(IL-2)野生型或IL-2突变蛋白；连接到所述IL-2的第一可切割连接物；连接到所述第一可切割连接物的白介素-2受体结合区(IL-2α或IL-2β受体，可以分别与IL-2RA或RB互换)；和连接到所述IL-2或IL-2受体的半衰期延长物，其中所述可切割连接物的切割从所述IL-2受体释放出IL-2。在一种情况下，所述半衰期延长物是抗体Fc区，其选自野生型Fc区、突变的Fc区、单体野生型Fc区、单体突变Fc区、二聚体野生型Fc区或二聚体突变Fc区。在另一种情况下，所述可切割连接物被肿瘤相关蛋白酶切割。在另一种情况下，所述可切割连接物被选自基质金属蛋白酶-1(MMP1)、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、uPA、FAPa或组织蛋白酶B的蛋白酶切割。在另一种情况下，所述可切割连接物被选自半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶11和半胱天冬酶12的半胱天冬酶切割。在另一种情况下，所述可切割连接物被基质金属蛋白酶14切割。在另一种情况下，所述IL-2包含消除或降低与IL2RA或IL2RB的结合亲和性的一个或多个突变。在另一种情况下，所述IL-2包含选自下述的一个或多个突变：F42A、K、R、E或Q；Y45A、K、R、E、Q、F、W或H；L72A、G、K、R、E或Q；R81A、H、K、D、E、N或Q；L85A、I、G、K、R、E、Q、T或S；I86A、I、G、K、R、E、Q、T或S。在另一种情况下，所述IL-2被突变以提高与IL2RB的结合亲和性。在另一种情况下，所述融合蛋白是同二聚体。在另一种情况下，所述融合蛋白是异二聚体。在另一种情况下，所述融合蛋白还包含靶结合多肽，其中所述靶选自HER1、HER2、HER3、GD2、癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体活性突变体(EGFRVIII)、CD133、成纤维细胞活化蛋白Α(FAP)、上皮细胞黏附分子(Epcam)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、EPH受体A4(EphA)、酪氨酸蛋白激酶Met(cMET)、IL-13Ra2、微粒体环氧化物水解酶(mEH)、MAGE、间皮素、MUC16、MUC1、前列腺干细胞抗原(PSCA)、肾母细胞瘤-1(WT-1)、密蛋白家族蛋白，选自CTLA-4、PD-1、Lag3、S15、B7H3、B7H4、TCR-α、TCR-β、TIM-3、CD3、41BB或OX40的T-细胞标志物，和/或选自PD-L1、CD40、CD24、B7H3、TGF-β受体、TNFR家族成员1至20、CD80、CD86、FLT3、CD11c、CD8-α、5B6(CLEC9A)、CD1c、CD11b、CD13、CD33、HLA-DR、CD141、CD1a、CD32、CD45、CD80、CD86、CD207、CD2、CD7、CD45RA、CD68、CD123、CD303、CD304的抗原呈递细胞标志物。在另一种情况下，所述融合蛋白与IL-2相比降低aIL-2的体内毒性。在另一种情况下，所述融合蛋白依次包含所述IL-2、第一可切割连接物、IL-2受体和突变的抗体Fc区；所述融合蛋白依次包含IL-2受体、第一可切割连接物、IL-2和抗体Fc区；所述融合蛋白依次包含IL-2或IL-2受体、第一可切割连接物、IL-2或IL-2受体、第二可切割连接物和抗体Fc区；所述融合蛋白依次包含抗体Fc区、第一可切割连接物、IL-2受体、第二可切割连接物和IL-2；或者所述融合蛋白依次包含抗体Fc区、IL-2受体、第一可切割连接物和IL-2。在另一种情况下，所述可切割连接物是蛋白酶可切割连接物。在另一种情况下，所述可切割连接物被在凋亡或炎症相关应答期间上调的蛋白酶切割。在另一种情况下，所述aIL-2具有选自SEQ ID NOS：1至10的野生型或突变体IL-2。在另一种情况下，所述融合蛋白包含：(a)IL-2，其是SEQ ID NOS：1-10；(b)所述IL-2Rα(SEQ ID NO：20)或所述IL-2Rβ(SEQ ID NO：21)；(c)所述可切割连接物，其选自SEQ ID NOS：11-13；(d)人类IgG1-Fc，其是SEQ ID NOS：14-19；和任选的靶结合多肽。在另一种情况下，所述aIL-2与IL-2相比在心、肺、肾或中枢神经系统中具有降低的毒性。在另一种情况下，所述白介素-2(IL-2)、所述第一可切割连接物、所述白介素-2受体结合区(IL-2α或β受体)或所述抗体Fc区中的至少一者是人类序列。

在另一个实施方式中，本发明包括一种药物组合物，其包含可活化白介素-2(aIL-2)融合蛋白和载体，所述融合蛋白包含：白介素-2(IL-2)野生型或突变蛋白；连接到所述IL-2的第一可切割连接物；连接到所述第一可切割连接物的白介素-2受体结合区(IL-2α或IL-2β受体)；和连接到所述IL-2或IL-2受体的半衰期延长物，其中所述可切割连接物的切割从所述IL-2受体释放出IL-2。

在另一个实施方式中，本发明包括一种降低可活化白介素-2(aIL-2)针对正常组织的结合活性并靶向癌细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者给药有效量的可活化白介素-2(aIL-2)融合蛋白，所述融合蛋白包含：白介素-2(IL-2)野生型或突变蛋白；连接到所述IL-2的第一可切割连接物；连接到所述第一可切割连接物的白介素-2受体结合区(IL-2α或IL-2β受体)；和连接到所述IL-2或IL-2受体的半衰期延长物，其中所述可切割连接物的切割从所述IL-2受体释放出IL-2。

在另一个实施方式中，本发明包括治疗癌症、缓解癌症症状或延迟癌症进展的方法，所述方法包括向有需要的受试者给药有效量的权利要求1所述的抗体。在一种情况下，所述癌症是表达切割所述可切割连接物的酶的癌症。在另一种情况下，所述癌症选自膀胱癌、骨癌、乳腺癌、类癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、泌尿生殖系统癌症或尿路上皮癌。在另一种情况下，所述癌症选自由急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、B-细胞淋巴瘤、膀胱尿路上皮癌、乳腺导管癌、乳腺小叶癌、食管癌、去势抵抗性前列腺癌(CRPC)、宫颈癌、胆管癌、慢性髓性白血病、结直肠腺癌、结肠直肠癌(CRC)、食管癌、胃腺癌、多形性胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金淋巴瘤/原发性纵隔B-细胞淋巴瘤、肝细胞癌(HCC)、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、低级别神经胶质瘤、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、黑色素瘤(MEL)、间皮瘤、非鳞状NSCLC、卵巢浆液性腺癌、胰腺导管腺癌、副神经节瘤和嗜铬细胞瘤、前列腺癌、肾细胞癌(RCC)、肉瘤、皮肤黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、T-细胞淋巴瘤、胸腺瘤、甲状腺乳头状癌、子宫癌肉瘤、子宫体子宫内膜样癌和葡萄膜黑色素瘤组成的组。

附图说明

为了更完整地理解本发明的特点和优点，现在将与附图一起参考本发明的详细描述，在所述附图中：

图1A至1J示出了带有或不带有靶结合多肽的Pro-IL2。图1A至1E示出了pro-IL-2同二聚体蛋白药物的示意图。在改变或未改变的pH下将IL-2WT或与IL-2R结合亲和性改变的突变蛋白连接到具有肿瘤组织特异性切割位点的IL-2Rα或β，后者的后方或前方具有半衰期延长物例如人类Fc。实例包括(图1A)IL2

图2A至2G示出了pro-IL2x肿瘤靶向多肽的异二聚体。图2A至2E示出了pro-IL-2异二聚体蛋白药物的示意图。将IL-2WT或者具有较低亲和性或较高亲和性或pH抗性的突变蛋白连接到具有肿瘤组织特异性切割位点的IL-2Rα或β，后者的后方或前方具有半衰期延长物，作为所述异二聚体的一部分。另一部分包括融合有靶结合多肽的半衰期延长物，以形成异二聚体。实例包括(图2A)IL2

图3A和3B示出了IL2的突变蛋白的酵母展示筛选。通过酵母表面展示筛选鉴定的人类IL-2突变蛋白与人类IL-2Rβ表现出提高的结合亲和性。(图3A)流式细胞术数据显示，在一系列浓度下，IL-2Rβ与表达IL-2突变蛋白的酵母的结合比IL-2WT更强。(图3B)ELISA数据显示IL-2Rβ与IL-2突变蛋白的结合比IL-2WT强约20倍。所述IL-2突变蛋白的蛋白质序列示出在SEQ ID NO：3中。

图4A和4B示出了pH抗性IL2的选择和鉴定。通过酵母表面展示筛选鉴定的人类IL-2突变蛋白与WT蛋白相比，在pH 6.9下与人类IL-2Rβ表现出更强的结合亲和性。(图4A)流式细胞术数据显示，在pH6.9下，在一系列浓度下，IL-2Rβ与表达IL-2突变蛋白的酵母的结合比IL-2WT更强。(图4B)ELISA数据显示在pH 6.4下IL-2Rβ与IL-2突变蛋白结合但不与WT结合，当两者均含有IL-2突变蛋白并且WT含有消除与IL-2Rα的结合的F42A突变时。所述IL-2突变蛋白的蛋白质序列示出在SEQ ID NOS：3-4中。

图5A和5B示出了通过酵母表面展示筛选鉴定的人类IL-2突变蛋白更强烈地激活人类外周血单核细胞(HPBM)以产生IFNγ。(图5A)ELISA数据显示，当用抗CD3抗体共同刺激时，IL-2突变蛋白诱导人类PBMC生产IFNγ比IL-2WT蛋白强约10倍。相反，IL-2突变蛋白前体药物的活性比IL-2WT低超过15倍，并且比IL-2突变蛋白低超过1000倍。(图5B)ELISA数据显示IL-2突变蛋白前体药物在通过与MMP14蛋白温育除去阻断组成部分后，当用抗CD3抗体共同刺激时恢复其激活人类PBMC生产IFNγ的活性。所述IL-2突变蛋白的蛋白质序列示出在SEQ ID NO：3中。

图6和7示出了在小鼠肿瘤模型中融合有靶结合多肽的IL-2前体药物抑制肿瘤生长。(图6)在人源化小鼠肿瘤模型中，与IL-2治疗相比pro-IL-2突变蛋白药物显著抑制肿瘤生长，体重轻度降低并且生存率提高。将NSG-SGM3小鼠用MDA-MB-231接种，然后进行huPBMC转移，并用IL-2或pro-IL-2突变蛋白药物治疗。所述IL-2突变蛋白的蛋白质序列示出在SEQID NO：3中。(图7)与hIgG和融合有靶结合多肽的无关蛋白相比，融合有靶结合多肽的IL-2前体药物在小鼠抗原+M38肿瘤模型中显著抑制肿瘤生长。所述融合有靶结合多肽的pro-IL-2突变蛋白的蛋白质序列示出在SEQ ID NOS：23-24中。

发明详述

尽管在下文中详细讨论了本发明的各种不同实施方式的制造和使用，但应该认识到，本发明提供了许多适用的发明概念，它们可以在广泛的各种不同特定背景中体现。本文讨论的具体实施方式仅仅是说明制造和使用本发明的具体方式，并不限制本发明的范围。

为了便于本发明的理解，下文定义了许多术语。本文中定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。没有具体数目的(诸如“a”、“an”、“the”)等术语并非仅指单一实体，而是包括可使用特定实例进行说明的总体类别。本文中的术语用于描述本发明的特定实施方式，但它们的使用不限制本发明，除非在权利要求书中概述。

在癌症的治疗中使用的高剂量白介素-2(IL2)，由于短半衰期及其在包括心、肺、肾和中枢神经系统在内的多个器官系统中的毒性，伴有严重副作用。优先在肿瘤微环境中特异性激活IL2活性，而在其他组织中更少激活IL2活性，是降低其毒性的关键。本发明人设计了一种IL2前体药物，它是一种可活化IL2，通过使用IL2受体β来阻断它在正常组织中的活性。所述IL2受体β通过切割对肿瘤微环境中的酶或其他因子敏感的连接物来移除。可切割连接物的一个实例是肽连接物，例如MMP14肽底物序列，其在存在或富集MMP14的肿瘤微环境中在位点中被切割。

通过将IL2RB的细胞外结构域连接到IL2并提高IL2与IL2RB相对于IL2RA的结合亲和性，本发明降低了单克隆抗体疗法的脱靶毒性，从而提高了治疗指数和患者的药物耐受性。通过使用短的可切割连接物使IL2和IL2RB近邻，在体外和体内允许IL2B阻断IL2，直至所述药物到达肿瘤部位，在那里可以切割所述连接物的蛋白酶通常被上调。在本发明中，使用ILRB的细胞外结构域(ECD)来阻断IL2，它们通过肽连接物例如MMP肽和/或基于MMP的肽连接物相连。已发现，本文中教导的可活化IL2在药物到达肿瘤之前具有很小活性或没有活性，因此产生了长半衰期、蛋白质稳定性和可制造性。所述新的可活化IL2构建物的特点还在于降低了IL2与IL2RA的结合亲和性的突变，这进一步提高了它与肿瘤组织中的效应T细胞结合的能力，同时避开了Treg。

通过将IL2RA的细胞外结构域连接到IL2WT或其中突变提高了IL2与IL2RB的结合亲和性的突变蛋白，本发明降低了单克隆抗体疗法的脱靶毒性，从而提高了治疗指数和患者的药物耐受性。通过使用短的可切割连接物使IL2和IL2RA近邻，在体外和体内允许IL2A阻断IL2，直至所述药物/融合蛋白到达肿瘤部位，在那里可以切割所述连接物的蛋白酶通常被上调。在本发明中，使用ILRA的细胞外结构域(ECD)来阻断IL2，它们通过肽连接物例如MMP肽和/或基于MMP的肽连接物相连。已发现，本文中教导的可活化IL2在药物到达肿瘤之前具有极小活性或没有活性，因此产生了长半衰期、蛋白质稳定性和可制造性。所述新的可活化IL2构建物的特点还在于提高了IL2与IL2RB的结合亲和性的突变，这进一步提高了它激活肿瘤组织内的T细胞的能力，同时避开了Treg。

当在本文中使用时，术语“可活化IL2”、“aIL2”或“pro-IL2”是指包含被可切割连接物隔开的IL2和IL2受体(IL-2α或IL-2β受体)的融合蛋白。

编码所述aIL2的核酸可以是用于在宿主细胞例如细菌、真菌、植物或哺乳动物细胞中表达所述aIL2的载体的一部分。

当在本文中使用时，短语“增加的半衰期”和“半衰期延长物”是指所述融合蛋白的部分，在引入到受试者中时增加所述蛋白质的半衰期。通常，蛋白质的半衰期被测量为血清半衰期，其是从循环中除去50％的蛋白质的时间量。例如，已知对抗体Fc结构域的某些突变显著增加蛋白质的血清半衰期，并且可用于增加本发明的融合蛋白的半衰期。

在某些实施方式中，所述前体药物IL2序列含有选自由F42A、K、R、E、Q；Y45A、K、R、E、Q、F、W、H；L72A、G、K、R、E组成的组的一个或多个突变以降低与IL2受体α的结合。在某些实施方式中，所述IL2序列具有限制由R81A、H、K、D、E、N、Q；L85A、I、G、K、R、E、Q、T、S；I86A、I、G、K、R、E、Q、T、S组成的组的一个或多个突变以提高与IL2受体β的结合亲和性。在10,150,802号美国专利中教导了用于本发明的以与IL2RB的亲和性提高为特点的IL2的一个实例，相关序列通过参考并入本文。

在其他实施方式中，所述IL2序列含有野生型序列或一个或多个突变。在某些实施方式中，所述IL2前体药物是同二聚体Fc构建物。在其他实施方式中，将抗原结合结构域附连到所述Fc区的N’-端。在某些实施方式中，将抗原结合结构域附连到Fc的C’-端。

当在本文中使用时，术语“靶结合多肽”是指特异性结合生物靶的肽或多肽，例如与其同源受体结合的配体或与其特异性抗原结合的抗体，所述抗原可以是蛋白质、糖类、核酸、脂质、小分子等。靶结合多肽的实例包括针对肿瘤细胞特异性抗原、T细胞特异性抗原和特异性驻留在肿瘤组织中的蛋白质的抗体，并且所述抗体可以是抗体Fab、scFab、scFv。

在某些实施方式中，所述IL2前体药物是异二聚体Fc匙钮(key and knob)构建物，其中Fc6(key)臂带有所述IL2前体药物并且Fc9(key)臂带有所述靶结合多肽，其可以是靶向抗体。在某些实施方式中，所述靶结合多肽与选自HER1、HER2、HER3、GD2、癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体活性突变体(EGFRVIII)、CD133、成纤维细胞活化蛋白Α(FAP)、上皮细胞黏附分子(Epcam)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、EPH受体A4(EphA)、酪氨酸蛋白激酶Met(cMET)、IL-13Ra2、微粒体环氧化物水解酶(mEH)、MAGE、间皮素、MUC16、MUC1、前列腺干细胞抗原(PSCA)、肾母细胞瘤-1(WT-1)或密蛋白家族蛋白的肿瘤靶向抗原结合。

在某些实施方式中，所述靶结合多肽与选自CTLA-4、PD-1、Lag3、S15、B7H3、B7H4、TCR-α、TCR-β或TIM-3、CD3、41BB或OX40的T-细胞标志物结合。

在某些实施方式中，所述靶结合多肽与选自PD-L1、CD40、CD24、B7H3、TGF-β受体、TNFR家族成员1至20、CD80、CD86、FLT3、CD11c、CD8-α、5B6(CLEC9A)、CD1c、CD11b、CD13、CD33、HLA-DR、CD141、CD1a、CD32、CD45、CD80、CD86、CD207、CD2、CD7、CD45RA、CD68、CD123、CD303、CD304的抗原呈递细胞标志物结合。

当在本文中使用时，术语“Fc抗体区突变体”或“突变体Fc”是指抗体的氨基酸序列变体，其中一个或多个氨基酸残基已被修饰，例如所述抗体的Fc部分中的突变。此类突变体必然与所述抗体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列具有低于100％的序列同一性或相似性，并与所述氨基酸序列具有至少75％，例如至少80％、或至少85％、或至少90％或至少95、96、97、98或99％的氨基酸序列同一性或相似性。突变所述Fc区的目的是降低或消除ADCC功能或防止二聚化，从而形成单体Fc抗体。

根据氨基酸序列，“免疫球蛋白”可以被分为不同类别。存在至少五(5)个主要的免疫球蛋白类别，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的几种可以被进一步分成亚类(同型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG4，IgA-1和IgA-2。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。本发明可以使用任何同型的Fc区。

本发明还包括可切割连接物，例如蛋白酶可切割连接物。可切割连接物的实例是包含被肿瘤相关蛋白酶：MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、uPA、FAPa或组织蛋白酶B切割的序列的肽。其他实例包括被凋亡或炎症相关应答期间或受试者接受放疗时上调的蛋白酶例如半胱天冬酶切割的可切割连接物。半胱天冬酶的实例是半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶11和/或半胱天冬酶12。

本发明的aIL2设计。为了避免脱靶IL2相互作用，本发明通过用被可切割连接物隔开的IL2结合区例如IL2受体β结合区阻断IL2来降低或阻断所述IL2结合它在细胞表面上的靶受体。在靶位点处切割所述可切割连接物后，IL2从所述IL2受体结合区释放，并且IL2以其完整的结合能力被局部释放。

用于本发明的IL-2突变蛋白废除或降低了与IL2Rα的结合，改变与受体β的结合，其激活肿瘤微环境中的效应T细胞，而不激活高表达受体α的调节性T细胞。这具有表现出增强的肿瘤灭杀活性的潜力。为了改变IL-2与其受体α和β的结合并最小化其副作用，IL-2突变蛋白在人类IL-2(SEQ ID NO：1)的下述位置处含有氨基酸替换，包括一个或多个替换，选自：F42A、K、R、E或Q；Y45A、K、R、E、Q、F、W或H；L72A、G、K、R、E或Q；R81A、H、K、D、E、N或Q；L85A、I、G、K、R、E、Q、T或S；I86A、I、G、K、R、E、Q、T或S。

MMP14切割序列被嵌入在连接IL2R和IL2的连接物区域中。这允许MMP14阳性肿瘤中的IL2R介导的阻断。

除了IL2突变蛋白中F42A替换，减少与受体α的结合之外，还包括提高与IL2受体β的结合和增强前体药物的功效的突变。所述huFc区极大增加了所述前体药物的半衰期，允许通过亲和柱方便地纯化，并提高生产稳定性。在某些实施方式中，可以使用不与吞噬细胞上的FcR结合的突变Fc区来减少效应细胞的耗竭。

在某些实施方式中，本发明的pro-IL2包括四个基本的模块式结构域：半衰期延长物(例如hFc WT或其突变体)，IL2野生型或IL2突变蛋白，IL2受体α或β，和蛋白酶可切割连接物。为了增加IL2的体内半衰期，可以将IL2偶联到hIgG1Fc-mu，这提高了IL2在血清中的稳定性，并且没有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。为了提高CD8T细胞和NK相对于Treg的IL2激活，将降低或废除IL2对受体α的亲和性的一个或多个突变引入(F42A)到IL2中，然后还产生了在中性或更低pH下改变IL2与IL2Rβ的亲和性的其他新的IL2突变。为了最小化外周毒性，将IL2活性用IL2受体β阻断。为了将IL2活性靶向到肿瘤微环境(TME)，将IL2用可以被肿瘤特异性蛋白酶MMP14切割的连接物与IL2受体β相连。由于MMP14在TME中特异性表达，在MMP14切割位点处切割pro-IL2允许在TME中使可溶性IL2Rβ从IL2突变蛋白解离并恢复IL2活性。

图1A至1J示出了含有或不含靶结合多肽的Pro-IL2。图1A至1E示出了pro-IL-2同二聚体蛋白药物的示意图。在改变或未改变的pH下将IL-2WT或与IL-2R结合亲和性改变的突变蛋白连接到具有肿瘤组织特异性切割位点的IL-2Rα或β，后者在后方或前方具有半衰期延长物例如人类Fc。实例包括(图1A)IL2

图2A至2G示出了pro-IL2x肿瘤靶向多肽的异二聚体。图2A至2E示出了pro-IL-2异二聚体蛋白药物的示意图。将IL-2WT或具有较低亲和性或较高亲和性或pH抗性的突变蛋白连接到具有肿瘤组织特异性切割位点的IL-2Rα或β，后者的后方或前方具有半衰期延长物，作为所述异二聚体的一部分。另一部分包括融合有靶结合多肽的半衰期延长物，以形成异二聚体。实例包括(图2A)IL2

图3A和3B示出了IL2的突变蛋白的酵母展示筛选。通过酵母表面展示筛选鉴定的人类IL-2突变蛋白与人类IL-2Rβ表现出提高的结合亲和性。(图3A)流式细胞术数据显示，在一系列浓度下，IL-2Rβ与表达IL-2突变蛋白的酵母的结合比IL-2WT更强。(图3B)ELISA数据显示IL-2Rβ与IL-2突变蛋白的结合比IL-2WT强约20倍。所述IL-2突变蛋白的蛋白质序列示出在SEQ ID NO：3中，但是也可以是SEQ ID NOS：1-10中的任一者。

图4A和4B示出了pH抗性IL2的选择和鉴定。通过酵母表面展示筛选鉴定的人类IL-2突变蛋白与WT蛋白相比，在pH 6.9下与人类IL-2Rβ表现出更强的结合亲和性。(图4A)流式细胞术数据显示，在pH6.9下，在一系列浓度下，IL-2Rβ与表达IL-2突变蛋白的酵母的结合比IL-2WT更强。(图4B)ELISA数据显示在pH 6.4下IL-2Rβ与IL-2突变蛋白但不与WT结合，当两者均含有IL-2突变蛋白并且WT含有消除与IL-2Rα的结合的F42A突变时。所述IL-2突变蛋白的蛋白质序列示出在SEQ ID NOS：3-4中，但是也可以是SEQ ID NOS：1-10中的任一者。

图5A和5B示出了通过酵母表面展示筛选鉴定的人类IL-2突变蛋白更强烈地激活人类外周血单核细胞(HPBM)以产生IFNγ。(图5A)ELISA数据显示，当用抗CD3抗体共同刺激时，IL-2突变蛋白诱导人类PBMC生产IFNγ比IL-2WT蛋白强约10倍。相反，IL-2突变蛋白前体药物的活性比IL-2WT低超过15倍，并且比IL-2突变蛋白低超过1000倍。(图5B)ELISA数据显示IL-2突变蛋白前体药物在通过与MMP14蛋白温育除去阻断组成部分后，当用抗CD3抗体共同刺激时恢复其激活人类PBMC生产IFNγ的能力。所述IL-2突变蛋白的蛋白质序列示出在SEQ ID NO：3中，但是也可以是SEQ ID NOS：1-10中的任一者。

图6和7示出了在小鼠肿瘤模型中融合有靶结合多肽的IL-2前体药物抑制肿瘤生长。(图6)在人源化小鼠肿瘤模型中，与IL-2治疗相比pro-IL-2突变蛋白药物显著抑制肿瘤生长，体重轻度降低并且生存率提高。将NSG-SGM3小鼠用MDA-MB-231接种，然后进行huPBMC转移，并用IL-2或pro-IL-2突变蛋白药物治疗。所述IL-2突变蛋白的蛋白质序列示出在SEQID NO：3-4中，但是也可以是SEQ ID NOS：1-10中的任一者。(图7)与hIgG和融合有靶结合多肽的无关蛋白相比，融合有靶结合多肽的IL-2前体药物在小鼠抗原+M38肿瘤模型中显著抑制肿瘤生长。所述融合有靶结合多肽的pro-IL-2突变蛋白的蛋白质序列示出在SEQ IDNOS：23-24中。

测试RB-pro-IL2的阻断

将IL2前体药物和对照(IL2-PSAcs-IL2Rα)在各种不同剂量下与HEK293Blue IL2受体细胞温育24小时。然后将显色剂与上清液温育1小时，并使用分光光度计定量颜色以表示IL2活性。

IL2前体药物的体内测试

将例如10

SEQ ID NO：1：人类IL-2WT

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTSEQ ID NO：2：人类IL-2突变体V0

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTSEQ ID NO：3：人类IL-2突变体V1

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLEPRDIISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTSEQ ID NO：4：人类IL-2突变体V2

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLEPRDTISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTSEQ ID NO：5：人类IL-2突变体V3

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLEPRDSISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTSEQ ID NO：6：人类IL-2突变体V4

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLDPRDEISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTSEQ ID NO：7：人类IL-2突变体V5

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLNPRDQISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTSEQ ID NO：8：人类IL-2突变体V6

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLDPRDQESNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTSEQ ID NO：9：人类IL-2突变体V7

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLEPRDIISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTSEQ ID NO：10：人类IL-2突变体V8

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLEPRDTISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTSEQ ID NO：11：可切割连接物序列的实例

SGRSENIRTA

SEQ ID NO：12：可切割连接物序列的实例

SGRSPAIFTA

SEQ ID NO：13：可切割连接物序列的实例

SGARYRWLTA

SEQ ID NO：14：人类IgG1Fc(人类Fc，二聚体，野生型)

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO：15：人类IgG1Fc(人类Fc，二聚体，突变体)

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO：16：人类IgG1Fc(人类Fc，单体，野生型)

APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTKPPSRDELTKNQVSLSCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTVPVLDSDGSFRLASYLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQID NO：17：人类IgG1Fc(人类Fc，单体，突变体)

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTKPPSRDELTKNQVSLSCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTVPVLDSDGSFRLASYLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQID NO：18：人类IgG1Fc(人类Fc6，突变体)

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFKLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO：19：人类IgG1Fc(人类Fc9，突变体)

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSALTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO：20：人类IL-2Rα细胞外结构域

ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSSEQ IDNO：21：人类IL-2Rβ细胞外结构域

AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTSEQ IDNO：22：IgGκ信号肽

METDTLLLWVLLLWVPGSTGD

SEQ ID NO：23：抗密蛋白-scFab-hFcmu-IL2Rα-MMP14-IL2

DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGSSGRSENIRTAGGSQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCTRSWRGNSFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSSGARYRWLTAGGGGSGGGGSGGGGSELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETS

与WO 2016/022671相比，本发明的优点在于所述含有降低与IL2Rα(而不是β或γ)的结合的一个或多个突变的IL2突变蛋白激活肿瘤微环境中的效应T细胞，而不激活高表达受体α的调节性T细胞。这具有表现出增强的肿瘤灭杀活性的潜力。MMP14切割序列嵌入在连接IL2Rβ和IL2的连接物区域中。这允许MMP14

与U.S.8,734,774相比，本发明的优点在于使用IL2突变蛋白代替野生型IL2，这被用于废除它与IL2Rα的结合，并且可以提高它灭杀癌细胞的功效，因为在肿瘤微环境中调节性T细胞不被活化。所述huFc区被用于增加所述前体药物的半衰期。使用MMP14底物序列代替可溶的MMP2和MMP9的底物。MMP14对于选择实体肿瘤来说可能是更强的选择器，因为它是一种被证实在某些实体肿瘤中上调的跨膜蛋白酶。由于IL2R-α在Treg中高表达，因此降低与R-α的结合将防止对IL2的抗肿瘤效果有害的Treg结合，而提高IL2与IL2R-β的结合的突变将解决IL2相对弱地与IL2R-β结合的问题。此外，对于使用IL-2R-α作为阻断组成部分的前体药物来说，本发明的优点在于使用半衰期延长物将显著增加所述前体药物的半衰期并提高它的功效。更重要的是，本发明融合了靶结合多肽，其与肿瘤细胞抗原、T细胞或肿瘤组织特异性蛋白特异性结合，并改善所述前体药物的肿瘤靶向并降低其毒性。

与WO 2020/057646和WO 2020/057645相比，本发明的优点在于所述融合蛋白是含有IL2突变体蛋白和阻断所述IL2突变体蛋白在外周的毒性的IL2Rβ肽的前体药物。此外，MMP14切割序列被嵌入在连接IL2Rβ和IL2的连接物区中。这允许MMP14阳性肿瘤中IL2Rβ介导的阻断。

在另一个实施方式中，本发明包括一种可活化白介素-2(aIL-2)融合蛋白，其包含下述组分、基本上由下述组分组成或由下述组分组成：白介素-2(IL-2)野生型或IL-2突变蛋白；连接到所述IL-2的第一可切割连接物；连接到所述第一可切割连接物的白介素-2受体结合区(IL-2α或IL-2β受体，可以分别与IL-2RA或RB互换)；和连接到所述IL-2或IL-2受体的半衰期延长物，其中所述可切割连接物的切割从所述IL-2受体释放出IL-2。在一种情况下，所述半衰期延长物是抗体Fc区，其选自野生型Fc区、突变的Fc区、单体野生型Fc区、单体突变Fc区、二聚体野生型Fc区或二聚体突变Fc区。在另一种情况下，所述可切割连接物被肿瘤相关蛋白酶切割。在另一种情况下，所述可切割连接物被选自基质金属蛋白酶-1(MMP1)、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、uPA、FAPa或组织蛋白酶B的蛋白酶切割。在另一种情况下，所述可切割连接物被选自半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶11和半胱天冬酶12的半胱天冬酶切割。在另一种情况下，所述可切割连接物被基质金属蛋白酶14切割。在另一种情况下，所述IL-2包含一个或多个消除或降低与IL2RA或IL2RB的结合亲和性的突变。在另一种情况下，所述IL-2包含选自下述的一个或多个突变：F42A、K、R、E或Q；Y45A、K、R、E、Q、F、W或H；L72A、G、K、R、E或Q；R81A、H、K、D、E、N或Q；L85A、I、G、K、R、E、Q、T或S；I86A、I、G、K、R、E、Q、T或S。在另一种情况下，所述IL-2被突变以提高与IL2RB的结合亲和性。在另一种情况下，所述融合蛋白是同二聚体。在另一种情况下，所述融合蛋白是异二聚体。在另一种情况下，所述融合蛋白还包含靶结合多肽，其中所述靶选自HER1、HER2、HER3、GD2、癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体活性突变体(EGFRVIII)、CD133、成纤维细胞活化蛋白Α(FAP)、上皮细胞黏附分子(Epcam)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、EPH受体A4(EphA)、酪氨酸蛋白激酶Met(cMET)、IL-13Ra2、微粒体环氧化物水解酶(mEH)、MAGE、间皮素、MUC16、MUC1、前列腺干细胞抗原(PSCA)、肾母细胞瘤-1(WT-1)、密蛋白家族蛋白，选自CTLA-4、PD-1、Lag3、S15、B7H3、B7H4、TCR-α、TCR-β、TIM-3、CD3、41BB或OX40的T-细胞标志物，和/或选自PD-L1、CD40、CD24、B7H3、TGF-β受体、TNFR家族成员1至20、CD80、CD86、FLT3、CD11c、CD8-α、5B6(CLEC9A)、CD1c、CD11b、CD13、CD33、HLA-DR、CD141、CD1a、CD32、CD45、CD80、CD86、CD207、CD2、CD7、CD45RA、CD68、CD123、CD303、CD304的抗原呈递细胞标志物。在另一种情况下，与IL-2相比，所述融合蛋白降低所述aIL-2的体内毒性。在另一种情况下，所述融合蛋白依次包含所述IL-2、第一可切割连接物、IL-2受体和突变的抗体Fc区；所述融合蛋白依次包含IL-2受体、第一可切割连接物、IL-2和抗体Fc区；所述融合蛋白依次包含所述IL-2或IL-2受体、第一可切割连接物、IL-2或IL-2受体、第二可切割连接物和抗体Fc区；所述融合蛋白依次包含所述抗体Fc区、第一可切割连接物、IL-2受体、第二可切割连接物和IL-2；或者所述融合蛋白依次包含所述抗体Fc区、IL-2受体、第一可切割连接物和IL-2。在另一种情况下，所述可切割连接物是蛋白酶可切割连接物。在另一种情况下，所述可切割连接物被在凋亡或炎症相关应答期间上调的蛋白酶切割。在另一种情况下，所述aIL-2具有选自SEQ IDNOS：1至10的野生型或突变体IL-2。在另一种情况下，所述融合蛋白包含：(a)IL-2，其是SEQID NOS：1-10；(b)IL-2Rα(SEQ ID NO：20)或IL-2Rβ(SEQ ID NO：21)；(c)可切割连接物，其选自SEQ ID NOS：11-13，(d)人类IgG1-Fc，其是SEQ ID NOS：14-19；和任选的靶结合多肽。在另一种情况下，所述aIL-2与IL-2相比在心、肺、肾或中枢神经系统中具有降低的毒性。在另一种情况下，所述白介素-2(IL-2)、第一可切割连接物、白介素-2受体结合区(IL-2α或β受体)或抗体Fc区中的至少一者是人类序列。

在另一个实施方式中，本发明包括一种药物组合物，其包含可活化白介素-2(aIL-2)融合蛋白和载体、基本上由它们组成或由它们组成，所述融合蛋白包含：白介素-2(IL-2)野生型或突变蛋白；连接到所述IL-2的第一可切割连接物；连接到所述第一可切割连接物的白介素-2受体结合区(IL-2α或IL-2β受体)；和连接到所述IL-2或IL-2受体的半衰期延长物，其中所述可切割连接物的切割从所述IL-2受体释放出IL-2。

在另一个实施方式中，本发明包括一种降低可活化白介素-2(aIL-2)与正常组织的结合活性和靶向癌细胞的方法，所述方法包括、基本上由其组成或由其组成：向有需要的受试者给药有效量的可活化白介素-2(aIL-2)融合蛋白，所述融合蛋白包含：白介素-2(IL-2)野生型或突变蛋白；连接到所述IL-2的第一可切割连接物；连接到所述第一可切割连接物的白介素-2受体结合区(IL-2α或IL-2β受体)；和连接到所述IL-2或IL-2受体的半衰期延长物，其中所述可切割连接物的切割从所述IL-2受体释放出IL-2。

在另一个实施方式中，本发明包括治疗癌症、缓解癌症症状或延迟癌症进展的方法，所述方法包括、基本上由其组成或由其组成：向有需要的受试者给药有效量的权利要求1所述的抗体。在一种情况下，所述癌症是表达切割所述可切割连接物的酶的癌症，在另一种情况下，所述癌症选自膀胱癌、骨癌、乳腺癌、类癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、泌尿生殖系统癌症或尿路上皮癌。在另一种情况下，所述癌症选自由急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、B-细胞淋巴瘤、膀胱尿路上皮癌、乳腺导管癌、乳腺小叶癌、食管癌、去势抵抗性前列腺癌(CRPC)、宫颈癌、胆管癌、慢性髓性白血病、结直肠腺癌、结肠直肠癌(CRC)、食管癌、胃腺癌、多形性胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金淋巴瘤/原发性纵隔B-细胞淋巴瘤、肝细胞癌(HCC)、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、低级别神经胶质瘤、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、黑色素瘤(MEL)、间皮瘤、非鳞状NSCLC、卵巢浆液性腺癌、胰腺导管腺癌、副神经节瘤和嗜铬细胞瘤、前列腺癌、肾细胞癌(RCC)、肉瘤、皮肤黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、T-细胞淋巴瘤、胸腺瘤、甲状腺乳头状癌、子宫癌肉瘤、子宫体子宫内膜样癌和葡萄膜黑色素瘤组成的组。

设想了本说明书中讨论的任何实施方式可以针对本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。

应该理解，本文描述的特定实施方式是为了说明而不是限制本发明而示出的。本发明的原则性特点在不背离本发明的范围的情况下可用于各种不同实施方式中。本领域技术人员将会认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文描述的特定程序的大量等同物。此类等同物应该被认为是在本发明的范围之内并被权利要求书覆盖。

本说明书中提到的所有出版物和专利申请说明了本发明所属领域的专业技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请通过参考并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体且单独地指明通过参考并入本文。

当在权利要求书和/或说明书中与术语“包含”相结合使用时，所没有具体数目的指称可能意味着“一个”，但是它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或超过一个”的含义相一致。在权利要求书中术语“或”的使用被用于意味着“和/或”，除非明确说明是指仅仅可选项或者所述可选项互相排他，尽管本公开支持是指仅仅可选项和“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“约”被用于指示值包括用于确定所述值的装置、方法的固有误差变化或在研究对象之间存在的变化。

当在本说明书和权利要求书中使用时，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包含或开放性的，并且不排除其他未叙述的特点、要素、组分、组、整数和/或步骤，但不排除其他未陈述的特点、要素、组分、组、整数和/或步骤的存在。再本文提供的任何组合物和方法的实施方式中，“包含”可以被“基本上由……组成”和“由……组成”代替。当在本文中使用时，术语“由……组成”被用于指示仅存在所叙述的整数(例如特点、要素、特征、性质、方法/过程步骤或限制)或成组整数(例如特点、要素、特征、性质、方法/过程步骤或限制)。当在本文中使用时，短语“基本上由……组成”需要所指定的特点、要素、组分、组、整数和/或步骤，但不排除存在其他未陈述的特点、要素、组分、组、整数和/或步骤以及不实质性影响要求保护的发明的基本和新颖特征和/或功能的特点、要素、组分、组、整数和/或步骤。

当在本文中使用时，术语“或其组合”是指在所述术语之前列出的条目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括下述至少一者：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在特定情况下顺序是重要的，则还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续以此为例，明确包括了含有一个或多个条目或项目的重复的组合，例如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。专业技术人员将会理解，通常对任何组合中的条目或项目的数量没有限制，除非从上下文明显看出不是如此。

当在本文中使用时，近似语例如但不限于“约”、“实质”或“实质上”是指被如此修饰的条件被理解为不必定是绝对或完美的，但将被本领域普通技术人员认为是足够接近的，以保证将所述条件指定为存在。所述描述可以变化的程度取决于可以创建多大的变化并仍使本领域普通技术人员认识到所述修饰的特点仍然具有未修饰的条件的所需特征和能力。一般而言，但根据前述讨论，本文中用近似语例如“约”修饰的数值可以与陈述值相差至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或15％。

本文中公开和要求保护的所有组合物和/或方法，根据本公开不需过多实验即可制备和执行。尽管已根据优选实施方式描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员来说，显然可以对所述组合物和方法和在本文描述的方法的步骤或步骤顺序中施加变化，而不背离本发明的概念、精神和范围。对本领域技术人员来说显而易见的所有此类相似的替换和修改，被视为在随附的权利要求书所定义的本发明的精神、范围和概念之内。

为了帮助专利局和根据本申请发布的任何专利的任何读者解释随附的权利要求书，本申请人希望指出，他们不打算任何随附的权利要求项援引35U.S.C.§112的条款6、U.S.C.§112的条款(f)或在其提交之日已存在的等同物，除非在特定权利要求项中明确使用了词语“用于……的手段”或“用于……的步骤”。

对于每个权利要求项来说，每个从属权利要求项可以从属于独立权利要求项和每一个权利要求项的每个在先从属权利要求项这两者，只要所述在先权利要求项为权利要求项的条款或要素提供了适合的现行基础即可。

序列表

<110> 免疫靶向有限公司（IMMUNE TARGETING INC.）

<120> 可活化IL2组合物和使用方法

<130> P222792CN1-P

<140> 17/245,679

<141> 2021-04-30

<150> 63/018,295

<151> 2020-04-30

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

            20                  25                  30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

    50                  55                  60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65                  70                  75                  80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

                85                  90                  95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

            100                 105                 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

        115                 120                 125

Ile Ser Thr Leu Thr

    130

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

            20                  25                  30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

    50                  55                  60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65                  70                  75                  80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

                85                  90                  95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

            100                 105                 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

        115                 120                 125

Ile Ser Thr Leu Thr

    130

<210> 3

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

            20                  25                  30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

    50                  55                  60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65                  70                  75                  80

Glu Pro Arg Asp Ile Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

                85                  90                  95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

            100                 105                 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

        115                 120                 125

Ile Ser Thr Leu Thr

    130

<210> 4

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

            20                  25                  30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

    50                  55                  60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65                  70                  75                  80

Glu Pro Arg Asp Thr Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

                85                  90                  95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

            100                 105                 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

        115                 120                 125

Ile Ser Thr Leu Thr

    130

<210> 5

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 5

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

            20                  25                  30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

    50                  55                  60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65                  70                  75                  80

Glu Pro Arg Asp Ser Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

                85                  90                  95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

            100                 105                 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

        115                 120                 125

Ile Ser Thr Leu Thr

    130

<210> 6

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 6

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

            20                  25                  30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

    50                  55                  60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65                  70                  75                  80

Asp Pro Arg Asp Glu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

                85                  90                  95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

            100                 105                 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

        115                 120                 125

Ile Ser Thr Leu Thr

    130

<210> 7

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 7

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

            20                  25                  30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

    50                  55                  60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65                  70                  75                  80

Asn Pro Arg Asp Gln Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

                85                  90                  95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

            100                 105                 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

        115                 120                 125

Ile Ser Thr Leu Thr

    130

<210> 8

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 8

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

            20                  25                  30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

    50                  55                  60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65                  70                  75                  80

Asp Pro Arg Asp Gln Glu Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

                85                  90                  95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

            100                 105                 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

        115                 120                 125

Ile Ser Thr Leu Thr

    130

<210> 9

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 9

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

            20                  25                  30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

    50                  55                  60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65                  70                  75                  80

Glu Pro Arg Asp Ile Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

                85                  90                  95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

            100                 105                 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

        115                 120                 125

Ile Ser Thr Leu Thr

    130

<210> 10

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 10

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

            20                  25                  30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

    50                  55                  60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65                  70                  75                  80

Glu Pro Arg Asp Thr Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

                85                  90                  95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

            100                 105                 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

        115                 120                 125

Ile Ser Thr Leu Thr

    130

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 11

Ser Gly Arg Ser Glu Asn Ile Arg Thr Ala

1               5                   10

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 12

Ser Gly Arg Ser Pro Ala Ile Phe Thr Ala

1               5                   10

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 13

Ser Gly Ala Arg Tyr Arg Trp Leu Thr Ala

1               5                   10

<210> 14

<211> 227

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 14

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1               5                   10                  15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

            20                  25                  30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

        35                  40                  45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

    50                  55                  60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65                  70                  75                  80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

                85                  90                  95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

            100                 105                 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

        115                 120                 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

    130                 135                 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145                 150                 155                 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

                165                 170                 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

            180                 185                 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

        195                 200                 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

    210                 215                 220

Pro Gly Lys

225

<210> 15

<211> 227

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 15

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1               5                   10                  15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

            20                  25                  30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

        35                  40                  45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

    50                  55                  60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65                  70                  75                  80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

                85                  90                  95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

            100                 105                 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

        115                 120                 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

    130                 135                 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145                 150                 155                 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

                165                 170                 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

            180                 185                 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

        195                 200                 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

    210                 215                 220

Pro Gly Lys

225

<210> 16

<211> 217

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 16

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1               5                   10                  15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

            20                  25                  30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

        35                  40                  45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

    50                  55                  60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65                  70                  75                  80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

                85                  90                  95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

            100                 105                 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

        115                 120                 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

    130                 135                 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145                 150                 155                 160

Tyr Lys Thr Thr Val Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Arg Leu

                165                 170                 175

Ala Ser Tyr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

            180                 185                 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

        195                 200                 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

    210                 215

<210> 17

<211> 217

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 17

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1               5                   10                  15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

            20                  25                  30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

        35                  40                  45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

    50                  55                  60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65                  70                  75                  80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

                85                  90                  95

Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

            100                 105                 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

        115                 120                 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

    130                 135                 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145                 150                 155                 160

Tyr Lys Thr Thr Val Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Arg Leu

                165                 170                 175

Ala Ser Tyr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

            180                 185                 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

        195                 200                 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

    210                 215

<210> 18

<211> 227

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 18

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1               5                   10                  15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

            20                  25                  30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

        35                  40                  45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

    50                  55                  60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65                  70                  75                  80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

                85                  90                  95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

            100                 105                 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

        115                 120                 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

    130                 135                 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145                 150                 155                 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

                165                 170                 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

            180                 185                 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

        195                 200                 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

    210                 215                 220

Pro Gly Lys

225

<210> 19

<211> 227

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 19

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1               5                   10                  15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

            20                  25                  30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

        35                  40                  45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

    50                  55                  60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65                  70                  75                  80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

                85                  90                  95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

            100                 105                 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

        115                 120                 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

    130                 135                 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145                 150                 155                 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

                165                 170                 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val

            180                 185                 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

        195                 200                 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

    210                 215                 220

Pro Gly Lys

225

<210> 20

<211> 212

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 20

Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys

1               5                   10                  15

Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg

            20                  25                  30

Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly

        35                  40                  45

Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser

    50                  55                  60

Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln

65                  70                  75                  80

Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp

                85                  90                  95

Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn

            100                 105                 110

Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr

        115                 120                 125

Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu

    130                 135                 140

Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln

145                 150                 155                 160

Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu

                165                 170                 175

Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys

            180                 185                 190

Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr

        195                 200                 205

Met Glu Thr Ser

    210

<210> 21

<211> 214

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 21

Ala Val Asn Gly Thr Ser Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala

1               5                   10                  15

Asn Ile Ser Cys Val Trp Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser

            20                  25                  30

Cys Gln Val His Ala Trp Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys

        35                  40                  45

Glu Leu Leu Pro Val Ser Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu

    50                  55                  60

Gly Ala Pro Asp Ser Gln Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu

65                  70                  75                  80

Arg Val Leu Cys Arg Glu Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln

                85                  90                  95

Asp Phe Lys Pro Phe Glu Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu

            100                 105                 110

Gln Val Val His Val Glu Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile

        115                 120                 125

Ser Gln Ala Ser His Tyr Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg

    130                 135                 140

Thr Leu Ser Pro Gly His Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu

145                 150                 155                 160

Lys Gln Lys Gln Glu Trp Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr

                165                 170                 175

Gln Tyr Glu Phe Gln Val Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr

            180                 185                 190

Thr Trp Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala

        195                 200                 205

Ala Leu Gly Lys Asp Thr

    210

<210> 22

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 22

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1               5                   10                  15

Gly Ser Thr Gly Asp

            20

<210> 23

<211> 1088

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 23

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

            20                  25                  30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

        35                  40                  45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

    50                  55                  60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65                  70                  75                  80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

                85                  90                  95

Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

            100                 105                 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

        115                 120                 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

    130                 135                 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145                 150                 155                 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

                165                 170                 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

            180                 185                 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

        195                 200                 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ser Ser Gly

    210                 215                 220

Arg Ser Glu Asn Ile Arg Thr Ala Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val

225                 230                 235                 240

Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser

                245                 250                 255

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Val

            260                 265                 270

Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro

        275                 280                 285

Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr

    290                 295                 300

Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser

305                 310                 315                 320

Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Tyr Tyr

                325                 330                 335

Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

            340                 345                 350

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

        355                 360                 365

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

    370                 375                 380

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

385                 390                 395                 400

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

                405                 410                 415

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

            420                 425                 430

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

        435                 440                 445

Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr

    450                 455                 460

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

465                 470                 475                 480

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

                485                 490                 495

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

            500                 505                 510

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

        515                 520                 525

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

    530                 535                 540

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

545                 550                 555                 560

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr

                565                 570                 575

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

            580                 585                 590

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

        595                 600                 605

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

    610                 615                 620

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

625                 630                 635                 640

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

                645                 650                 655

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

            660                 665                 670

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

        675                 680                 685

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

    690                 695                 700

Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

705                 710                 715                 720

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

                725                 730                 735

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

            740                 745                 750

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

        755                 760                 765

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

    770                 775                 780

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

785                 790                 795                 800

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

                805                 810                 815

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

            820                 825                 830

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

        835                 840                 845

Gly Gly Ser Ser Gly Ala Arg Tyr Arg Trp Leu Thr Ala Gly Gly Gly

    850                 855                 860

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Cys Asp

865                 870                 875                 880

Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr

                885                 890                 895

Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg

            900                 905                 910

Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His

        915                 920                 925

Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn

    930                 935                 940

Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys

945                 950                 955                 960

Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu

                965                 970                 975

Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu

            980                 985                 990

Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val

        995                 1000                1005

Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys

    1010                1015                1020

Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile

    1025                1030                1035

Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu Lys

    1040                1045                1050

Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys

    1055                1060                1065

Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala

    1070                1075                1080

Thr Met Glu Thr Ser

    1085

<210> 24

<211> 1088

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 24

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

            20                  25                  30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

        35                  40                  45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

    50                  55                  60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65                  70                  75                  80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

                85                  90                  95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

            100                 105                 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

        115                 120                 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

    130                 135                 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145                 150                 155                 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

                165                 170                 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

            180                 185                 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

        195                 200                 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ser Ser Gly

    210                 215                 220

Arg Ser Glu Asn Ile Arg Thr Ala Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln

225                 230                 235                 240

Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser

                245                 250                 255

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val

            260                 265                 270

Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro

        275                 280                 285

Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr

    290                 295                 300

Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser

305                 310                 315                 320

Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg

                325                 330                 335

Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser

            340                 345                 350

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

        355                 360                 365

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

    370                 375                 380

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

385                 390                 395                 400

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

                405                 410                 415

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

            420                 425                 430

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

        435                 440                 445

Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr

    450                 455                 460

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

465                 470                 475                 480

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

                485                 490                 495

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

            500                 505                 510

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

        515                 520                 525

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

    530                 535                 540

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

545                 550                 555                 560

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr

                565                 570                 575

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

            580                 585                 590

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

        595                 600                 605

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

    610                 615                 620

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

625                 630                 635                 640

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

                645                 650                 655

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

            660                 665                 670

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

        675                 680                 685

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

    690                 695                 700

Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

705                 710                 715                 720

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

                725                 730                 735

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

            740                 745                 750

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

        755                 760                 765

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

    770                 775                 780

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

785                 790                 795                 800

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

                805                 810                 815

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

            820                 825                 830

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

        835                 840                 845

Gly Gly Ser Ser Gly Ala Arg Tyr Arg Trp Leu Thr Ala Gly Gly Gly

    850                 855                 860

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Cys Asp

865                 870                 875                 880

Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr

                885                 890                 895

Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg

            900                 905                 910

Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His

        915                 920                 925

Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn

    930                 935                 940

Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys

945                 950                 955                 960

Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu

                965                 970                 975

Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu

            980                 985                 990

Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val

        995                 1000                1005

Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys

    1010                1015                1020

Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile

    1025                1030                1035

Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu Lys

    1040                1045                1050

Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys

    1055                1060                1065

Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala

    1070                1075                1080

Thr Met Glu Thr Ser

    1085