一种去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法及其应用，尤其涉及一种分离度好的去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法及其应用。

背景技术

盐酸去氧肾上腺素，简称PE，是一种α肾上腺素受体激动药，用于防治脊椎麻醉、全身麻醉、应用氯丙嗪等原因引起的低血压，也用于室上性心动过速和散瞳检查等。

酮咯酸氨丁三醇，简称KE，是一种非甾体抗炎剂，能抑制前列腺素生物合成，生物活性与其S-型有关。动物研究显示酮咯酸氨丁三醇有镇痛作用，无镇静或抗焦虑作用。

将盐酸去氧肾上腺素和酮咯酸氨丁三醇制成复方药物得到的去氧肾上腺素酮咯酸溶液是一种复方眼用制剂，由去氧肾上腺素和酮咯酸组成，前者是一种α1-肾上腺素受体激动剂，在眼内通过收缩虹膜放射肌作为瞳孔放大剂；后者是一种非甾体类抗炎药，抑制环氧化酶(COX-1和COX-2)，导致组织中前列腺素浓度降低以减少手术疼痛。同时，酮咯酸可通过抑制继发于眼部手术损伤或虹膜的直接机械刺激的前列腺素合成，防止手术导致的瞳孔缩小。

在药物生产过程中，需要检测药物中盐酸去氧肾上腺素的有关物质，以及酮咯酸氨丁三醇的有关物质，以保证临床用药的安全性和有效性。对于去氧肾上腺素酮咯酸溶液，则需要同时测定这两种活性成分的有关物质的有效方法。

复方制剂的有关物质来源较为复杂，研究发现，去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有十余种杂质，盐酸去氧肾上腺素有关物质4种，酮咯酸氨丁三醇有关物质10种。而现有的方法中只侧重其中一类有关物质的检测，例如欧洲药典EP10.0收录的盐酸去氧肾上腺素检测方法和酮咯酸氨丁三醇检测方法，这两种方法分别检测了盐酸去氧肾上腺素和酮咯酸氨丁三醇中的有关物质，但对于另外的成分的有关物质完全没有涉及。而出于对复方制剂安全性的考虑和检测的便利，如何提供一种能够同时检测去氧肾上腺素酮咯酸溶液中盐酸去氧肾上腺素和酮咯酸氨丁三醇的有关物质的方法，成为了亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法及其应用，尤其提供一种分离度好的去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法及其应用。本发明提供的检测方法能够对去氧肾上腺素酮咯酸溶液中盐酸去氧肾上腺素和酮咯酸氨丁三醇的有关物质进行同时检测，分离度高，检测效果好。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供了一种去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

将待测样品、对照品溶液分别进样进行液相色谱检测，根据检测结果分析计算有关物质的含量。

所述有关物质包括去氧肾上腺素有关物质和酮咯酸有关物质。

所述去氧肾上腺素有关物质包括如下结构中任意一种或至少两种的组合：

。

所述酮咯酸有关物质包括如下结构中任意一种或至少两种的组合：

。

上述特定检测方法能够有效对去氧肾上腺素酮咯酸溶液中盐酸去氧肾上腺素和酮咯酸氨丁三醇的有关物质进行同时检测，分离度高，检测效果好。

优选地，所述液相色谱检测的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为1-辛烷磺酸钠溶液与乙腈的混合溶液，其中1-辛烷磺酸钠溶液的浓度为0.8-2 mg/mL，1-辛烷磺酸钠溶液与乙腈的体积比为(75:25)-(85:15)。

其中，1-辛烷磺酸钠溶液的浓度可以是0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL、1.3 mg/mL、1.4 mg/mL、1.5 mg/mL、1.6 mg/mL、1.7 mg/mL、1.8 mg/mL、1.9mg/mL或2 mg/mL等，1-辛烷磺酸钠溶液与乙腈的体积比可以是75:25、77:23、80:20、83:17或85:15等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

优选地，所述流动相B为1-辛烷磺酸钠溶液与乙腈的混合溶液，其中1-辛烷磺酸钠溶液的浓度为0.8-2 mg/mL，1-辛烷磺酸钠溶液与乙腈的体积比为(45:55)-(55:45)。

其中，1-辛烷磺酸钠溶液的浓度可以是0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL、1.3 mg/mL、1.4 mg/mL、1.5 mg/mL、1.6 mg/mL、1.7 mg/mL、1.8 mg/mL、1.9mg/mL或2 mg/mL等，1-辛烷磺酸钠溶液与乙腈的体积比可以是45:55、47:53、50:50、53:47或55:45等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

上述特定的流动相通过先将不同溶剂溶液分别按比例配制混合好，再进行洗脱的方式，相比常规的直接采用两种不同流动相进行洗脱的方式能够有效提高检测的灵敏度，降低检出限。

优选地，所述液相色谱检测的流动相的流速为1.2-1.8 mL/min。

优选地，所述液相色谱检测的柱温为15-30℃。

优选地，所述液相色谱检测的检测波长为200-320 nm。

其中，流动相的流速可以是1.2 mL/min、1.3 mL/min、1.4 mL/min、1.5 mL/min、1.6 mL/min、1.7 mL/min或1.8 mL/min等，柱温可以是15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等，检测波长可以是200 nm、210nm、220 nm、230 nm、240 nm、250 nm、260 nm、270 nm、280 nm、290 nm、300 nm、310 nm或320nm等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

优选地，所述液相色谱检测的检测波长为250-290 nm。

优选地，所述液相色谱检测的检测波长为270 nm。

上述特定波长选择能够进一步提高检测的准确度。

优选地，所述液相色谱检测的色谱柱为C8色谱柱。

优选地，所述液相色谱检测的洗脱程序为梯度洗脱，所述梯度洗脱的具体流程如下：

第0-10 min，流动相A的体积分数为100%，流动相B的体积分数为0；

第10-20 min，流动相A的体积分数由100%匀速变为50%，流动相B的体积分数由0匀速变为50%；

第25-45 min，流动相A的体积分数为50%，流动相B的体积分数为50%；

第45-47 min，流动相A的体积分数由50%匀速变为100%，流动相B的体积分数由50%匀速变为0；

第47-60 min，流动相A的体积分数为100%，流动相B的体积分数为0。

上述特定洗脱程序能够有效将各个有关物质进行区分，有效提高了检测的分离度。

另一方面，本发明还提供了如上所述的检测方法在去氧肾上腺素酮咯酸溶液质量控制中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法，其能够有效对去氧肾上腺素酮咯酸溶液中盐酸去氧肾上腺素和酮咯酸氨丁三醇的有关物质进行同时检测，分离度高，检测效果好；并同时通过先将不同溶剂溶液分别按比例配制混合好，再进行洗脱的方式，相比常规的直接采用两种不同流动相进行洗脱的方式能够有效提高检测的灵敏度，降低检出限；且通过选择特定波长范围和洗脱程序有效提高了检测的准确度和分离度。

附图说明

图1是实施例1提供的检测方法的液相结果图，其中峰1、3、8、9分别为PE-杂质A、PE-杂质C、PE-杂质D和PE-杂质E，峰2为盐酸去氧肾上腺素，峰13为酮咯酸氨丁三醇，其余峰按顺序分别为KE-A~KE-J。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

本实施例提供了一种去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法，具体步骤如下：

将去氧肾上腺素有关物质分别命名为PE-杂质A、PE-杂质C、PE-杂质D和PE-杂质E，结构按顺序分别如下：

。

将酮咯酸有关物质分别命名为KE-A~KE-J，结构按顺序分别如下：

。

将去氧肾上腺素酮咯酸溶液样品和以上14中有关物质对照品分别进样进行液相色谱分析，色谱条件如下：

色谱条件：

色谱柱：Agilent C8，5μm，4.6mm×250mm；

柱温：20℃；

流动相A：1.5 mg/mL 1-辛烷磺酸钠溶液（磷酸溶液调节pH值至3）-乙腈（体积比80:20）；

流动相B：1.5 mg/mL 1-辛烷磺酸钠溶液（磷酸溶液调节pH值至3）-乙腈（体积比50:50）；

检测波长：270 nm；

进样体积：10 μL；

流速：1.5 mL/min。

梯度条件洗脱程序如下：

表1

结果如图1所示，其中峰1、3、8、9分别为PE-杂质A、PE-杂质C、PE-杂质D和PE-杂质E，峰2为盐酸去氧肾上腺素，峰13为酮咯酸氨丁三醇，其余峰按顺序分别为KE-A~KE-J。

结合对照品计算得到各有关物质含量如下：

表2

实施例2

本实施例提供了一种去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法，具体步骤中除梯度洗脱程序如下外，其余与实施例1一致：

表3

实施例3

本实施例提供了一种去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法，具体步骤中除梯度洗脱程序如下外，其余与实施例1一致：

表4

实施例4

本实施例提供了一种去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法，具体步骤中除梯度洗脱程序如下外，其余与实施例1一致：

表5

实施例5

本实施例提供了一种去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法，具体步骤中除检测波长为250 nm外，其余与实施例1一致。

实施例6

本实施例提供了一种去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法，具体步骤中除检测波长为290 nm外，其余与实施例1一致。

实施例7

本实施例提供了一种去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法，具体步骤中除检测波长为215 nm外，其余与实施例1一致。

实施例8

本实施例提供了一种去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法，具体步骤中除检测波长为313 nm外，其余与实施例1一致。

实施例9

本实施例提供了一种去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法，具体步骤中，流动相A为1.5 mg/mL 1-辛烷磺酸钠溶液，流动相B为乙腈，梯度条件洗脱程序如下：

表6

除以上内容外，其余与实施例1一致。

对比例1

本对比例提供了一种去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法，具体步骤如下：

pH2.8缓冲溶液：称取辛烷磺酸钠一水合物3.25g，加1000mL水，搅拌30min，稀磷酸调节pH至2.8。

色谱柱：

规格：长度0.055 m，内径4.0mm；

固定相：封端处理的十八烷基键合硅胶色谱柱（粒径3μm）；

柱温：45℃。

流动相：

流动相A：乙腈:pH2.8缓冲溶液=10:90（V/V）；

流动相B：pH2.8缓冲溶液:乙腈=10:90（V/V）；

梯度洗脱程序：

表7

流速：1.5 mL/min。

检测器：紫外分光光度计，波长215 nm。

进样体积：10 μL。

对比例2

本对比例提供了一种去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法，具体步骤如下：

色谱柱：

规格：长为0.25m，内径为4.6mm；

固定相：C8（色谱级辛基硅基硅胶，5μm）；

柱温：40℃；

流动相：四氢呋喃：磷酸二氢铵缓冲溶液（称取5.75g磷酸二氢铵R，加900mL水溶解混匀，磷酸调pH至3.0，水稀释至1000mL）=30:70（V/V）。

流速：1.5 mL/min。

检测器：分光光度计，波长313 nm。

进样体积：10 μL。

等度洗脱。

效果测试：

配制标准溶液：

①精密称取PE-杂质A 10.35mg、PE-杂质C 10.44mg、PE-杂质D 10.27mg、PE-杂质E10.33mg，置于同一10mL量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，作为PE混合杂质定位母液。

②精密称取KE-A 10.77mg、KE-B 10.43mg、KE-C 10.58mg、KE-D 10.26mg、KE-E10.33mg、KE-F 10.64mg、KE-G 10.89mg、KE-H 10.74mg、KE-I 10.62mg、KE-J 10.19mg，置于同一50mL量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，作为KE混合杂质定位母液。

③另精密称取PE对照品和KE对照品各200mg，置于同一10mL量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，作为PE/KE储备液。

④精密量取PE混合杂质定位母液1mL、KE混合杂质定位母液1mL和PE/KE储备液5mL，置于同一10mL量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，作为待测标准溶液。

之后实施例1-9和对比例1-2提供的方法对上述标准溶液进行检测，汇总检测结果，如下：

表8

表9

之后对检出14种有关物质的实施例中的分离度和实施例1的检出限进行计算，结果如下：

表10

表11

并对其回收率进行测试：

表12

表13

从以上数据可以发现，本发明提供的检测方法能够对14种有关物质进行同时检测，检测效果好，同时通过控制检测波长、洗脱程序以及采用先将不同溶剂溶液分别按比例配制混合好、再进行洗脱的方式，有效提高了检测的分离度、灵敏度和准确度，降低了检出限；其中实施例1~4，回收率均在98%~102%之间；实施例5~6、9，回收率均在97%~103%之间；实施例7~8，个别杂质无法分离，其余杂质回收率97%~103%之间；对比例1，部分杂质无法分离，其余回收率95%~105%；对比例2，部分杂质无法分离，其余回收率95%~105%。

此外对实施例1提供的方法进行了精密度验证（六次重复），结果如下：

表14

实施例1中平行配置6份标准溶液，PE各杂质测得量RSD%均小于2%，KE各杂质测得量均小于5%，均满足要求（因为KE杂质含量较低，故RSD较高）。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的去氧肾上腺素酮咯酸溶液中有关物质的检测方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。